Mass כמותי spectrometric פרופיל של Proteomes סרטן התאים נגזרים מנוזלים וגידולים מוצקים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבהיר את פרופילי ביטוי החלבון של גידולים נוזליים ומוצקים. זה מושג על ידי העשרת תאים סרטניים מדגימות דם או רקמות שמקורן בחולה. בשלב השני, חלבונים מבודדים מתאי הסרטן ולאחר מכן מעורבבים עם תקן כימות סוסאק ספציפי לגידול.

בשלב האחרון, תערובת החלבון מתעכלת. בסופו של דבר, ספקטרומטריית מסה משמשת להצגת פרופילי ביטוי החלבון מגידולים נוזליים ומוצקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האונקולוגיה והפתולוגיה, כגון כיצד ניתן לזהות מטרות תרופות ומנגנונים של עמידות לטיפול?

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גילוי סמנים ביולוגיים, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון חקירת סרטן מגוון, מוצק ונוזלי. מדגימים את ההליך המכון לפתולוגיה של ד"ר חניבעל ברגר וד"ר כריסטוף לנץ מהמעבדה שלי כדי להכין תאי גידול נוזליים למיון פלואורסצנטי על ידי ציטומטריית זרימה, התחל בכך שעלי ציטט מיליליטר אחד של דגימת התא החד-גרעיני האנושי המושעה ב-PBS בתוספת 2% FBS לבקרה השלילית, ומיליליטר אחד לכל צבע פלואורסצנטי המשמש בצבע הסופי. לאחר מכן, דגרו על התאים עם הנוגדנים המתאימים לבידוד אוכלוסיית התאים הלוקמיים ולבקרות הפיצוי על הקרח.

לאחר 30 דקות יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS בתוספת 2% FCS. לאחר מכן הוסף כתם כדאיות תא לצינורות המתאימים ומיין את התאים לפי הסכמה. איסוף הדגימות ב-IMDM בתוספת 10% FCS לאיסוף גידולים מוצקים על ידי לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה.

ראשית, השתמש במיקרוטום כדי לחתוך חלקים בעובי של חמישה עד 10 מיקרומטר מדגימות משובצות פרפין קבועות פורמין. לאחר מכן, הרכיבו את החלקים על שקופיות ממברנה מכוסות בסרט וייבשו את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס לאחר שעה. יש לחלק ולהחזיר לחות לחלקים על ידי דגירה רצופה של דקה אחת בקסילן אתנול מוחלט, 70% אתנול ומים.

ואז מכתימים את החלקים בהמטין למשך 20 שניות. שטפו אותם במי ברז ואספו את התאים המעניינים עם מערכת המיקרו-דיסקציה ללכידת לייזר כדי לחלץ חלבון מתאי הגידול הנוזליים הממוינים. סובב את הדגימה שלוש פעמים, ושטוף את התאים ב-500 מיקרוליטר של PBS קר במהלך שתי הצנטריפוגות השנייה.

לאחר מכן, דגרו את התאים ב-40 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל אחד כפול 10 לששת התאים. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה של הליזאט והעבירו את הליזאט השקוף המכיל סופרנטנט לצינור תגובה חדש כדי לחלץ חלבון מתאי הגידול המוצקים שנותחו במיקרו. דגרו את דגימת הרקמה עם 60 מיקרוליטר של מאגר ליזיס רקמות ב-72 מעלות צלזיוס.

לאחר 15 דקות, אספו את הנוזל על ידי צנטריפוגה קצרה והעבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה חדש. לאחר מכן סוניקציה של הליזאט על קרח למשך שלוש דקות, ולאחר מכן דגירה עם 15 מיקרוליטר שיש להם 20% נתרן ESAL סולפט ב-99 מעלות צלזיוס בבלוק חימום עם 600 סל"ד של תסיסה. לאחר שעה, סובב את הליזאט והעביר את ה-S natin לצינור חדש.

