Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לברקוד פלואורסצנטי של תאי יונקים כדי לשפר בדיקות ביולוגיות מרובות בתפוקה גבוהה המסתמכות על קריאות פלואורסצנטיות מובהקות. לשם כך, חלקיקים רטרו-ויראלים משמשים לביטוי יציב של חלבונים פלואורסצנטיים בתאי יונקים, ובכך מקודדים אותם. לאחר מכן מתבצע מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים כדי להשיג אוכלוסיות ברקוד משובטות.

לאחר מכן האוכלוסיות המשובטות מוגברות, משולבות ומנותחות על ידי ציטומטריית זרימה כדי לאשר שניתן להבחין ביניהם ולכן יש להשתמש בהן במקביל. לבסוף, קווי התאים הברקודים מתמרים עם מבחן מתויג. חלבונים ופעילות ביולוגית מנוטרים באמצעות תעלות פלואורסצנטיות נבדלות מהתעלות הברקודיות.

התוצאות מדגימות את התועלת של ציפוי מוט פלואורסצנטי של תאי יונקים ליישומים מרובים בסביבת תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הדורשות כיול קפדני של נוגדנים או צבע הוא שברגע שנוצרים קווי תאים מקודדים גנטית, הם אינם דורשים מניפולציה נוספת ומכיוון שהחלבון המעניין מתבטא לפרקי זמן ארוכים, הם משמשים עוד יותר להתאמות ביולוגיות. צימוד קווי תאים מקודדים גנטית פלואורסצנטיים עם מבחני פני השטח מאפשר לנו לחקור פונקציות או השפעות ביולוגיות באופן עצמאי בפורמט תפוקה הידרו.

בדוגמה שלנו, אנו משתמשים בציפוי מוט גנטי פלואורסצנטי כדי לנטר מחשוף של ריבוי מצעים נגיפיים שונים. ניתן לנצל את הבדיקה עוד יותר כדי לחקור את המכונות המעורבות במחשוף ולגילוי תרופות בתפוקה גבוהה. יום לפני הטרנספקציה זרע צלחת של 10 סנטימטר עם 2.5 כפול 10 לתאי Phoenix GP השישי ב-DMEM עם 10% FBS.

קו תאי אריזה זה מבטא ביציבות חלבוני גאג וקוטב להיווצרות חלקיקים רטרו-ויראלים בטראנס. ביום הטרנספקציה, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לבחון את התאים. התאים חייבים להיות בריאים ולהיצמד לצלחת בשכבה חד-שכבתית שתשמש לטרנספקציה.

לאחר מכן, הכינו את תערובת העברת ה-DNA ל-125 מיקרוליטר ללא סרום. DMEM. הוסף שלושה מיקרוגרם של וקטור גליקופרוטאין של נגיף סטומטיטיס שלפוחיתית, P-C-I-V-S-V-G, ושלושה מיקרוגרם של וקטור העברה הנושא את גן החלבון הפלואורסצנטי המעניין, הוסף 15 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה פוליאתראמין וערבב לקבלת חלקיקים נגיפיים הנושאים סמני חלבון פלואורסצנטיים שונים. בצע כל טרנספקציה באופן עצמאי עם הסמן הנבחר לעשות זאת.

דגרו כל תערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאחר מעבר הדגירה על ידי הוספת התערובת לתאים. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, לאחר 24 שעות, החלף את המדיום בשבעה מיליליטר מדיום טרי.

למרות שזה עשוי לשפר את בריאות התאים, זה עשוי להפחית את העומס הנגיפי בסופרנטנט. 48 שעות לאחר הטרנספקציה השתמשו בצינור כדי להעביר את הסופרנטנט, המכיל את חלקיקי הנגיף למזרק של 10 מיליליטר. מצויד במסנן פוליטטרפלואורואתילן מיקרו-מולרי 0.20 כדי ללחוץ על הבוכנה כדי להוציא את המסנן לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה של מיליליטר.

הניחו בצד כמות של שני מיליליטר לשימוש מיידי. הניחו את ה-snat הנגיפי הנותר וה-aliquots על קרח והעבירו אותם ל-80 מעלות צלזיוס שליליות עד לשימוש 24 שעות לפני ההעברה בכל באר של זרע צלחת שש בארות 2.0 עד 3.0 פעמים 10 לתאים הדבקים החמישיים כאן משתמשים ב-2 9 3 תאי T למחרת. כדי להמיר את התאים הדבקים, הסר את המדיה הקיימת מהצלחת.

