Name: כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של Neoformans קריפטוקוקוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: למדו פרוטוקול לדילול כולסטרול במקרופאגים ולהדבקתם ב-Cryptococcus neoformans. השיטה מאפשרת חקר תפקיד הכולסטרול בבליעת פתוגנים פטרייתיים ומנגנוני פאגוציטוזה בתאי מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH AI56168, AI71142, AI87541 וAI100631 לMDP. מאוריציו Del Poeta הוא בורוז Wellcome חוקר במחלות זיהומיות.

1. כולסטרול דלדול של תאי J774A.1 עם MβCD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, תאים כמו מקרופאג-10 5 J774A.1 זרע לכל גם על צלחת תרבית תאי 96-גם ב -200 μl של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מmonolayer התא ולשטוף את התאים פעמיים עם פוספט 1x שנאגרו (PBS) שסונן או autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון MβCD בריכוז הרצוי (10 מ&quot;מ או 30 מ&quot;מ בPBS) או 1x PBS כביקורת דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. הסר supernatant ובמילואים בRT לניתוח כמותי עם ערכה זמינה מסחרי ביצוע ההליך באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים פעמים עד שלוש פעמים עם 1x PBS או בסרום ללא DMEM ולהמשיך בתאי דלקת או lyse ידי pipetting פעמים עד שלוש פעמים עם H 2 O deionized לניתוח עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה או עם ערכה. הערה: בעקבות דלדול כולסטרול יכול לשמש ערכת כימות כולסטרול זמינה מסחרי. ראה סעיף חומרים לפרטים. עקוב אחר ההוראות של היצרן כפי שנכתב. </li></ol> 2. תצפית של כולסטרול תוכן על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טנק TLC פעמיים עם אצטון ופעם אחת עם פתרון של אתר נפט: אתר diethyl: חומצה אצטית (65: 30: 1 על ידי נפח). להרוות את המכל באתר הנפט: אתר diethyl: חומצה אצטית (65: 30: 1 על ידי נפח) פתרון ולהשאיר O / N. יש להשתמש תמיד ממסים אורגניים תחת מנדף כדי למנוע שאיפה של אדים: הערה. כפפות ומעייל מעבדה צריכים להיות משוחק בכל העת. חומצה אצטית היא חומצה חזקה ויש להשתמש בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 תאים כמו מקרופאג-6 J774A.1 לכל גם בce 6-גםצלחת תרבות ll בנפח של 5 מיליליטר של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן מקרופאגים של כולסטרול על ידי ביצוע צעדים 1.2-1.4, החלפת 1 מיליליטר ל -200 μl ישים כדי להסביר את הגודל גם הגדול יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של טריפסין-EDTA היטב כל אחד, דגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ובעדינות לגרד תאים עם מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר לתוך צינור microfuge ולהוסיף 500 μl נוסף של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים למשך 5 דקות ב XG 300 ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 500 μl נוסף של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S לתא גלולה וresuspend בקפידה על ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl של תאים ולספור תאים על hemocytometer. לנרמל את ריכוזי תא מכל מדגם ולהוסיף מספר שווה של תאים לצינורות זכוכית. הערה: בשלב זה, במאי אחדלבחור לשלב תאים מאותו קבוצות הטיפול לקבלת תמצית שומנים סופיות מרוכזת יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT ולהסיר תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של מתנול ומערבולת. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של כלורופורם ומערבולת. בדוק את מצב השלב לוודא הפתרון בmonophasic. הערה: ניתן לאחסן צינורות על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב RT ולהעביר את supernatant לצינור חדש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 מיליליטר נוסף של כלורופורם ואחריו 1 מיליליטר של DH 2 O. מערבולת פעמיים למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל שפופרת זכוכית על איזון עדין ולהשתמש בזכוכית פיפטה פסטר להעביר את השלב נמוך יותר לתוך צינור הזכוכית של משקל ידוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את שומנים במאייד צנטריפוגלי עד (כ 2 שעות) יבשות. שוקל צינור עם שומנים מיובשים ולחשב את משקל השומנים היבש. הערה: שומנים יבשים יכולה להיות מאוחסן ב-20 ° C עד מוכן לבצע TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל שומנים מיובשים בכלורופורם מספיק כדי לנרמל את הריכוז של שומנים בדם (בדרך כלל 20-50 μl) ועומס 20 μl של השומנים בדם המדולל על צלחת TLC סיליקה. עומס 20 מיקרוגרם של הכולסטרול בדילול מלא 20 μl של כלורופורם כסטנדרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף צלחת TLC מיובשת למכל הרווי TLC ולאפשר ממס להעביר עד 1 סנטימטר לפני קצה צלחת. הסר את צלחת TLC מהטנק ולאפשר לו להתייבש כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו שומנים על ידי הצבת בטנק אדי יוד כדי לבדוק הגירה. הסר ולאפשר כתמים לדעוך במשך כ 10 - 15 דקות מתחת למכסת המנוע. הערה: יוד הוא מפגע שאיפה. להשתמש תמיד מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מכתים שומנים ניטראליים על ידי שילוב של 60 מיליליטר של מתנול עם 60 מיליליטר של H 2 O deionized, 4 מיליליטר של חומצה גופרתית, ו 630 מ&quot;ג כלוריד מנגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט ובזהירות לטבול את צלחת TLC לפתרון מכתים שומנים הניטרלי במגש ולהסיר ללא השלת מעליה את l סיליקהאייר. הערה: הפתרון מכתים שומנים הניטרלי ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים וכך שניתן לשלוף אותו מהמגש והניח בחזרה בבקבוק לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחת לייבוש מתחת למכסת המנוע בRT עד שכל הבועות נעלמו. מחממים את צלחת TLC על סט גוש חום 160 מעלות צלזיוס וchar לצבע הרצוי. הערה: תכנית צפיפות כגון LS עבודות חזון יכולה לשמש כדי לכמת את הלהקות החרוכות כדי להשוות דגימות שומנים. </li></ol> 3. זיהום של המקרופאגים עם ג neoformans (H99) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 תאים דמויי מקרופאג 5 בכל טוב בצלחת תרבית תאי 96-גם ב -200 μl של DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N. הערה: זיהום יכול להיעשות גם בזכוכית תחתית מנות confocal הדמיה קלה יותר; כל הסכומים יישארו זהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות של ג neoformans (H99)על ידי inoculating 10 מיליליטר של YNB עם מושבה אחת שהתקבלה מצלחת פגעה ודוגר זה O / N ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולספור C. neoformans תאים (H99). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ג תרבות neoformans O / N ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת וזורקים. לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של 1x PBS. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולשטוף עם 5 מיליליטר של PBS 1x המסונן. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ו resuspend ב 5 מיליליטר של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דילול סדרתי בPBS להשיג דילול 1: 500 של התרבות שטפה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של המדגם המקורי 100 μl 900 μl של 1x PBS להשיג דילול 1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של 1:10 מדגם מדולל 100 μl 900 μl של 1x PBS להשיג דילול 1: 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 1: המדגם המדולל 100 עד 800 μl של 1x PBS להשיג 1: diluti 500ב </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של 1: 500 דילול ולסמוך על hemocytometer כדי לחשב את מספר התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד להפעלת מקרופאגים וopsonizing ג neoformans. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל LPS ו100x IFNγ מפתרונות מניות על ידי הוספת 10 μl 990 μl. הערה: LPS וIFNγ משמשים כדי לשפר את ספיגת phagocytic אך אינם נדרשים לphagocytosis. אם יש עניין בפעילות קוטלי פטריות של מקרופאגים, לבצע O ההפעלה / N על 37 מעלות צלזיוס עם רעד לפני ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימה לשלב 7.5 μl של LPS המדולל, 1.25 μl של IFNγ המדולל, 1.25 μl של נוגדן GXM והנפח של ג תרבות neoformans שנותנת 1.25 x 10 5 תאים. תביא נפח עד 250 μl מוכפל במספר הדגימות עם DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת דגירה פתרון למשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. הערה:כולסטרול דלדול (שלבים 1.2-1.4) יכולים להיעשות במקביל לצעד opsonization. הקפד לטפל מקרופאגים לפני שילוב הפתרון עובד, כצריכים בצורה אופטימלית לשמש תאי opsonized לא יותר מ -20 דקות הבאות הדגירה צעד 3.4.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרופאגים שטפו פעמיים עם הסרום ללא DMEM ולהוסיף 200 μl של ג opsonized neoformans עובד פתרון לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לתקן וכתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה ולשטוף תאים 2 פעמים עם DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש monolayer התא במשך 10 דקות ולהוסיף 200 μl של מתנול הקר כקרח כדי לתקן את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות ב RT ולהסיר כל מתנול שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 10x Giemsa ודגירה של 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 - 3 פעמים במים ללא יונים וO היבש / N עם פקק. הערה: הדמיה ניתן לעשות ביום שלמחרת או עד followi שבועצביעת ng. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו והרוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, לספור 300 תאים לכל נקודת נתונים (אם יש 2 של אותו הטיפול לספור 150 לכל טוב) ורשום את המספר של מקרופאגים הנגועים ומספר תאי קריפטוקוקוס נבלעו. הערה: כדי להבטיח אפילו דגימה לשימוש נקודת נתונים 2 צלחות לכל מצב, לבחור 3 אזורים שאינם חופפים לכל צלחת ולספור 50 תאים לכל אזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מדד phagocytic על ידי הכפלת השיעור של מקרופאגים הנגועים במספר הממוצע של ג neoformans למקרופאג. לנרמל מדד phagocytic בהבעת ערכים כאחוז מPBS 1x טופל שליטה. לאחר כמה ניסויים לחשב את הערך הממוצע וסטיית התקן של הממוצע כדי לקבוע מגמות במדד phagocytic. השתמש במבחן t תלמיד כדי לקבוע משמעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח micrographs של תאים ב1,000X או הגדלת 400X. </li></ol></li></ol> 4. Trypan הכחול Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 6 תאים כמו מקרופאג-לכל גם על צלחת תרבית תאי 6 גם בנפח של 5 מיליליטר של המדיום של Dulbecco המינימלי החיוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין . לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן מקרופאגים של כולסטרול על ידי ביצוע צעדים 1.2-1.4 החלפת 2 מיליליטר ב -200 μl ישים כדי להסביר את הגודל גם הגדול יותר. הערה: הקפד לכלול שליטה טופלה ב1x PBS, כמו גם שליטה שגרדה לפני כל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1x PBS היטב כל אחד ועדינות לגרד תאים עם מגרד תא. להעביר לתוך צינור microfuge ולהשעות את התאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl של תאים ואת הכתם עם 1 μl של 4% Trypan כחולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים על hemocytometer ולחשב את הכדאיות באמצעות המשוואה הבאה: כדאיות% = [1 - (תאים כחולים / תאים בסך הכל)]x 100. ערכים לנרמל לשליטה שהייתה שלא טופל. לאחר כמה ניסויים לחשב את הערך הממוצע וסטיית התקן כדי לקבוע מגמות בכדאיות. השתמש במבחן t תלמיד כדי לקבוע משמעות. </li></ol>

