פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

המטרה הכוללת של האסטרטגיה היא לייצר טיפול יעיל דמוי תרופה של מולקולות קטנות באמצעות המרה של מעכב פפטיד של אינטראקציה של חלבון חלבון. זה מושג על ידי יצירת קשר פעילות מבנה לאינטראקציה הרצויה של חלבון פפטיד כדי להבין אילו חלקים ניתן להחליף ביעילות כשלב שני. כימיה חישובית משמשת לזיהוי חלופות מקטעים ברות קיימא עבור קובעי הפפטיד הידועים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהן כדי לסנתז ספרייה של הכלאות פפטיד מקטעים.

לאחר מכן, ספרייה של הכלאות מסונתזת בין המקטעים הללו לבין הפפטיד הקטום על מנת ליצור מולקולות שניתן לבדוק בבדיקה חוץ גופית כדי לזהות מולקולות שהן יותר דומות לתרופות ואשר מסכמות את הפעילות של הפפטיד המקומי. התוצאות מראות שניתן לזהות תרכובות דמויות תרופות נוספות באמצעות המתודולוגיה, ואלה מייצגות נקודות התחלה יעילות לגילוי תרופות של מעכבי אינטראקציות חלבון חלבון. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו סינון תפוקה גבוהה הוא שמתיחת חלבון חלבון מאתגרת ביותר מנקודת מבט של גילוי תרופות, ושיטות קונבנציונליות אינן עובדות היטב.

אסטרטגיית ההחלפה כוללת את הגישה האיטרטיבית המדורגת ולכן עשויה להימשך זמן רב יותר או סביר יותר שתהיה יעילה בטווח הארוך. היום אדגים את רוב ההליכים בעצמי עם קצת עזרה מהשותפה שלי, ד"ר סנדרה קרייג, שתגדיר חלק מהתגובות וההליכים. התחל הליך זה עם אימות של פרוטוקול העגינה, ואחריו הכנת אתר קשירת הקולטן והליגנדים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לעגן את הליגנדים לתוך חריץ הציקלין.

ראשית, בחר את שגרת התאמת הליגנד מפרוטוקול האינטראקציות של ליגנד הקולטן שהוגדר לתוכנה, השתמש בקולטן ובליגנדים המוכנים כקלט לפרוטוקול זה. עבור ריצות אלה, בחר PLP אחד כרשת האנרגיה. רשת האנרגיה המשמשת את תוכנית העגינה היא שדה הכוח ליצירת אינטראקציות קולטני ליגנד ותנוחות פוטנציאליות.

Plp הראשון הוא פוטנציאל ליניארי חכם בשלום, אשר נותן עדיפות ספציפית לאינטראקציות קשרי מימן. ציין כי התנוחות יהיו ממוזערות באנרגיה ומספר התנוחות שנוצרו הוא 10. השאר את כל הפרמטרים האחרים בערכי ברירת המחדל בשלב הראשון.

הצג תנוחות בתוכנית הוויזואליזציה ולאחר מכן מיין לפי ערכים יורדים של ציון PLP אחד. השתמש בפונקציות ניקוד כגון plp, אחת כדי להעריך את הזיקה המחייבת של ליגנד מעוגן על סמך תנוחת ליגנד מועמד, גיאומטריה ואינטראקציה לא קוולנטית עם מבנה קולטן המטרה. נתח ויזואלית את 25% העליונים של התנוחות שקיבלו ניקוד לסופר בלתי אפשרי עם קבוצת המכסה הידועה.

שימו לב גם אם התנוחה מילאה מסנני אינטראקציה, המוגדרים לכלול מעצורים אטומיים הדורשים מגעים בין-מולקולריים הידועים כקריטיים לקשירה או נדרשים למקם את קבוצת המכסה הפוטנציאלית בגיאומטריה הנכונה להיווצרות קשרי אמיד. לבסוף, בחנו תנוחות להשלמה חזותית, המוגדרת כמילוי יעיל של כיס הכריכה באופן התואם את פעילות המבנה הידועה. קשרים לסינתזה של קבוצות מכסת קצה, משתמשים בכל חומרי המוצא המסחריים, הממיסים והריאגנטים ומסנתזים על ידי כימיה אורגנית סינתטית קונבנציונלית.

בצע כרומטוגרפיה בשכבה דקה או TLC על סיליקה ג'ל לניטור תגובות על ידי המסה תחילה של חומר המוצא ותערובת התגובה בשלב הנייד. לאחר מכן זהה את חומר המוצא המומס ותערובת התגובה על צלחת TLC באמצעות צינורות נימיים. הנח את לוחית ה-TLC בתא המכיל את השלב הנייד.

ברגע שהשלב הנייד מגיע ל-90% מלוח ה-TLC, הסר וייבש את הצלחת באוויר. השתמש באור UV כדי לזהות את חומר המוצא ותערובות התגובה כנקודות גלויות. לאחר מכן חשב את ה-RF של כל נקודה, שהוא היחס בין המרחק שעבר הנקודה לשלב הנייד.

