Name: Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: למדו שיטת ברקוד גנטי פלואורסצנטי לתאי יונקים באמצעות חלבונים ניאון ווירוסים רטרו. טכניקה זו מאפשרת מעקב מקבילי של אוכלוסיות תאים שונות בניסויים ביולוגיים בעלי תפוקה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר גארי נולאן מאוניברסיטת סטנפורד למתן קו תא אריזת הפניקס GP לייצור חלקיקי retroviral. אנו מודים לד&quot;ר רוג&#39;ר Tsien באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו למתן td עגבניות. כמו כן, אנו רוצים להודות למתקן סן דייגו סטייט cytometry הזרימה Core השירות והעזרה שלהם.

1. הכנת תאי יונקים, ייצור נגיפים ותמרה לBarcoding הגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 2.5 x 10 6 תאים חסיד בצלחת 10 סנטימטר (או confluency סביב 50-60%) יום אחד לפני transfection במדיום הנשר (DMEM) עם 10% עוברי עגל בסרום (FCS) שונה Dulbecco. לתא-קו אריזת שימוש ייצור retroviral של בחירה כגון הפניקס-GP (מתנה מסוג גארי נולאן, אוניברסיטת סטנפורד). הערה: קו תא אריזה ביציבות מבטאת חלבוני Gag ופול להיווצרות חלקיקי retroviral בטראנס. להפוך תאים בטוחים בריאים ודבקו בצלחת בשכבה, לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות מאוחר יותר, להכין את תערובת transfection DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 μl של סרום ללא DMEM להוסיף וקטור 3 מיקרוגרם מעטפת וירוס לפוחי Stomatitis גליקופרוטאין (PCI-VSVG) ו -3 מיקרוגרם של וקטור העברה נושא את גן חלבון פלואורסצנטי של עניין. לערבב ולהוסיף 15 μl של polyethylimine (2 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תערובת בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות ולהוסיף לתאים הנפתח חכם. הערה: Polyethylimine מתווסף לתערובת הומוגנית DNA כמגיב transfection ליצירת polyplexes. על מנת לקבל את החלקיקים נגיפיים ביצוע סמני חלבון ניאון שונים, לבצע כל transfection באופן עצמאי עם הסמן של בחירה. זכור כי וקטור העברת retroviral הוא סביב 7 קילו באורך ולא ניתן לארוז אם מעל 10 קילו-בייט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס. על מנת להגדיל את צלחות מקום ייצור נגיפיות על 30 מעלות צלזיוס או 32 ° C במקום. הערה: ניתן להחליף 24 תקשורת transfection הודעה hr עם 7 מיליליטר של תקשורת טריות, ואם כי זה עשוי לשפר את בריאות תא זה עלול להפחית עומס נגיפי בsupernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר transfection 48 שעות לאסוף את החלקיקים המכיל supernatant ויראלי ומסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר polytetrafluoroethylene. השתמש supernatant ויראלי טרי שנאסף עבור התמרה. Otherwise לשמור supernatant בaliquots ב -80 ° C ולהימנע להקפיא להפשיר. זכור כי כייל נגיף יקטן כנראה עד 50% בכל מחזור ההקפאה-הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת תאי צלחת של בחירת 24 שעות לפני התמרה אם חסיד, או מייד לפני התמרה אם לא חסיד. זרעי 2.0 x 10 5-3.0 x 10 5 תאים חסיד (כאן הא 7.5.1 וHEK 293T) או 5.0 x 10 5 ל 1 x 10 6 תאים שאינם חסיד (כאן SupT1) לכל גם בצלחת 6-היטב. הערה: הקפד לכייל את מספר התאים שנזרע לפני התמרה, במיוחד לתאים חסיד, כך שתאים להשיג confluency של כ -60% בזמן של התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene (ברומיד hexadimethrene) לתאי זרע ולאחר מכן להוסיף supernatant ויראלי שנאסף בעבר להשיג סביב 20-40% זיהום (כאן 2 מיליליטר). הערה: משרד הפנים או אחוז מהזיהום הוא בעיקר שרירותית, כמו מיון יאפשר להגביר כל subpopulatיון של תאים. כמובן, שיעור גבוה יותר של זיהום מקל ומאיץ את התהליך של הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאים על ידי צנטריפוגה בהרוטור דלי תלייה ב 1500 XG במשך 120 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. Resuspend תאים שאינם חסיד עם תקשורת טרי לפני הדגירה. לתאים חסיד, להחליף עם תקשורת 24 לאחר התמרה-hr טרי. הערה: מומלץ לאטום את הצלחות לפני צנטריפוגה עם parafilm כדי למנוע שפיכה מעל. כדי להגדיל את המגוון גנטי של תאי המינימרקטים, transduce תאים עם חלקיקים נגיפיים ביצוע חלבונים שונים ניאון (המתקבלים משלב 1.4). בעת בחירת סמני ניאון, לוודא שהם תואמים את המכשור ויש להם פרמטרים ניאון להבחין. </li></ol> 2. בחירה והגברה של תאי המינימרקטים גנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תאי יונקים transduced על ידי הזרימה cytometry לפחות 72 שעות לאחר התמרה לכמת את שיעור אחוז של התמרה. השתמש בשורת תאים-transduced שאינו דומה כביקורת שלילית. הערה: ככל מיון ישמש לטהר אוכלוסיות בודדות המינימרקטים תא, שיעור אחוז גבוה של התמרה ראשונית, ואילו לא נחוץ, צריך להאיץ את התהליך של הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנצל את התא-סדרן של בחירה כדי לקבל את התאים המבטאים את החלבון של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, להבטיח את השערים מוגדרים כהלכה בערוצים הנכונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך להשתמש באותו קו התא נאיבי כביקורת שלילית ולהגדיר את מתח פרמטר / ערוץ, כך שהאוכלוסייה השלילית היא מתחת לערך של 10 3 על כל ציר ניאון. לקבוע gating לקרינה חיובית כאירועים המופיעים מעל זה של הביקורת השלילית עבור כל ערוץ ניאון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות מודע לכך שכל מכשיר עשוי להשתנות והמתח הנכון לקביעת gating צריך להיות בהתאם, מה שהופך את בקרות חיוביות ושליליות הכרחיים בכל expהתקנת erimental. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי הקרינה בהגדרת ניסוי זה להשתמש בערוץ FITC (מסנן 530/30-פס, ולפניו לעבור סינון ארוך 502) לeGFP, ערוץ PE (מסנן 585/42-פס, ולפניו מסנן 556 מסירה ארוכה) לtd עגבניות , וערוץ APC (מסנן 660/20 להקה לעבור) לE2 Crimson. הערה: לייזר 488 ננומטר מרגשת eGFP וtd עגבניות תוך E2 Crimson מתרגש על ידי לייזר 633 ננומטר. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות חרוטי מיין ל -15 מיליליטר עם 1 מיליליטר של 100% FCS. הערה: התהליך של מיון אוכלוסיות תאי ניאון אינו חובה כאחד ישירות יכול להמשיך עם הסוג של שיבוטים בודדים (ראה להלן). מיון אוכלוסיות חזק המבוססות על הקרינה נבחרה מבטיח אוכלוסיית גיבוי לבחירה עתידית של שיבוטים בודדים. זכור כי תאים בודדים הם בזמנים קשים לגדול תוך אפשר להקפיא אוכלוסייה גדולה של תאים בקלות, ולאחר מכן הפשירה ומוגברת בשלב מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spבמורד האוכלוסיות הממוינים בצנטריפוגה הרוטור דלי תלוי ב524 גרם ב 32 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד גלולה תאים. להשעות מחדש ב 1 מיליליטר של תקשורת טריות, ומחדש צלחת תאים כך שconfluency התא הוא מתחת ל -60%, כדי לאפשר צמיחה והחלוקה לפחות יומיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, תאים חסיד צלחת בסביבות 3 x 10 5 תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בכל טוב בצלחת 6-היטב ו- 2 x 10 6 תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בצלחת 6 סנטימטר. השתמש DMEM לתאים חסיד וRPMI לתאים שאינם חסיד (או כל מדיום שצוין, אם נדרש). הנח תאים מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים כדי לאפשר להגברה. </li></ol></li></ol> 3. לקבל משובטות אוכלוסיות של תאי המינימרקטים גנטי בעוצמות שונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג אוכלוסיות משובטים מתאי transduced במקור (שלב 1.7) או מהאוכלוסייה הממוינת (שלב 2.3). הערה: פעולה זו תבטיח רמה שווה או דומה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בין כל התאים בתוך האוכלוסייה (אוכלוסייה הדוקה עם קורות חיים קטנים בעוצמת הקרינה ממוצעת של עד 40%). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, תאי מין יחידים ל96-גם צלחות עם יחידה בתצהיר תא אוטומטי (ACDU). קבע שערים למיון על פי אוכלוסיות של עניין. שערים להבטיח נקבעים יומן בקנה מידה אחד לפחות מלבד להשיג אוכלוסיות מובחנות בעת בחירת תאים בעוצמות ניאון שונות. להליך המוצג כאן, להשתמש באותו cytometry הזרימה ניסיוני שהוקם כאחד מתואר בשלב 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר שיבוטים בודדים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות. בתהליך של הגברה לנתח את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שאוכלוסיות גדלו נובעות מהתאים בודדים ולא מאחד או יותר. הערה: זכור כי סדרן יציבו תא אחד בכל טוב בממוצע, ובעוד כמה בארות לא יכולות להיות כל תא בכל, אולי לאחרים יש יותר מאחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שpopulation נובע מתא אחד בלבד, להיות מאוד עדין עם הצלחת ולא להפריע לבארות על ידי pipetting. שים לב לצלחת, גם על ידי כן, מתחת למיקרוסקופ. הערה: בעוד תאים בודדים עשויים לעתים להיות קשים לזהות, ברגע שהם מתחילים החלוקה הם יהיו קלים לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות מודע לכך שלעתים קרובות &#39;הגוש של התאים בשולי. זורק אותם הבארות שבו ניתן לצפות אוכלוסיות משובטים מרובות ולשמור על אלה שיש לי אוכלוסייה אחת חזק. הערה: מומלץ להעביר אותם לתוך צלחות גדולות יותר להגברה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך האוכלוסיות המשובטים המשוערות על ידי ניתוחם על ידי cytometry זרימה. להשוות אותם לביקורת שלילית ניצול אותה הזרימה cytometry התקנה ניסיונית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רק אחוז מהמדגם ולשמור את שאר כגיבוי. בחר האוכלוסיות ביותר המובהק נפרדות המבוססות על עוצמה ואטימות של האוכלוסייה ממוצעת. להגביר אותם לפי צורך או להקפיא מניות בהקפאת תקשורת עם גליצרול 20% ב -80 ° C לפרקי זמן קצרים או חנקן נוזלי למשך זמן ארוך יותר. הערה: זכור כי אוכלוסייה &quot;אמיתית&quot; משובט צריכה דפוס הקרינה חזק מאוד. </li></ol></li></ol> 4. ודאו יכולות Multiplexing לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב כמה שיותר אוכלוסיות משובטים שונות בהתאם לצורך שיכול להיות מנוצל נוסף בפורמט מרובב. בחר שיבוטים עם קליטה / ספקטרום פליטה להבחין ו / או בעוצמות שונות. אם נעשה שימוש בפורמט צלחת 96-היטב, אשר מתאימה לHTS, זרע 50,000 תאים ב200 μl בכל טוב. הערה: זכור כי מספר התאים הוא אומדן בלבד ועשוי להשתנות בהתאם לסוג תא ובין אם מדובר בחסיד או לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המדגם באמצעות זרימת cytometry כדי להבטיח שכל אחד משורות תאים העצמאיים שהוקמו ניאון ניתן להבחין בין זה לזה. לפני הניתוח להכין שליליובקרות צבע אחד לפרמטרים שנקבעו וערכי פיצוי. הערה: הגדרת הפרמטרים להבחנה ברורה האוכלוסיות המעורבות תאפשר להם להיות מנוצלת נוספת בפורמט מרובב. </li></ol> 5. להתאים שורות תאים גנטי המינימרקטים ליישום הביולוגי של בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce הוקמו קווי המינימרקטים גנטיים תא עם חלקיקים נגיפיים המכילים אלמנטי assay של בחירה, כפי שמתוארים כאן בStolp et al., 2013 59. זכור כי assay של בחירה צריך לכבוש ערוץ ניאון נוסף והבחנה ולכן הוא יועבר לשורת תאי המינימרקטים המתאימה. הערה: כל שורת תאי המינימרקטים יכולה לשאת assay שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי המינימרקטים מיון גנטי ניאון עבור אלה המכילים אלמנטי assay. יכולים להיות מהונדסים אלמנטי Assay מצמידים תג או חלבון פלואורסצנטי (כמו היתוך או באמצעות אתר כניסת הריבוזום פנימי) f: הערהאו איתור פשוט באמצעות מערבי סופג, cytometry זרימה או מיקרוסקופ. המערכת מנוצלת בפרוטוקול זה מסתמכת על ביטוי משטח epitope HA לבד, או עם ביטוי epitope דגל נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את האוכלוסיות המשובטים מכילות assay עם נוגדני מצמידי HA וAPC-fluorescently. לאחר מכן לנתח את האוכלוסיות המשובטים עם אנטי-דגל ומכתים נוגדן FITC- מצומדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר בחזרה assay, לנתח או &quot;לפענח&quot; האוכלוסיות בערוץ המתאים שבו ניתן להבחין שורות תאי המינימרקטים שונות גנטי. כאן, לפענח את טיבו של המצע על ידי ניתוח בערוץ PE לגילוי עגבניות td. </li></ol></li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנה שני הליכים מבוססים היטב כבר בשילוב; הנדסה גנטית באמצעות טכנולוגיה וזיהוי של חלבוני ניאון ניצול זרימת cytometry retroviral. barcoding הגנטי ניאון המבוסס על חלבונים לייצור של שורות תאים ייחודיות מספק דרך חזקה ופשוטה ליישומים מרובבים. יצירת תאי המינימרקטים מהונדסים גנטי באמצעות טכנולוגית retroviral, הוא בהתחלה תהליך ממושך, אך מאפשר לאדם להשיג, הוקם פעם, מקור אמין ויציב של חומר תא. טבעה של טכנולוגיה זו מייצר באופן עקבי שורות תאים מהונדסות גנטי עם מאפייני ניאון יציבים שהפכו biosign...

טכנולוגיות כגון ספקטרוסקופיה הקרינה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה, כל להסתמך על הקרינה, רכוש ניצל נרחב ביישומים ביוכימיים, ביו-רפואיים, וכימיים. הקרינה, בין אם פנימי או באמצעות תיוג, נוצל לניתוח דפוסי חלבון ביטוי ופרופילים, גורל תא, אינטראקציות חלבון ותפקודים ביולוגיים 1-9, ובאמצעות הקרינה / העברת אנרגיית תהודת פורסטר לצורך זיהוי של אינטראקציות biomolecule ושינויי קונפורמציה 10-13. מאז את בידודו של חלבון Aequorea ויקטוריה הירוק הניאון (GFP) 14, הגילוי של חלבוני ניאון טבעיים נוספים מצורבים אחרים, במיוחד אלמוגים, במידה רבה הגדיל את מספר חלבוני ניאון הקיים עם ספקטרום עירור / פליטה להבחין. אלה, יחד עם ההקדמה של מוטציות בגנים שלהם 15-19, havהדואר הרחיב עוד יותר את האפשרויות, קבלת צבעים נכונים של חלבוני ניאון זמינים למדענים המנצלים מיקרוסקופיה, cytometry זרימה וטכנולוגיות מבוססי הקרינה אחרות למחקר שלהם. במקביל, אם כי באופן עצמאי, הפיתוח של טכנולוגית retroviral אופן דרסטי הקל הביטוי היציב של מידע גנטי מחוץ לרחם בתאי יונקים 20-23. לכן אין זה מפתיע כי טכנולוגיה זו נעשתה שימוש כדי להעביר את הגנים של חלבוני ניאון למספר רחב של סוגי תאים ורקמות 24-28 או לייצור בעלי החיים מהונדסים 29-31. בעקבות הטבע של רטרווירוסים, המידע הגנטי של החלבון פלואורסצנטי מחוץ לרחם הוא הציג בתוך הגנום של התא 32 והתא הופך ניאון &#39;לever&#39;. מאפיין זה מאפשר מעקב אחר גורל תא, או של תא בודד בתוך אוכלוסייה של תאים. התא עכשיו הניאון יש בכך אקיאדום biosignature משלו ויכול להיות מוגדר כהמבורקד. biosignature הייחודי שלה מזהה אותו מהתאים אחרים, וחשוב מכך, מבדיל אותו מהתאים גנטי מניפולציות להביע חלבוני ניאון שונים עם ספקטרום קליטה / פליטה להבחין. יישומים ביולוגיים כגון המעקב של גורמי תכנות מחדש לקראת pluripotency 33, הניתוח של גורמי subnuclear להבהרת לוקליזציה nucleolar 34, הבנייה של פלסמידים כתב ניאון ללימודי תעתיק 35 או התיוג הגנטי של תאי עצב לחקר ארכיטקטורת רשת עצבית 36 , הן רק ארבעה דוגמאות של רב שנצלו גני חלבון פלואורסצנטי שונים עבור אותו התקנה ניסיונית. Cytometry זרימה כבר בשימוש נרחב לניתוח של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד, כגון ביטוי גנים, מחזור תא, אפופטוזיס, ואיתות באמצעות phosphorylation 37-43 .the ביטוי יציב של גני חלבון פלואורסצנטי בתאי יונקים שיפר עוד יותר את השירות של הזרימה cytometry לאינטראקציות תא ניתוח 38,44 ויגנד לקלוט 45. יכולות משופרות אפשרו זרימת cytometry להפוך למתודולוגיה שימוש נרחב לתפוקה גבוהה וגבוה תוכן הקרנת 46. למרות המספר כעת המורחב של fluorometers ורובוטיקה טכנולוגיות שיכולים מערכות צלחת זוג קורא, הדמיה וcytometry זרימה, נראה שיש חוסר בתכנון ניסוי שיכול לנצל ולהתאים את יכולות טכנולוגיות משופרות אלה. מתודולוגיות מבוססות תאים מהיר, אמינות, פשוטות וחזקה יש צורך באופן דרסטי עבור יישומים מרובבים שיחזקו את יכולת תפוקה גבוהה. הדבר נכון במיוחד בתחום של גילוי תרופות שבו מבחני מבוססי תאי הנדסה בפורמט ריבוב יכולים לשפר את הכח של הקרנת תפוקה גבוהה 39,47-50 </sup&gt;. ריבוב, שכן היא מאפשרת ניתוחים בו זמנית במדגם אחד, משפר עוד יותר את יכולות תפוקה גבוהה 51-54. barcoding הגנטי ניאון לא רק מאפשר לריבוב אלגנטי, אלא גם, מהונדס פעם, עוקף את הצורך של פרוטוקולי זמן רב, מפחית את עלויות מלווים בנוגדנים, חרוזים וכתמים 39,52,55, ויכול להפחית את מספר המסכים הנדרש לגבוה יישומי תפוקה. יש לנו תארנו לאחרונה איך retroviral טכנולוגיה יכול לשפר את הריבוב דרך barcoding הגנטי ניאון עבור יישומים ביולוגיים, בהבעת assay שפותח בעבר כדי לעקוב אחר פעילות פרוטאז HIV-1 56,57 עם גרסאות קליניות נפוצות שונות 58. המתודולוגיה מוסברת באופן תיאורי יותר התמקדות על איך לבחור ולהגביר תאי המינימרקטים גנטי ניאון ואיך לייצר פנלים של אוכלוסיות משובטים להביע חלבוני ניאון שונים ו / או intensit הקרינה שונהies. פנלים של אוכלוסיות תאים להבחין בהתבסס על מאפייני הניאון שלהם לשפר את יכולות מרובבות, אשר ניתן לניצול נוסף בשילוב עם מבחני מבוססי תאים שהתמודדות עם שאלות ביולוגיות שונות. הפרוטוקול מתאר גם כיצד להנדס פנל של תאי המינימרקטים נושא אחד מבחני מבוססי תאים שפותחו בעבר במעבדה, כמו בדוגמה של 59. פרוטוקול זה ולכן לא נועד להראות את הטכנולוגיה מבוססת היטב retroviral / lentiviral להעברה גנטית, את הערך של חלבוני ניאון או היישומים של זרימת cytometry 60,48 אלא כדי להראות את כוח שיפור של שילוב שלושה עבור יישומים מרובבים.

<table><tbody><tr><td>מזרקי BD 10 מ"ל</td><td></td><td>309604</td><td>המשמשים לסינון הנגיף</td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; m מסנן פלויטטרפלואורואתילן</td><td>Pall Corporation</td><td>4219</td><td>המשמש לסינון הנגיף</td></tr><tr><td>DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)</td> <td>קורנינג</td><td>45000-304</td><td>אמצעי גידול תאים לתאי HEK 293T</td></tr><tr><td>PEI (פוליאתילנימין)</td> <td>poly sciences</td><td>23966-2</td><td>ריכוז 2 מ"ג/מ"ל בשימוש</td></tr><tr><td>צנטריפוגה דלי תלייה (מקוררת)</td> <td>Eppendorf</td><td>5805 000.017</td><td>משמש עבור זיהום ספין</td></tr><tr><td>PBS (מלח פוספט)</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td>משמש לשטיפת תאים</td></tr><tr><td>פוליברנה (הקסדימית'רן ברומיד)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>107689</td><td>משמש להגברת יעילות הזיהום הנגיפי. בשימוש ב-5 ומיקרו; ריכוז גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>מכשיר FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>המשמש למיון אוכלוסיות תאים</td></tr> מכשיר <tr><td>FACSCanto</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>המשמש לניתוח תאים</td></tr><tr><td>Phoenix-GP</td><td>מתנה מקו התאים של גארי נולאן</td><td></td><td>המשמש לייצור חלקיקים רטרו-ויראליים</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Mediatech</td><td>MT35015CV</td><td>המשמש לצמיחת תאים ומיון</td></tr><tr><td>תאי SupT1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1942</td><td>לימפובלסטים אנושיים מסוג T</td></tr><tr><td>תאי HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>תאי כליה עובריים אנושיים המכילים גם את SV40 אנטיגן T גדול</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>אמצעי גידול תאי לתאי SupT1</td></tr></tbody></table>

barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי multiplexed

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

חלבונים פלואורסצנטיים, צבעים פלואורסצנטיים ופלואורופורים באופן כללי חוללו מהפכה בתחום הביולוגיה המולקולרית של התא. בפרט, גילוי חלבונים פלואורסצנטיים והגנים שלהם איפשר הנדסה של היתוך חלבונים ללוקליזציה, ניתוח הפעלת שעתוק ותרגום של חלבונים מעניינים, או מעקב כללי אחר תאים בודדים ואוכלוסיות תאים. השימוש בגנים של חלבון פלואורסצנטי בשילוב עם טכנולוגיה רטרו-ויראלית איפשר עוד יותר ביטוי של חלבונים אלה בתאי יונקים בצורה יציבה ואמינה. מוצג כאן כיצד ניתן להשתמש בגנים אלה כדי לתת לתאים בתוך אוכלוסיית תאים את החתימה הביולוגית שלהם. מכיוון שהחתימה הביולוגית מושגת בטכנולוגיה רטרו-ויראלית, התאים מקודדים 'ללא הגבלת זמן'. ככאלה, ניתן לעקוב אחריהם בנפרד בתוך תערובת של תאים מקודדים ולהשתמש בהם ביישומים ביולוגיים מורכבים יותר. המעקב אחר אוכלוסיות נפרדות בתערובת של תאים הוא אידיאלי עבור יישומים מרובים כגון גילוי תרופות כנגד מספר רב של מטרות או פרופיל הפעלה של מקדמים שונים. הפרוטוקול מתאר כיצד לפתח ולהגביר באלגנטיות תאי יונקים ברקודים עם סמנים פלואורסצנטיים גנטיים מובהקים, וכיצד להשתמש בכמה סמנים בבת אחת או בסמן אחד בעוצמות שונות. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד ניתן לנצל את התאים בשילוב עם מבחנים מבוססי תאים כדי להגביר את כוח הניתוח באמצעות ריבוב.

ניאון Multiplexing גנטי המינימרקטים תאים לצורך היישומים ביולוגיים יושג רק פעם אחת אוכלוסיות משובטים בודדות כבר נוצרו. הריבוב הוא יעיל ביותר כאשר יש לי אוכלוסיות המינימרקטים מאפייני ניאון מובהקים ברורים עם חפיפה ספקטרלית מינימאלית. הדוגמא שמוצגת באיור 1 עם אוכלוסיות משובטים של תאי יונקים SupT1 ממחישה כי תאי המינימרקטים עם mCherry וחלבון cyano ניאון (CFP) ניתן לנתח בקלות בו זמנית מבלי לאבד את מאפייני הניאון האישיים שלהם. מטריצה ​​זו ובכך מדגימה פנל של תאי המינימרקטי...

מאז גילוי גן החלבון הפלואורסצנטי הירוק, חלבונים פלואורסצנטיים השפיעו על הביולוגיה המולקולרית של התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים באמצעות הנדסה גנטית משמש לברקוד תאים בודדים. ההליך מאפשר מעקב אחר אוכלוסיות שונות בתערובת תאים, שהיא אידיאלית עבור יישומים מרובים.

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לסמן תאי יונקים באמצעות ברקוד פלואורסצנטי (fluorescently barcode), כדי לשפר בדיקות ביולוגיות רב-ערוציות (multiplexed) בעלות תפוקה גבוהה המסתמכות על קריאות פלואורסצנטיות נפרדות. לשם כך, נעשה שימוש בחלקיקים רטרו-ויראליים כדי לבטא באופן יציב חלבוני פלואורסצנציה בתאי יונקים, ובכך לסמן אותם בברקוד. לאחר מכן, מבוצע מיון תאים מופעל פלואורסצנטית (fluorescent activated cell sorting) כדי להשיג אוכלוסיות קלונליות מסומנות בברקוד.לאחר מכן, האוכלוסיות הקלונאליות מרובות, משולבות ומנותחות באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לאשר שניתן להבחין ביניהן ולכן ניתן להשתמש בהן בו-זמנית. לבסוף, קווי התאים המסומנים בברקוד עוברים טרנסדוקציה עם חלבונים מסומנים לבדיקה. הפעילות הביולוגית והחלבונים מנוטרים באמצעות ערוצים פלואורסצנטיים הנבדלים מהערוצים של הברקוד.התוצאות מדגימות את התועלת של ציפוי בר-פלוורסצנטי (fluorescent bar coating) של תאי יונקים עבור יישומים מרובי-מטריצות (multiplexed) בסביבה בעלת תפוקה גבוהה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הדורשות כיול מדויק של נוגדנים או צבעים הוא שברגע שקווי תאים בעלי ברקוד גנטי מוקמים, הם אינם דורשים מניפולציה נוספת, ומכיוון שהחלבון המבוקש מבוטא למשך תקופות זמן ארוכות, ניתן להשתמש בהם להמשך בחינת התאמות ביולוגיות. שילוב של קווי תאים בעלי ברקוד גנטי פלוורסצנטי עם בדיקות שטח (surface assays) מאפשר לנו לחקור תפקודי ביולוגיים או השפעות באופן עצמאי בפורמט של תפוקה גבוהה.בדוגמה שלנו, אנו משתמשים בציפוי של ברים גנטיים פלואורסצנטיים כדי לנטר באופן מולטיפלקסי פיצול של סובסטראטים ויראליים שונים. ניתן לנצל את הבדיקה זו להמשך חקירה של המנגנונים המעורבים בפיצול ולגילוי תרופות בסריקה רחבה (high throughput). יום לפני הטרנספקציה, זרעו בצלחת בקוטר 10 סנטימטר 2.5 × 10⁶ תאי Phoenix GP בתוך DMEM עם 10% FBS.קו תאי אריזה זה מבטא באופן יציב את החלבונים gag ו-pole ליצירת חלקיקי רטרו-וירוס בטרנספקציה. ביום הטרנספקציה, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) כדי לבחון את התאים. התאים חייבים להיות בריאים ולהיצמד לפלטה כשכבה אחת (monolayer) כדי שניתן יהיה להשתמש בהם לטרנספקציה.בשלב הבא, הכינו תערובת טרנספקציה של DNA ב-125 µL של DMEM ללא סרום. הוסיפו 3 µg של וקטור גליקופרוטאין מעטפת של נגיף הסטומטיס וסיקולרי (vesicular stomatitis virus), P-C-I-V-S-V-G, ו-3 µg של וקטור העברה הנושא את הגן של חלבון הפלואורסצנציה הרלוונטי; הוסיפו 15 µL של ריאגנט טרנספקציה מסוג polyetheramine וערבבו כדי לקבל חלקיקים ויראליים הנושאים סמני חלבון פלואורסצנציה שונים. בצעו כל טרנספקציה באופן נפרד עם הסמן המבוקש.דגרו כל תערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, בצעו טרנספקציה על ידי הוספת התערובת לתאים בטפטוף. לאחר מכן, דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C. באופן רציונלי, לאחר 24 שעות, החליפו את המצע ב-7 mL של מצע טרי.למרות שדבר זה עשוי לשפר את בריאות התאים, הוא עלול להפחית את העומס הוויראלי בנוזל העילאי. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, השתמשו בפיפטור כדי להעביר את הנוזל העילאי, המכיל את חלקיקי הנגיף, למזרק של 10 milliliter. המזרק יהיה מצויד במסנן polytetrafluoroethylene של 0.20 micromolar; לחצו על הבוכנה כדי להעביר את התסנין למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של שני milliliter.הפרידו מנה (aliquot) של 2 mL לשימוש מיידי. הניחו את ה-viral snat ואת המנות שנותרו על קרח והעבירו אותם לטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש. 24 שעות לפני התעתוק (transduction), זרעו בכל באר של פלטה בעלת 6 בארות 2.0 עד 3.0 × 10⁵ תאים דבקים; כאן נעשה שימוש בתאי 293T. למשם התעתוק של התאים הדבקים, הסירו את המצע הקיים מהפלטה.הוסיפו 5 µg/mL של poly brain לשני המיליליטרים של supernatant הנגיפי שנאספו קודם לכן, והוסיפו את התערובת בזהירות לתאים. אטמו את הפלטות עם Parafilm. לאחר מכן, הניחו את הפלטות בתוך דלי תלוי.סבבו במערך צנטריפוגה במהירות של 1500 ×g למשך 120 דקות בטמפרטורה של 32 °C. לאחר הסבב, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. לאחר 24 שעות, החליפו את מצע התאים לפחות בכל 72 שעות.לאחר ההעברה (transduction). התכוננו לניתוח התאים שהועברו באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) כדי לכמת את שיעור אחוזי ההעברה. ראשית, בעזרת שורת תאים מקבילה שלא עברה העברה כביקורת שלילית, ודאו שהשערים (gates) מוגדרים כראוי בערוצים הנכונים.הגדירו את מתח הערוץ (channel voltage) כך שאוכלוסיית השלילה תהיה נמוכה מהערך של 10³ בכל ציר פלואורסצנציה רלוונטי. לאחר מכן, הגדירו את השערים (gates) לפלואורסצנציה חיובית כאירועים המופיעים מעבר לשלילה. לאחר מכן, באמצעות התאים שעברו טרנסדוקציה, קבעו את אחוז החיוביים בערוץ הפלואורסצנציה הספציפי.מיינו את התאים למבחנות קוניות בנפח 15 מיליליטר המכילות מיליליטר אחד של 100% FBS. לאחר מכן, סובבו את האוכלוסיות הממוינות במבחנות תלויות. השתמשו בצנטריפוגה במהירות של 524 ×g בטמפרטורה של 32 °C למשך חמש דקות.לאחר הסבוב, השביعه את התאים במיליליטר אחד של מצע טרי, ולאחר מכן זרע 2×10⁶ תאים בשני מיליליטר של DMEM בצלוחית של 6 סנטימטר. בריכוז זה, רמת ההצפיפות (confluence) היא נמוכה מ-60% ותאפשר צמיחה וחלוקה למשך יומיים לפחות. הנח את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר ימים כדי לאפשר זמן להגברה.ניתן להפיק אוכלוסיות קלונאליות הן מהתאים שהועברו טרנסדוקציה במקור והן מהתאים המומיהים. מיון אוכלוסיות הדוקות על בסיס פלואורסצנציה נבחרת, במקום מיון קלונים בודדים בשלב זה, מבטיח קיומה של אוכלוסיית גיבוי לברירה עתידית. במידת הצורך, הגדירו את השערים (gates) למיון בהתאם לאוכלוסיות הרלוונטיות, וודאו כי השערים מוגדרים במרחק של לפחות סולם לוגריתמי אחד זה מזה. כדי לקבל אוכלוסיות מובחנות, השתמשו ביחידה אוטומטית להשקעת תאים לצורך מיון תאים בודדים לפלטות של 96 בארות; שימו לב כי בממוצע יהיה תא אחד לכל בארה.ייתכן שחלק מהבארות לא יכילו תאים ואחרות יכילו יותר מאחד. לאחר המיון, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שבועיים לפחות כדי להגדיל את השכפולים הבודדים. בחנו את התאים באופן קבוע תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהאוכלוסיות הגדלות נובעות מתאים בודדים ולא מיותר מאחד.כמו כן, ודאו שהתאים אינם הופכים לצפופים מדי לאחר שחלפו שבועיים. בצעו סריקה של האוכלוסיות הקלונליות המשוערות באמצעות ציטומטריה של זרימה והשוו אותן לאוכלוסיית ביקורת שלילית. לאוכלוסיות קלונליות אמיתיות צריכים להיות דפוסי פלואורסצנציה הדוקים מאוד.בחרו את האוכלוסיות הנפרדות ביותר על בסיס העוצמה הממוצעת והצפיפות של האוכלוסייה. הגבירו אותן לפי הצורך או שמרו מלאים במצע הקפאה עם 10% DMSO בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לתקופות קצרות, או בחנקן נוזלי לתקופות ארוכות יותר. לאחר מכן, בדקו האם ניתן להשתמש באוכלוסיות קלונליות בהצלחה במערכת סריקה רב-ערוצית (multiplex) בעלת תפוקה גבוהה.בחרו קבוצה של שיבוטים בעלי ספקטראבליספיגה ופליטה מובחנים ו/או עוצמות שונות, ושלבו אותם בנבב זריעה יחיד. העבירו 50,000 מהתאים המשולבים ב-200 microliters של DMEM מועשר לכל באר בלוח של 96 באערים, מבחנות נפרדות. הכינו בקרים שליליים ובקרים בעלי צבע יחיד לשימוש בקביעת הפרמטרים וערכי הפיצוי בציטומטר הזרימה.הגדירו את ערכי הפיצוי. לאחר מכן, נתחו את הדגימה כדי לוודא שניתן להבדיל בין כל אחד מקווי התאים הפלואורסצנטיים העצמאיים שהוקמו. כדי להתאים את קווי התאים המסומנים בברקוד ליישום ביולוגי, בחרו תחילה אלמנטים של בדיקה שתכננו כך שיהיו מצומדים לתג או לחלבון פלואורסצנטי כחלבון עיגון (fusion) או באמצעות אתר כניסה פנימי של ריבוזום (IRES).Ires, המאפשר זיהוי פשוט באמצעות western blotting, ציטומטריה של זרימה או מיקרוסקופיה. המערכת שנעשה בה שימוש כאן מורכבת מבדיקה ביולוגית שבה חלבון מעטפת של HIV מובע על פני השטח של התא, ובכך חושף את תגי ה-HA וה-flag שלו. חלבון הבדיקה מובע בתא בעל ברקוד המבטא TD tomato.ניתן לנטר את השסוע של החלבון באמצעות צביעה עם נוגדן Anti-Flag המסומן ב-FSE. כאשר החלבון אינו שסוע, נראה צביעה, אך כאשר החלבון שסוע, סימון הפלואורסצנציה הירוקה אינו נראה יותר. כדי להקים את הבדיקה הביולוגית בתאים עם הברקוד, התעתקו אותם באמצעות חלקיקים ויראליים המכילים את מרכיבי הבדיקה הנבחרים.הוסיפו את ה-viral SUP natin לתאי הבחירה והסבירו אותם באמצעות סנטריפוגה. לאחר מכן, דגרו את התאים עם נוגדנים anti HA המסומנים פלואורסצנטית. לאחר מכן, בצעו מיון של התאים בעלי הברקוד כדי לבודד את אלו המכילים רכיבי בדיקה החיוביים ל-ha.לבסוף, שילבו קווים תאיים נפרדים בעלי ברקודים, כאשר כל אחד מהם מכיל בדיקה עם סובסטרט שונה. דגרו את תערובת התאים עם נוגדן Anti-Flag ונוגדן ZI מצומד, ונחקו אותם באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע אם התרחש ביקוע של החלבון. פעולה זו מאפשרת לעקוב אחר הבדיקה, לנתח או לפענח את האוכלוסיות בערוץ המתאים, שבו ניתן להבחין בין הקווים התאיים הנפרדים בעלי הברקוד הגנטי.ערוץ ה-PE עבור TD tomato, ולאחר מכן פענוח של טבעת הסובסטרט על ידי ניתוח בערוץ ה-fite כדי לחשוף את האוכלוסייה החיובית לבדיקת שסוע של חלבונים המבטאים על פני השטח במסלול ההפרשה. תאי Sub T one שסומנו בברקוד פלואורסצנטי כדי לבטא TD tomato ומוינו לשלוש אוכלוסיות בעצמות שונות. כל אחת מהאוכלוסיות עברה לאחר מכן טרנסדוקציה עם רטרו-וירוס שונה כדי להשרות ביטוי של חלבון המעטפת של HIV מסוג פראי, חלבון המעטפת המוטנטי של HIV או וירוס הדנגיו.חלבון גבול PRM, שכל אחד מהם מוקף בתגי flag ו-HA. התאים שעברו טרנסדוקציה דגרו עם נוגדנים ל-HA ול-Flag. צביעה ב-Anti HA בוצעה כדי לאשר את נוכחותו של חלבון הבדיקה ההנדסי, בעוד שצביעה ב-Anti-Flag בוצעה כדי לקבוע אם הוא עבר ביקוע.כאשר אוכלוסיות משולבות שאינן צבועות נותחו באמצעות ציטומטריה של זרימה, ניתן היה להבחין בין אוכלוסיות קלונליות על בסיס ברקוד ה-TD tomato, אך לא ניתן היה להבחין ביניהן בערוץ ה-fite. בניגוד לכך, כאשר אותן אוכלוסיות צבעו עם נוגדן flag fite, אוכלוסייה אחת הייתה חיובית ל-flagg. על בסיס הברקוד, ניתן לזהות בקלות אוכלוסייה זו כאוכלוסייה הנושאת את סובסטרט מעטפת ה-HIV המוטנטי it.כעת, צריכה להיות לכם הבנה טובה מאוד לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בטכנולוגיית שסתומי רטרו (retro valve) בשילוב עם ציטומטריית זרימה. כדי להקים שורות תאים עם ברקוד גנטי פלואורסצנטי, ארבעה יישומים ביולוגיים בפורמט מולטיפלקס, היכולת לשלב תאים עם ברקוד גנטי פלואורסצנטי עם בדיקות מבוססות תאים בפורמט מולטיפלקס משפרת באופן דרמטי את יכולות הסריקה רב-המדגמיות (high throughput). לאחר יצירת שורות התאים, חשוב להקפיא אותם.לאחר מכן, הפשיקו אותם באופן תקופתי, נתחו אותם מחדש והקפיאו אותם שוב. בעוד שיצירת תאי שורש פלואורסצנטיים עם ברקוד גנטי עשויה להיות גוזלת זמן בתחילה, ברגע שהם מוקמים, הם משפרים באופן דרמטי את ההדירות ואת העמידות של יישומים עתידיים.