לאחר מכן, קבע את ריכוזי החלבון של תקן הסלולרי הנקי ותקן הסופר SLAC, ולאחר מכן ערבב כמויות שוות של חלקי תאי הגידול עם תקן סופר SLAC, ואחריו ליתיום. יש להתפיל מאגר גופרתי ב-25% מנפח הדגימה וחומר הפחתה ב-10% מנפח הדגימה. לאחר מכן מחממים את התמיסה המתקבלת בגוש חימום למשך 10 דקות בחום של 72 מעלות צלזיוס.

כדי למדוד את ריכוז החלבון של ליזאט הגידול המוצק על קורא צלחות, מערבבים סדרת תמיסות דילול אלבומין סטנדרטית בסרום בקר, הליזאט ותקן הסופר SLAC המתאים עם בדיקת חלבון זמינה מסחרית וצלחת 96 בארות. לאחר דקה אחת של טלטול, דגרו את הדגימה לפרק הזמן המתאים ומדדו את הספיגה כפי שצוין על ידי היצרן. לאחר מכן מערבבים כמויות שוות של ליזאט מובהר ותקן סופר SLAC עם 200 מיקרוליטר אוריאה ביחידת סינון וצנטריפוגה של הדגימות למשך 30 דקות.

לנתח את הליזאטים של תאי הגידול על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ואנליזה ספקטרומטרית מסה. התחל בפתרון הפפטידים המעניינים ב-30 מיקרוליטר של מאגר טעינה למשך חמש דקות באמבט סוניקציה. לאחר מכן סובב את החלבון והעביר את הסופרנטנט השקוף לבקבוקון דגימה אוטומטי ספקטרומטרי מסה.

לאחר מכן, הזרקו חמישה מיקרוליטר של דגימה לכל אנליזה לתוך מערכת הננו lc, ms MS autos, דגימה, ותרכזו ותפלחו את הפפטידים באופן מקוון במערך עמודה מותקן ומאוורר בשלב C 18 הפוך. לבסוף, הפרד את הפפטידים על עמודת מיקרו שלב C 18 הפוכה בעמודת ריסוס ננו בקצב עצמי. שימוש בשיפוע של 90 דקות של 5 עד 35% אצטיל ניטריל לעומת 0.1% חומצה פורמית מימית ב-300 ננוליטר לדקה, ואז השתמש במקור יונים של ננו ריסוס כדי להעביר ולנתח את הפפטידים.

באמצעות שיטת רכישה תלויה בנתונים של 15 המובילים, ניתן להשתמש בסוגים שונים של ספקטרומטרי מסה לניתוח הפפטידים. פרופיל פרוטאומי של גידולים נוזליים ומוצקים מחולים הוא גישה מבטיחה לגילוי סמנים ביולוגיים אבחנתיים וחיזוי חדשים. לדוגמה, איור ראשון זה מדגים אסטרטגיית שער מופתית לבידוד כתמי CD 17, תאים לוקמיים מדגימת גידול נוזלית.

ואילו כאן, קטע בעובי של חמישה עד 10 מיקרומטר המותקן על שקופיות ממברנה מכוסה בסרט כפי שהודגם זה עתה. כפי שהוצג אזור עניין נבחר לאחר מכן באופן ידני ונכרת על ידי מיקרו דיסקציה של לכידת לייזר, לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח אשכולות ללא פיקוח של פרופילי ביטוי החלבון של דגימות גידול נוזליות ומוצקות על ידי ספקטרומטריית מסה, המאפשרת הפרדה ברורה של ישויות הגידול השונות בהתאם לפרופילי ביטוי החלבון הייחודיים שלהן. נתונים אלה עשויים בסופו של דבר לתרום לביסוס סמנים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה קלינית.

יישום אסטרטגיות העשרה לשינויים לאחר תרגום כגון זרחון או אוורור UIC יכול להתבצע גם כדי לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד ניתן לזהות דפוסי קינאז לא מווסתים לאחר פיתוחו? טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפתולוגיה והאונקולוגיה לחקור את הסמנים הביולוגיים ומסלולי האיתות הספציפיים במגוון ישויות סרטניות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד חלבונים מסרטן כתת-אוכלוסיות לניתוח דפוסי ביטוי החלבון ומצבי האיתות שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה.