Name: אפיון פונקציונלי של Na + / H + מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: חקור אפיון פונקציונלי של מחליפי Na+/H+ תאיים באמצעות בחירת הרג פרוטונים ומדידת שחזור pH תוך-תאי. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר של תעבורה יונית בממברנת פלזמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה עמוקים לכל חברי הקהילה המדעית העובדים על pH והובלת יונים, שיצרו ושיפרו את המדידות המתוארות כאן. הם מודים במיוחד לד"ר ז'אק פויסגור, שיצר את טכניקת הברירה של הריגת H+ המשמשת כאן. הם מודים לאוניברסיטת ניס-סופיה אנטיפוליס, CNRS, ANR (JCJC SVSE1 NHEint) ו-ICST Labex על התמיכה.

1. H + בחירת הריגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יציבות transfect תאי nhe הלקויים (למשל, הקו-נגזר CCL39 PS120 תא 16) באמצעות כל שילוב של וקטור ביטוי יונקים ושיטת transfection שיפיק תשואות transfection יעילה ובחירה בשורת תאי פיברובלסטים. הערה: במשך שנים רבות משקעים סידן זרח 19 היה בשימוש עם תשואות transfection טובות. זה הוחלף לאחרונה על ידי חומרים כימיים מסחריים כגון Lipofectamine2000, transfections מתבצע הבא הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלושה פתרונות סטרילי כפי שתוארו להלן. לעקר את הפתרונים הללו על ידי סינון (0.22 מיקרומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 + פתרון Loading NH (pH 7.4) המורכב של 50 מ&quot;מ NH 4 Cl, כלוריד כולין 70 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, GL 5 מ&quot;מucose ו -15 מ&quot;מ מגבים ב- pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שטיפה (pH 7.0) המורכב של 120 מ&quot;מ כלוריד כולין, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, גלוקוז 5 מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שחזור (pH 7.4) המורכב של 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתתחיל בבחירה, להשיג תרבית תאי חממה, שניתן להשתמש ב 37 ° C ללא CO 2 נוסף ממכל חיצוני (המכונה CO 2 - חממה &quot;חופשית&quot;), כ5% CO 2 יגרום לחציצה שעלולה לפגוע ב החמצה. להגביר את שורת התאים המבטאת את nhe של ריבית עד לכ 2 x 10 8 תאים (צלחות מ&quot;מ בדרך כלל כ -20 מחוברות 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H + הריגת הליך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים המבטאים את nhe תאיים של עניין במשך שעה 1 בפתרון הטעינה, בשעה 37 מעלות צלזיוס בחממת -חינם CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הטעינה ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים בפתרון מתואר השטיפה מעל. לבצע שלב זה ביעילות לחסל Cl השייר תאי NH 4 שיפגע ביצירת מפל + NH 4 תלול שיפיק את החמצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את מדיום השטיפה על ידי שאיפה ודגירת התאים במשך שעה אחת בפתרון התאוששות שוב על 37 מעלות צלזיוס בחממה החופשית CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את ההתאוששות בינונית עם בינוני תרבות קבועה (בדרך כלל DMEM עם 7.5% FCS) ולגדול תאים בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C באווירת humidified של 5% CO 2 ו -95% אוויר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מחזור של בחירה זו פעמיים בשבוע עד שיבוטים יציבים לצוץ. הערה: קח טיפול מיוחד הנוגע לתרבות התא ותנאי בחירה. חודשים של עבודה יכולים להיות הרוסים על ידי כל זיהום שהוא נוטה יותר לoccur לאחר תקופה של תרבות ומניפולציות תא חוזרות ונשנות ארוכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, לבחור אם להגביר את השיבוטים ולאפיין אותם בנפרד כפי שתואר בסעיפים 2-3 נוסף, או בריכה אותם יחד כדי ליצור אוכלוסייה סלולרית לפני האפיון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בחירה מזדמנת (בערך פעם בשבועיים) כדי לשמר את תאי החמצה עמידה על ידי אלה שאולי חזרו לפנוטיפ החומצה רגישה ההורי (איור 1) בחירה לדלפק. </li></ol> 2. מדידות תאיים pH 2.1) הדמיה pH הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בratiometric pH רגיש BCECF הצבע / AM ניאון, שהוא רגיש pH כאשר נרגש ב 490 ננומטר והוא בעל נקודת 445 ננומטר isosbestic, הבא הפרוטוקולים של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש בבדיקות pH רגיש אחרות, הבאים