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

רצף ברקוד מופעל של Tetrads (הטובים ביותר) מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads ידי תא הקרינה המופעל מיון על גבי צלחות אגר, מפריד את הנבגים על ידי תסיסה עם חרוזי זכוכית, וקובע שמושבות ערוכות באופן אקראי נגזרו מאותו הטטרדה המקורי באמצעות ברקודים מולקולריים.

רצף ברקוד מופעל של Tetrads: BEST

זו גישה מולקולרית מבוסס לקביעת כושר חיידקי מאפשר זיהוי מדויק ומדויק של מיקרואורגניזמים באמצעות ברקודים ייחודי DNA גנומית כי הם כימות דרך ה-PCR הדיגיטלי. הפרוטוקול מתאר חישוב המדד תחרותי עבור זני סלמונלה ; עם זאת, הטכנולוגיה ניתנת להתאמה בקלות לפרוטוקולים הדורשים קוונפיקציה מוחלטת של אורגניזם גנטית מחושל.

דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

ניתוח תמונת ברקוד מרובה שיפר לאחרונה את אפיון המיקרו-סביבה של הגידול, ומאפשר מחקרים מקיפים של הרכב התא, המצב התפקודי והאינטראקציות בין התא לתא. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול צביעה והדמיה באמצעות ברקוד של נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים והדמיית מחזור, המאפשרת שימוש בטכניקת ניתוח תמונה בממד גבוה.

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

דוח זה מתאר פרוטוקול אוטומטי לבדיקות אימונופלואורסצנטיות מרובות (mIF) על מכתים שקופיות אוטומטי. זה מדגים את יכולת השחזור הגבוהה של פרוטאומיקה מרחבית על צביעות רקמות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה ומצלמות פלואורסצנטיות שלמות, שהיא אידיאלית עבור מבחני mIF מותאמים אישית על פני מספר רב של שקופיות רקמה במחקר תרגומי.

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לתכנון פאנל נוגדנים אימונופלואורסצנטי מרובה להדמיה מבוססת ברקוד DNA של רקמות מלנומה FFPE של עכברים. אנו מתארים גם צינור ניתוח תמונה באמצעות כלי קוד פתוח ליצירת תובנות פרוטאומיקה מרחביות לגבי המיקרו-סביבה החיסונית של גידול מלנומה בעכברים.

הדמיית אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס מבוססת ברקוד DNA לניתוח דגימות FFPE ממלנומה עכברית מתוכנתת מחדש גנטית

פרוטוקול זה מפרט מתודולוגיה לזיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון בקטעי רקמה משובצים פרפין קבועים בפורמלין.

קרטוגרפיה מולקולרית דו-מודאלית: שילוב זיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון

למדו שיטת ברקוד גנטי פלואורסצנטי לתאי יונקים באמצעות חלבונים ניאון ווירוסים רטרו. טכניקה זו מאפשרת מעקב מקבילי של אוכלוסיות תאים שונות בניסויים ביולוגיים בעלי תפוקה גבוהה.

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

גלה סרטונים נוספים