<ol><li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li>
<li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages%3A+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li>
<li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173(2012).</li>
<li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li>
<li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococci+At+The+Brain+Gate%3A+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li>
<li>Chrétien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li>
<li>Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li>
<li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Infection+And+Chemotherapy%3A+Official+Journal+Of+The+Japan+Society+Of+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>García-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+Me+If+You+Can%3A+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+And+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li>
<li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Pathology.+9%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li>
<li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+And+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).</li>
<li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22In+The+Pathogenesis+Of+Immune+Evasion+And+Clinical+Manifestations+Of+Falciparum+Malaria.+Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li>
<li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection%3A+Implications+In+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li>
<li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms%2C+And+Their+Role+In%5BTitle%5D)+AND+%22Alveolar+Macrophage+Infectivity.+Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li>
<li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li>
<li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+Of+Biochemistry+And+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li>
<li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous%5BTitle%5D)+AND+%22In+Serum+From+HIV%2B+And+HIV-+Individuals.+Clinical+And+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li>
<li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).</li>
<li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעבודה עם פרוטוקול זה חשוב להשיג ספירת תאים מדויקת כאשר ציפוי תאי יונקים וopsonizing ג תאי neoformans. זה ממזער וריאציה בין ניסויים ומבטיח 1 מדויק: יעד 1 יחס מפעיל לאורך כל תקופת המחקר. זה גם קריטי כדי לתאם את התזמון של דלדול הכולסטרול וזיהום כדי למנוע את תאי שמרי opsonized או תאים שטופלו מקרופאג מנח בRT בין הנהלים. תקופות ההמתנה ארוכות יכולות להוביל לאובדן של opsonization נוגדן או replenishing של כולסטרול מתרוקן לפני זיהום יכול להתחיל. אם ניסויים נעשים עם דיוק נ...