לאחר מכן, הניחו את תערובת התגובה במשפך מפריד ושטפו אותה בחומצה מימית או בתמיסת בסיס לפי הצורך. אוספים את הממס האורגני ומאדים אותו במאייד סיבובי לפני הייבוש. המוצר הגולמי המתקבל בוואקום ממיס 500 מיליגרם של מוצר גולמי בשלושה עד חמישה מיליליטר של ממס מתאים והוסיף לדגימת סיליקה או RP 18 לפני הייבוש באוויר, הניח דגימה המכילה את המוצר הגולמי בסיליקה, מחסניות הצמד פאזה הפוכה.

טהר את החומר הגולמי באמצעות כרומטוגרפיית פלאש אוטומטית בעלת ביצועים גבוהים. שימוש בעמודת הצמדה של 100 גרם עם שיפוע. הפעל מעל 15 נפחי עמודות.

יבש את המוצר המטוהר שנאסף בממס מכרומטוגרפיית הבזק באמצעות מאייד סיבובי על ידי אידוי כל הממס ליובש. לאחר מכן יבש את המוצר עוד יותר תחת ואקום כדי להסיר את כל הממיסים הנותרים. בצע אפיון של המוצר המטוהר על ידי NMR MS ו-HPLC אנליטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לסנתז שבר עם מכסה קצה, פפטידים מעכבים קשורים או הרכבה.

סוף תרכובות פפטיות באמצעות שיטות סינתזה סטנדרטיות של פאזה מוצקה. הפעל חמש שוות ערך של חומצת האמינו הסופית C ב-4.4 שוות ערך של HBTU בשני מיליליטר של DIMETHYLFORMAMIDE או DMF למשך חמש דקות. טען את התערובת על שרף זירת החלקה באמצעות שש שוות ערך של די איזופרופיל אתיל אמין למשך שעה בטמפרטורת החדר.

הסר את קבוצת הגנת ה-FM משאריות מסוף C באמצעות 20% INE בשלושה מיליליטר DMF למשך 10 דקות. צמד חומצות אמינו עוקבות צעד אחר צעד בכל שלב. זוג חמש מקבילות של חומצת האמינו הבאה באמצעות שש מקבילות של DI איזופרופיל, אתיל אמין ו-4.4 מקבילות של HBTU בשני מיליליטר DMF למשך שעה אחת.

בטמפרטורת החדר, יש להחיל מחזורי כביסה לאחר צימוד חומצות אמינו ושלבי הגנה FM D לאחר הרכבת הפפטיד. זוג N מכסים קבוצות באמצעות שש מקבילות של DI איזופרופיל, אתיל אמין ו-4.4 מקבילות של HBTU בשני מיליליטר DMF למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם השלמת הרכבת הפפטיד. טפל בתערובת התגובה עם שני מיליליטר מתערובת המחשוף למשך הלילה כדי להסיר קבוצות הגנה על שרשרת צד וקליב מתהפך מהשרף, טרטר את המוצר המתקבל עם אתר דתיל קר כדי לזרז ובמידת הצורך, להתרכז במאייד סיבובי, לסנן את המוצק והיבש שנוצר תחת ואקום או להקפיא יבש באמצעות ליופילייזר.

בשלב זה, המשך לבדיקת קשירת הקיטוב הקרינה כמתואר בפרוטוקול הטקסט לקביעת כריכה תחרותית. מוצג מבנה המודל של H-A-K-R-R-R-L-I-F הקשור לחריץ קשירת הציקלון. חריץ הרכיבה מורכב משני כיסים הידרופוביים, כיס ראשוני גדול יותר וכיס משני קטן יותר, המגושרים על ידי שאריות חומציות המתוארות באדום.

אינטראקציות חשובות אחרות כוללות מגעי קשרי מימן של עמוד השדרה של הפפטיד ואינטראקציות זיווג יונים של שלושת השאריות הבסיסיות של הפפטיד כאן, מוצג מצב הקישור של שלושה חמישה D-C-P-T-R-L-I-F, המוצג עם אינטראקציות קשרי מימן עם אטומי שרשרת צד של טריפטופן שניים 17 וגלוטמין 2 54 מעוגנים. תנוחות של שלוש קבוצות מייצגות ומכסות מוצגות כאשר לכל אחת מהתרכובות הללו יש קשרי מימן עם אטומי מסנן האינטראקציה של טריפטופן 2 17 וגלוטמין 2 54. כפי שמתואר על ידי קווים מקווקווים ירוקים, השומר מתקיים יוצר את האינטראקציות של קיר ואנדר עם הכיס ההידרופובי המשני.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה יותר כיצד לבצע וליישם את אסטרטגיית ההחלפה, המרת מעכב פפטיד ידוע למולקולה דמוית תרופה, המעכבת מתיחת חלבון, ומהווה נקודת התחלה להתפתחות טיפולית.