הוסף חמישה מיקרוגרם למיליליטר של מוח פולי לשני מיליליטר של הסינוס הנגיפי שנאסף בעבר, והוסף את התערובת בזהירות לתאים. אוטמים את הצלחות בבושם. ואז הניחו את הצלחות בדלי תלוי.

צנטריפוגה צנטריפוגה ב 1500 פעמים G למשך 120 דקות ב -32 מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, החלף את התאים בינוני לפחות 72 שעות.

לאחר התמרה. התכוננו לנתח את התאים המומרים על ידי ציטומטריית זרימה כדי לכמת את אחוז קצב ההתמרה. ראשית, באמצעות קו תאים מותמר דומה כבקרה שלילית, ודא שהשערים מוגדרים כראוי בערוצים הנכונים.

הגדר את ערוץ הפרמטרtage כך שהאוכלוסייה השלילית תהיה מתחת לערך של 10 עד השלישי בכל ציר פלואורסצנטי מעניין. לאחר מכן, הגדר את השערים לפלואורסצנטיות חיובית כאירועים המופיעים מעבר לזה של השליטה השלילית. לאחר מכן, בעזרת התאים המועברים, קבע את האחוז החיובי עבור תעלת הפלואורסצנט הספציפית.

מיין את התאים לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר המכילים מיליליטר אחד של 100% FBS. לאחר מכן סובב את האוכלוסיות הממוינות בדלי תלוי. צנטריפוגת רוטור ב 524 פעמים G ב -32 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר הסיבוב, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום טרי, ואז זרעו פעמיים פי 10 לששת התאים בשני מיליליטר של DMEM על צלחת של שישה סנטימטרים. בריכוז זה המפגש נמוך מ-60% ויאפשר צמיחה וחלוקה למשך יומיים לפחות. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים כדי לאפשר זמן להגברה.

אוכלוסיות משובטות יכולות להיווצר מהתאים המומרים במקור או מהתאים הממוינים. מיון אוכלוסיות צפופות על סמך פלואורסצנטיות נבחרת ולא על שיבוטים בודדים בשלב זה מבטיח אוכלוסיית גיבוי לבחירה עתידית. במידת הצורך, הגדר את השערים למיון לפי אוכלוסיות מעניינות, וודא שהשערים מוגדרים לפחות בסולם עץ אחד זה מזה כדי להשיג אוכלוסיות הניתנות להבחנה באמצעות יחידת תצהיר תאים אוטומטית מיין תאים בודדים ל-96 לוחות באר שים לב שיהיה ממוצע של תא אחד לבאר.

בבארות מסוימות אין תאים ובאחרות עשויים להיות יותר מאחד עוקבים. מיון, דגירה על התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לפחות כדי להגביר את השיבוטים הבודדים. בדוק באופן קבוע את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שאוכלוסיות גדלות נובעות מתאים בודדים ולא מיותר מאחד.

כמו כן, ודא שהתאים לא יגדלו יתר על המידה לאחר שחלפו שבועיים. סנן את האוכלוסיות המשובטות המשוערות על ידי זרימה ציטומטרית והשווה אותן לאוכלוסיית בקרה שלילית. אוכלוסיות שיבוטיות אמיתיות צריכות להיות בעלות דפוסי פלואורסצנטיות הדוקים מאוד.

בחר את האוכלוסיות הנפרדות ביותר על סמך עוצמה ממוצעת וצפיפות של האוכלוסייה. הגבירו אותם לפי הצורך או אחסנו מלאי במדיום קפוא עם 10% DMSO בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לפרקי זמן קצרים או חנקן נוזלי לפרקי זמן ארוכים יותר. לאחר מכן, כדי לבדוק אם ניתן להשתמש בהצלחה באוכלוסיות משובטות במערכת סינון מרובת תפוקה גבוהה.

בחר קבוצה של שיבוטים עם ספיגה מובחנת, ספקטרום פליטה ו/או עוצמות שונות, ושלב אותם בזרע צינור יחיד. 50,000 מהתאים המשולבים ב-200 מיקרוליטר של DMEM משלים בכל באר של צלחת 96 בארות בצינורות נפרדים. הכן פקדי צבע שלילי ויחיד לשימוש בקביעת פרמטרים וערכי פיצוי בציטומטר הזרימה.

הגדר את ערכי הפיצוי. לאחר מכן נתח את הדגימה כדי להבטיח שניתן להבחין בכל אחד מקווי התאים הפלואורסצנטיים העצמאיים שהוקמו. כדי להתאים את קווי התאים הברקודים ליישום ביולוגי, בחר תחילה רכיבי בדיקה שהונדסו כך שהם מחוברים לתג או לחלבון פלואורסצנטי כהיתוך או דרך אתר כניסה פנימי של ריבוזום.

Ires, המאפשר זיהוי פשוט באמצעות ציטומטריית זרימה מערבית או מיקרוסקופיה. המערכת המשמשת כאן מורכבת מבדיקה ביולוגית שבה חלבון מעטפת HIV מתבטא על פני התא, וחושף את תגי ה-HA והדגל שלו. חלבון הבדיקה מתבטא בתא ברקוד המבטא עגבניות TD.

ניתן לנטר את המחשוף של החלבון על ידי צביעה עם נוגדן נגד דגל שכותרתו FSE. כאשר החלבון אינו נבקע, רואים כתמים, אך כאשר החלבון נבקע, סימון הקרינה הירוקה אינו ניכר עוד. כדי לבסס את הבדיקה הביולוגית בתאים הברקודים, התמיר אותם עם חלקיקים נגיפיים המכילים את מרכיבי הבדיקה לבחירה.

הוסף SUP natin ויראלי לתאים לבחירתך וסובב על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, דגרו על התאים עם נוגדנים נגד HA עם תווית פלואורסצנטית. לאחר מכן מיין את התאים הברקודים כדי לבודד את אלה המכילים רכיבי בדיקה חיוביים עבור ha.

לבסוף, שילבו קווי תאים ברקודים מובחנים. כל אחד מהם מכיל בדיקה הנושאת מצע שונה. דגרו את תערובת התאים עם נוגדנים מצומדים Anti-Flag ו-ZI ונתחו אותם על ידי זרימה ציטומטרית כדי לקבוע אם התרחש פיצול של החלבון כדי לעקוב אחר הבדיקה, לנתח או לפענח את האוכלוסיות בערוץ המתאים שבו ניתן להבחין כאן בקווי התאים הייחודיים המקודדים גנטית.

לאחר מכן, ערוץ ה-PE לעגבניות TD מפענח את אופי המצע על ידי ניתוח בערוץ ה-fite כדי לחשוף את האוכלוסייה החיובית לבדיקת מחשוף של חלבונים המתבטאים על פני השטח במסלול ההפרשה. תאים תת-T אחד לברקוד פלואורסצנטי לביטוי עגבניות TD וממוינים לשלוש אוכלוסיות בעוצמות שונות. לאחר מכן כל אחת מהאוכלוסיות הומרת עם רטרו-וירוס אחר כדי לגרום לביטוי של חלבון מעטפת HIV מסוג פראי, חלבון מעטפת HIV מוטנטי או נגיף דנגי.

חלבון גבול PRM, כל אחד משני צדיו תגי דגל ו-HA. התאים המומרים הודגרו עם נוגדנים נגד HA ואנטי-פלאג. צביעה נגד HA בוצעה כדי לאשר את נוכחותו של חלבון הבדיקה המהונדס ואילו צביעת Anti-Flag בוצעה כדי לקבוע אם הוא שסוע.

כאשר אוכלוסיות משולבות לא מוכתמות נותחו על ידי ציטומטריית זרימה, ניתן היה להבחין בין אוכלוסיות משובטות על סמך ברקוד העגבניות TD, אך לא ניתן היה להבחין בערוץ ה-fite. לעומת זאת, כאשר אותן אוכלוסיות הוכתמו בנוגדנים של דגל פיט, אוכלוסייה אחת הייתה חיובית לדגל. בהתבסס על ברקוד, ניתן לזהות אוכלוסייה זו בקלות כאוכלוסייה הנושאת את מצע מעטפת ה-HIV המוטנטי שלה.

כעת, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה מאוד כיצד להשתמש בטכנולוגיית שסתום רטרו יחד עם ציטומטריית זרימה. על מנת להקים קווי תאים מקודדים גנטית פלואורסצנטיים, ארבעה יישומים ביולוגיים בפורמט מולטיפלקס, היכולת לחבר תאים מקודדים גנטית פלואורסצנטיים עם מבחנים מבוססי תאים בפורמט מולטיפלקס משפרת באופן דרמטי את יכולות התפוקה הגבוהות. לאחר יצירת קווי התאים, חשוב להקפיא אותם.

לאחר מכן מפשירים אותם מעת לעת, מנתחים אותם מחדש ומשחררים אותם בחזרה. בעוד שיצירת קווי תאים עם ברקוד גנטי פלואורסצנטי עשויה לגזול זמן בהתחלה, לאחר הקמתם, הם משפרים באופן דרמטי את יכולת החזרה והחוסן של יישומים עתידיים.