Phagocytosis הוא תהליך שבו גופים תאיים מופנמים על ידי תאי מארח. זהו נשק מרכזי בארסנל של מערכת החיסון להגן מפני פתוגנים, אך התהליך עשוי לעתים קרובות להיות חתר תחת ידי פתוגנים כדי לאפשר להפנמה ולהתפשט בכל הגוף 1. Phagocytosis מתווך על ידי מספר אירועי איתות שיביאו להתקשרות ובליעה באמצעות ארגון מחדש של שלד התא של התא המארח. phagocytes &#39;המקצועית&#39; מסוגל לזהות ולהיקשר לopsonins על פני השטח של הפולש לאותת להתקשרות והיווצרות lamellipodia, אשר לבלוע את הפתוגן ויוצר phagosome 2. בין phagocytes &quot;המקצועי&quot; שנקרא מקרופאגים. המקרופאגים הם תאים מאוד מיוחדים שיבצעו את התפקידים הגנתיים הכוללים לחפש וביטול גורמי מחלה גורמת, תיקון רקמות שנפגעו, ומתווך דלקת, רובאלה בתהליך של phagocytosis 1,2. neoformans קריפטוקוקוס הוא מינים של שמרים פתוגניים שגורם למחלה קשה הידועה בשם Cryptococcosis. נבגי קריפטוקוקוס הם נשאפים על ידי המארח ולגרום לדלקת ריאות שהיא בדרך כלל ללא תסמינים. הוא חשב כי החשיפה היא מאוד נפוצה; מדגם של 61 ילדים ממחל זיהומיות בילדי קליניקה במרכז בית החולים בברונקס-לבנון מצאה כי כל שהשתתפו בסקר היו אלה נוגדנים לglucuronoxylomannan פוליסכריד cryptococcal ומחקרים אחרים הראה שכיחות בשני וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגוע ומבוגרים נגועים 3, 4. מקרופאגים מכתשיים הם הקו הראשון של תגובה לדלקת ריאות וברוב המקרים בהצלחה ברור הפתוגן. עם זאת, אצל אנשים מדוכאי חיסון (חולים למשל, HIV ואיידס) השמרים הוא מסוגלים לשרוד בתוך מקרופאגים. באלהמקרים, מקרופאגים יכולים לשמש כנישה לשכפול של הפתוגן ועשויים להקל על הפצתו למערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו המחלה הופכת קטלנית 5-8. הוא חשב כי מקרופאגים אולי אפילו לספק את השמרים ישירות לתוך קרומי המוח, עוזרים השמרים לחצות את מחסום דם המוח באמצעות המודל &quot;סוס טרויאני&quot; 3,9 - 11. לפיכך, חשוב להבין את התהליך של phagocytosis וגורמים המשפיעים עליו, בעיקר בזיהומי cryptococcal. העבודה קודמת במערכות פתוגן אחרות מצביעה על רפסודות כולסטרול ושומנים בדם נוצרות על ידי כולסטרול כבעל תפקיד חשוב בphagocytosis 12 - 15. כולסטרול הוא מיני שומנים הנפוצים ביותר בתאי יונקים וכולל 25-50% מקרום התא היונקים 16. זה כבר נמצא לשחק תפקיד בויסות הביופסיהמאפייני hysical של ממברנות על ידי שינוי קשיחותם 17. כולסטרול וsphingolipids יחד יוצרים microdomains שומנים בתוך הקרום הידוע כרפסודות שומנים בדם. רפסודות שומנים בדם נמצאו להיות מעורבת בהיווצרות caveolae, כמו גם מתן תחום מבודד לסוגים מסוימים של איתות 16-18. בשל גודלם הקטן, שקשה ללמוד רפסודות שומנים בגוף חי. דרך שימושית אחד כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים היא לשנות בוחריהם. מתיל-β-cyclodextrin (MβCD) היא תרכובת שנמצאה לרוקן את הכולסטרול מקרומי יונקים ומשמש בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים 18. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לרוקן את הכולסטרול מקרום תא מארח ולכמת את ההשפעה של הדלדול ביכולתם של תאי המארח לphagocytose ג neoformans במבחנה. הליך זה עושה שימוש בתרבית תאי techniques על מקרופאג הונצח כמו שורת תאים (J774A.1) כמודל לזיהום. כולסטרול דלדול הושג על ידי חשיפה לMβCD, שבו יש ליבה הידרופובי ספציפית לגודל של סטרולים והוא מסוגל לפעול ככיור לכולסטרול לצייר מתוך הקרום 19. כולסטרול דלדול נמדד כמותית באמצעות ערכה זמינה מסחרי ואיכותי באמצעות שאיבת שומנים בליי-דייר שונה ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) 20. . Phagocytosis נמדד על ידי הדבקה של תא הקו עם תרבות של שמרי opsonized מעורבבים עם קוקטייל של אינטרפרון-γ וlipopolysaccharide להפעלת מקרופאגים קריפטוקוקוס היה opsonized באמצעות נוגדן glucuronoxylomannan (GXM) 21 - 23. מכתים וניסויים במיקרוסקופ אפשרו להדמיה של התאים וחישוב מדד phagocytic להעריך את מידת הרס עצמי. יחדיו, ד פרוטוקול זהescribes שיטה בסיסית, המשלבת את שינוי הרכב שומנים בדם עם תהליך פיסיולוגי.

<table><tbody><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית מסוג A2 Class II</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>מגיע קפוא. ראה הוראות ATCC לתרבות.</td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>חנות ב -4 מעלות; C ולחמם ל -37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>יש לשמור קפוא בטמפרטורה של -20 מעלות; C והפשרה לפני הוספה ל-DMEM</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>משמש לתמיכה</td></tr><tr><td>בחממת תרבית תאים DMEM Isotemp</td><td>פישר מודל מדעי</td><td></td><td># 3530</td></tr><tr><td>צלחת תרבית 96-באר</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x פוספט חוצץ</td><td>מלח פישר ביו-ריאגנטים מדעיים</td><td>BP3994</td><td>יש לדלל ל-1x ולסנן או לבצע חיטוי לפני השימוש.</td></tr><tr><td>מתיל-ובטא;-ציקלודקסטרין</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>C4555-10G</td><td>מתמוסס ב-1x PBS ליצירת תמיסות בריכוזים של 10 מ"מ ו-30 מ"מ</td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex ערכת בדיקת כולסטרול אדום Life</td><td>Technologies בדיקות מולקולריות</td><td>A12216</td><td>כל הריאגנטים לבדיקת כולסטרול כלולים בערכה. עקוב אחר הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>96-Well שחור צלחת</td><td>בדיקה קורנינג בע"מ Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax קורא מיקרופלייט</td> מכשירים <td></td><td>מולקולריים</td><td>דגם F5</td></tr><tr><td>תא TLC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC נייר</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>צמצם לגודל הדרוש למכסה</td>אדים</tr><tr><td></td><td></td><td></td> של טנק TLC <td>כל מכסה אדים העומד בתקני AIHA / ANSI</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג בע"מ Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>קורנינג בע"מ קוסטאר</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>האוסר סיינטיפיק</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>דגם אלגרה x-30R</td></tr><tr><td>מיקסר Votex</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>איזון</td><td>מטלר טולדו</td><td></td><td>דגם # MS104S מורס עד 0.1 מ"ג</td></tr><tr><td>זכוכית פסטר</td><td>פיפטה פישרברנד</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>אוונטי שומנים קוטביים</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>רכז SpeedVac</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td>מודל # SPD2010</td></tr><tr><td>אתר נפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>אתר דיאתיל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC סיליקה ג'ל 60 עם אזור ריכוז</td><td>כרומטוגרהי אנליטי Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>שבבי יוד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>מנגן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 מערכת הדמיה</td><td>מוצרי אולטרה סגול בע"מ</td><td></td><td>השתמש בתוכנת Vision Works LS לניתוח צפיפות</td></tr><tr><td>צלחת קונפוקלית תחתית זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>מתקבל מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>ראה יצרן להוראות הכנה. יש להשתמש בריכוז גלוקוז של 20 גרם/ליטר.</td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>יש להמיס ב-1x PBS כדי ליצור ציר של 1 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>אינטרפרון גמא</td><td>סיגמא</td><td>I4777</td><td>מתמוסס ב-1x PBS ליצירת תמיסת מלאי של 0.1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן גלוקורונוקסילומנן (אנטי-GXM)</td><td></td><td></td><td>מתנה מהמעבדה של ארטורו קסדוואל ריכוז הוא 1.98 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>ממיסים 0.8 גרם של Giemsa ב-25 מ"ל גליצרול ומחממים ל-60 מעלות; C למשך שעה. מוסיפים לתמיסה 25 מ"ל מתנול ומניחים להתיישן בטמפרטורת החדר למשך חודש לפחות.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 מיקרוסקופ עם AxioCam MRm לצילום תמונות</td></tr></tbody></table>

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; neoformans קריפטוקוקוס</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis הוא זיהום מסכן חיים הנגרם על ידי פטריות פתוגניים של הסוג קריפטוקוקוס. זיהום מתרחש על שאיפה של נבגים, אשר מסוגלים לשכפל בריאה העמוקה. Phagocytosis של קריפטוקוקוס על ידי מקרופאגים הוא אחת הדרכים שהמחלה יכולה להתפשט למערכת העצבים המרכזית לגרום meningoencephalitis הקטלני. לכן, מחקר של הקשר בין קריפטוקוקוס ומקרופגים הוא חשוב להבנת ההתפתחות של הזיהום. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול צעד-אחר-צעד כדי ללמוד infectivity מקרופאג ידי ג neoformans במבחנה. השימוש בפרוטוקול זה, התפקיד של סטרולים מארח על אינטראקציות מארח הפתוגן הוא למד. ריכוזים שונים של מתיל - cyclodextrin (MCD) שמשו לרוקן את הכולסטרול מJ774A.1 שורת תאים העכברי סרקומה הרשתית כמו מקרופאג. כולסטרול הדלדול אושר ולכמת באמצעות שני מסחרי availablערכת דואר כימות כולסטרול וכרומטוגרפיה בשכבה דקה. תאי כולסטרול מדולדל הופעלו באמצעות Lipopolysacharide (LPS) ואינטרפרון גאמא (IFNγ) ונגועים בneoformans קריפטוקוקוס-opsonized נוגדן תאי H99 wild-type ביחס מפעיל ליעד של 1: 1. תאים נגועים היו במעקב אחרי 2 שעות של דגירה עם ג neoformans ומדד phagocytic חושב. כולסטרול דלדול הביא לירידה משמעותית במדד phagocytic. הפרוטוקולים שהוצגו מציעים שיטה נוחה לחקות את תחילת תהליך הזיהום בסביבת מעבדה וללמוד את התפקיד של הרכב שומנים מארח על infectivity.

כולסטרול דלדול ניתוח של supernatant שמורות בשלב 1.3 של הפרוטוקול על ידי ביצוע הוראות היצרן בערכת הכולסטרול Assay Amplex האדומה מניב ריכוז גבוה של כולסטרול במדגם MβCD טופל בהשוואה לשליטת 1x PBS. בהתאם לסוג תא ודלדול כולסטרול ריכוז MβCD משמש עשוי להשתנות. לJ774 טופל עם 10 מ&quot;מ MβCD, דלדול של כ 50% נצפה. דלדול יכול להיות מחושב באמצעות ערכים המתקבלים מlysate supernatant והתא שנאסף בשלב 1.4 (איור 1)....

במאמר זה מתואר פרוטוקול להדבקה של מקרופאגים ב-Cryptococcus neoformans. כמו כן, מוסברת שיטה לדלדול סטרול מהמקרופאגים. פרוטוקולים אלה מספקים מדריך לחקר זיהומים פטרייתיים במבחנה ולבחינת תפקידם של סטרולים בזיהומים כאלה.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להגדיר תפקיד לפחמידים (כולסטרול) בספיגה של cryptococcus neoformans על ידי מקפגים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי דילול כולסטרול משורת תאי מקפגים עכבריים באמצעות methyl beta cyclodextrin. לאחר מכן, דילול הכולסטרול מאומת ונמדד באמצעות כרומטוגרפיה על שכבה דקה וערכה מסחרית זמינה.לאחר מכן, תאי *Cryptococcus neoformans* עוברים אופסוניזציה באמצעות נוגדנים ספציפיים ל-gluc, xlo manin או לרכיב ה-GXMA של קפסולת ה-*Cryptococcus*. לבסוף, מקרופאגים מרוקנים כולסטרול מודבקים בתאי *Cryptococcus neoformans* שעברו אופסוניזציה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובמיקרוסקופיה של אור כדי להדמיות את התאים המודבקים ולאפשר חישוב של מידת הפגוציטוזה.היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לבצעה באמצעות ציוד מעבדה בסיסי בפרק זמן קצר יחסית, ועדיין להשיג תוצאות כמותיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הפתוגנזה הפטרייתית. לדוגמה, מהו תפקידם של השתבחות שומנים של המארח באופטיקה של פתוגנים פטרייתיים?השלכות של טכניקה זו חולשות לעבר הטיפול או הניסוי של זיהומים של Occus מכיוון שההפנמה בתוך מקרופאגים היא שלב קריטי להיווצרות סיבתיות קריטית. למרות ששיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי היכולת ההדבקתית של פתוגנים פטרייתיים, ניתן ליישם אותן גם על אורגניזמים אחרים, כגון פתוגנים תוך-תאיים אובליגטוריים. בתוך קבינת בטיחות ביולוגית סטרילית, זרע 10⁵ תאים דמויי מקרופאג J 7 74 A לכל באער בלוח תרבית בעל 96 באערים. ב-200 µL של DMEM מועשר ב-10% FBS ו-1% פניצילין סטריפטומייצין או PS, דגרו למשך לילה ב-37 °C וב-5% CO2 למחרת.הסיר את המצע משכבת התאים החד-שכבתיים והשתמש ב-PBS מסונן או שעבר אוטוקלאב כדי לשטוף את התאים פעמיים. הוסף 200 µL של תמיסת methyl beta cyclodextrin או embeta CD בריכוז הרצוי, או XPBS אחד כביקורת, והדגר למשך 30 דקות ב-37 °C עם ניעור. הסר את העלילית ושמור אותה בטמפרטורת החדר לצורך ניתוח כמותי באמצעות קיט מסחרי זמין.מיד לאחר הליך זה עם PBS או DMEM ללא סרום, שטפו את התאים שתיים עד שלוש פעמים לפני ביצוע כימות כולסטרול או המשכה להדבקה. שלב להדבקת המקרופאגים המרוששים כולסטרול בתוך תא בטיחות ביולוגית סטרילי. זרעו 10⁵ תאים דמויי מקרופאגים לכל באר.בפלטה בעלת 96 בארות, דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 בו זמנית. גדלו תרבית של C neoformans H 99 על ידי בידוד מושבה אחת מפלטה שרוקדה והחדרה ל-10 milliliters של YNB; דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור. למחרת, סובבו במ Центריפוגה את תרבית ה-C neoformans במהירות של 1,700 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.הסיר את העל-נוזל והוסף חמישה מיליליטר של 1XPBS לפני צנטריפוגה חוזרת. לאחר מכן, השתמש ב-1XPBS מסונן כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים נוספות, לפני השהיה מחדש של התאים בחמישה מיליליטר של 1XPBS. בשלב הבא, כדי להכין דילול סדרתי של התרבית השטופה, הוסף 100 µL מהדגימה המקורית ל-900 µL של 1XPBS.כדי להשיג דילול של 1:10, הוסיפו 100 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת ביחס של 1:10 ל-900 מיקרוליטר של 1x PBS כדי להשיג דילול של 1:100. ולבסוף, הוסיפו 200 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת ביחס של 1:100 ל-800 מיקרוליטר של 1x PBS. כדי להשיג דילול של 1:500, הוסיפו 10 מיקרוליטר מהדילול הסופי להמוציטומטר (hemocytometer) וספרו כדי לחשב את מספר התאים. להכנת תמיסת עבודה להפעלת מקרופאגים ואופסוניזציה של *C. neoformans*, דללו LPS ואינטרפרון גמא פי 100 מתמיסות המקור על ידי דילול של 10 מיקרוליטר מכל תרכובת ב-990 מיקרוליטר של PBS. עבור כל דגימה, ערבבו 7.5 מיקרוליטר של LPS, 1.25 מיקרוליטר של אינטרפרון גמא, 1.25 מיקרוליטר של נוגדן GXM ו-1.25 כפול $10^5$.ראו תאי neo forman ולאחר מכן, באמצעות DMEM מועשר ב-FBS ו-Ps, הגדילו את הנפח ל-250 microliters לדגימה. ערבבו את התמיסה ב-Vortex והדגרימו למשך 20 דקות ב-37 degrees Celsius תוך써 ניעור לפני הדבקת המקרופאגים; ניתן לבצע דילול כולסטרול לאחר דילול הכולסטרול. השתמשו ב-DMEM נטול סרום כדי לשטוף אותם פעמיים לפני הוספת 200 microliters של תמיסת עבודה של C neoformans אופסוניז된 לכל אחת.הדגירה תתבצע למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, ייבוצעו קיבוע וצביעה של התאים. לאחר שטיפת התאים פעמיים באמצעות DMEM וייבוש התאים באוויר של שכבת התאים (monolayer) למשך 10 דקות, הוסף 200 µL של מيثנול קר מהמקרר לקיבוע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, לפני הסרת שאריות המيثנול.בשלב הבא, הוסיפו 200 µL של 10 x giza והדגיתו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו פעמיים או שלוש באמצעות מים דה-יוניים, השאירו את המכסה פתוח והניחו לייבוש למשך לילה, למחרת או עד שבוע לאחר מכן תחת מיקרוסקופ. ספרו 300 תאים עבור כל נקודת נתונים ורשמו את מספר המקרופאגים המזוהים כנגועים ואת מספר תאי ה-Cryptococcus שנבלעו.חשבו את האינדקס החומצי של PHA על ידי הכפלת אחוז המקרופאגים המודבקים במספר הממוצע של C neoformans למקרופאג. נרמלו את האינדקס החומצי של F על ידי ביטוי הערכים כאחוז מהביקורת שטופלה ב-XPBS. לאחר מספר ניסויים, חשבו את ערך הממוצע ואת סטיית התקן של הממוצע כדי לקבוע מגמות באינדקס החומצי של F.השתמשו במבחן t של סטודנט (student's T-test) כדי לקבוע מובהקות כפי שמוצג כאן. ניתוח של העליון (supernatant) שנשמר מתאיםים שטופלו ב-m$\beta$-CD גילה רמות כולסטרול גבוהות יותר בהשוואה לעליון שבודד מתאי ביקורת ב-PBS, מה שמעיד על רמה גבוהה יותר של דלדול כולסטרול בתאים שטופלו ב-m$\beta$-CD. ניתן לחשב את הדלדול באמצעות ערכי כולסטרול שהתקבלו מהעליון ומליסאט התאים, כפי שמוצג כאן, כדי לתמוך בתוצאות דלדול הכולסטרול.ניתוח של ליזאט תאים באמצעות TLC מראה ירידה ניכרת בצביעת כולסטרול בתאים שטופלו בריכוזים עולים של M beta CD cytometry. ניתוח ה-TLC מראה מגמה דומה לבדיקה הכמותית; בעקבות ההדבקה, התאים נשארים דבקים ושלמים, ומורפולוגיית התאים ב-seen neoformans נשארת ללא שינוי בהשוואה לתאי ביקורת שלא טופלו. מיקרוגרפים של תאים שהודבקו באופן אופטימלי מראים בבירור את c neoformans נבלע בתוך התאים היונקיים.גרף זה מדגים כי כאשר החישוב התבסס על 300 תאי מקרופאג לכל קבוצת טיפול, נמצאה הפחתה במדד ה-F acidic בתאים שהוזלו כולסטרול. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בערך בחמישה שעות. זמן זה אינו כולל את זמני האינקובציה שחייבים להתבצע במהלך הלילה בעקבות הטיפול. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיצוי ממברנות עמידות לדטרגנטים מהמקרופאגים, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם הזללת כולסטרול מפחיתה את העמידה של cryptococcus באמצעות השפעה על גרפטים של ליפידים במארח לאחר פיתוחם.טכניקות אלו סוללות את הדרך עבור חוקרים בתחומי ביולוגיה של ממברנות ואימונולוגיה להבין את מנגנוני הפגוציטוזה על ידי מקרופאגים ואינטראקציות של פתוגנים בפטריות פתוגניות. יש לזכור כי עבודה עם פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה...

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת ציטוטוקסיות כדי להעריך Cryptococcus neoformans, פטרייה פתוגנית, זיהום במקרופאגים. ציטוטוקסיות נקבעת על ידי שחרור של אנזים cytoplasmic lactate dehydrogenase עקב ליזה מקרופאג הנגרמת על ידי זיהום Cryptococcus neoformans.

בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז לזיהוי זיהום Cryptococcus neoformans במקרופאגים

סרטון זה מציג שיטה להערכת ההשפעה של אספירין ואיבופרופן, בריכוזים המעכבים המינימליים שלהם, על מקרופאגים פגוציטוזה באמצעות תאים פטרייתיים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי רגישים ל- pH. התרופות מעכבות ציקלואוקסיגנאז-2, מפחיתות את היווצרות הפרוסטגלנדינים ומגבירות את הפאגוציטוזה של המקרופאגים, כפי שנצפה באמצעות מדידות פלואורסצנטיות של צבע רגיש ל- pH.

השפעת אספירין ואיבופרופן על היכולת הפאגוציטית של מקרופאגים

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי...

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

אנו מתארים כיצד לחזות ג macrophage- neoformans (CN) אינטראקציות בזמן אמת, עם דגש ספציפי על התהליך של exocytosis לא אלים באמצעות מיקרוסקופ אור דיגיטלית. שימוש בטכניקה זו באופן אינדיבידואלי מקרופאגים נגועים ניתן ללמוד לברר היבטים שונים של תופעה זו.

חזותי exocytosis ללא ממס של Neoformans קריפטוקוקוס מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). הפרוטוקול משתמש בשימור בהקפאה של מונוציטים יחד עם התמיינות בתפזורת שלהם למקרופאגים. לאחר מכן ניתן לזרוע מקרופאגים שנקטפו לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

אנו מתארים שיטה למדידת מהירות הפגוזומים הנעים לעבר מרכז התא בתאים חיים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) מסוג 1 או בלעדיו, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של דיסק מסתובב לזיהוי תאים נגועים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופ שדה בהיר לזיהוי פגוזומים.

הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1

ליפידים ידועים לשחק תפקיד חשוב פונקציות הסלולר. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לקבוע את הרכב השומנים של נויטרופילים, עם דגש על רמת הכולסטרול, על ידי שימוש בשני HPTLC ו HPLC כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים של היווצרות מלכודת תאי נויטרופילים.

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

מוצג כאן פרוטוקול לכמת ולייצר תמונות דינמיות של תאי גזע מזנכימליים (MSC) רגולציה מתווכת של מקרופאגים (MΦ) פאגוציטוזיס של חלקיקי שמרים לא אוסונים (זימוסן) המצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH.

ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה

למדו פרוטוקול לדילול כולסטרול במקרופאגים ולהדבקתם ב-Cryptococcus neoformans. השיטה מאפשרת חקר תפקיד הכולסטרול בבליעת פתוגנים פטרייתיים ומנגנוני פאגוציטוזה בתאי מערכת החיסון.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של

גלה סרטונים נוספים