הפרוטוקולים של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש con הדמיה להגדירsisting של מיקרוסקופ הפוך מצמידים את מצלמת וידאו רגישות גבוהה. לצייד את הסט הזה עם 450 ננומטר ומסנני 490 הפרעות להקת ננומטר צרים יחד עם מסננים ניטראלי צפיפות קוורץ המתאים לעירור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, השתמש בסט המתאים של מסננים ותנאי תאורה לערכי הקרינה דומים התקנה לλ1 וλ2 כך שהיחס מתקרב 1. כמו כן להימנע ערכי הקרינה בסיסיים שנקבעים גם להרוות או נמוך מדי, הן עבור λ1 ו / או λ2. זה עשוי להניב ממצאים חשובים כמו אז היחס לא היה לגילוי למרות pH תוך התאי משתנה. הערה: מערכת זו צריכה לאפשר זלוף המהיר, עירור הזמן לשגות בשני אורכי הגל הנ&quot;ל ורכישה באורך הגל המתאים הפליטה (535 ננומטר לBCECF). לצייד את המערכת עם תוכנה המאפשרת רכישה אוטומטית של נתונים ואחסון. </li></ol></li></ol> 2.2) מדידה של nhe קדימה פעילות (שחול שלפרוטונים מCytosol) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת תאים על ידי דגירה שעה 1 בפתרון NH 4 + טעינה (ראה שלב 1.4) בהעדר CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף BCECF-AM (ריכוז סופי 5 מיקרומטר) לפתרון לחמש דקות האחרונות ולאחר מכן לשטוף אותו עם NH 4 + פתרון טעינה לחסל את החללית תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר התאים במיקרוסקופ ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב. Perfuse פתרון השטיפה (ראה לעיל). התוצאה היא ירידה של הקרינה המתאימה להחמצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייצוב pH, ינקב כל הפתרונות מפורטים להלן למדוד שיעורי החלמה pH בתיווכו של Li + / H +, Na + + / H או K + / H + חליפין. כל פתרון מכיל קטיון צימוד פוטנציאל להיבדק לH + חליפין. אם אחד מאותם מועבר, זה יגרום לעלייה של הקרינה ב495 ננומטר שcorrespond להעלאה בpH התוך התאי: 120 מ&quot;מ LiCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 125 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 </li></ol> 2.3) מדידה של פעילות הפוכה nhe הערה: העיקרון כאן היא להפוך את מפל ריכוזי יונים הטרנסממברני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המדידה, לטעון את התאים עם קטיון תאיים של עניין (ראה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירתם ל5 דקות עם BCECF / AM (ראה שלב 2.2.2); לשטוף אותם, לעלות אותם במיקרוסקופ הווידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse פתרון הטעינה ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייצוב הבסיס, תמונת וריאציות pH כאשר תאי perfused עם מדיום חומציים תאי המכיל 120 מ &#39;כלוריד M כולין, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ MES ב- pH 6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעינת LiCl, דגירה תאים עבור שעה 2 בפתרון המורכב של 120 מ&quot;מ LiCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4. ליתיום תאיים שנמדד על ידי ספקטרום בליעה אטומי מניב ערך של כ -60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לNa + טעינה, דגירה תאים במשך שעות בפתרון המורכב של 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 בנוכחות ouabain 1 מ&quot;מ כדי לחסום את Na / K ATPase. בתנאים אלה, ריכוז Na + תאיים הוא בטווח של 40 מ&quot;מ. הערה: K + טעינה אין צורך כK + ריכוז cytosolic הוא בטווח של 140 מ&quot;מ ושיפוע K + כלפי חוץ מכוון לכן קל להשגה. </li></ol> 2.4) נתונים טיפול וכיול: הערה: שלב זה חל הן על המדידות קדימה לאחור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של כל ניסוי, perfuse תאים עם פתרון של 140 מ&quot;מ KCl, 20 מ&quot;מ HEPES ו -5 nigericin מיקרומטר המותאם לערכי pH בין 6.5 ו -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים כמו מדידות הקרינה מהתמונות (רמות אפורות המייצגים רמות עצימות) ויצוא תחת פורמט טקסט ולטפל כפי שיוסבר להלן באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ערכי pH תוך תאיים לכל תא או אזור של עניין באמצעות המשוואה הבאה בודדים: pH = pKa דקות + (יומן (R-Rmin) / (R מקסימום -R)) x F (λ2) / F מקסימום (λ2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדקות F (λ2) / x ma F יחס אם יש הלבנת בדיקה או דליפה, וכתוצאה מכך ירידה בקרינת 450 ננומטר ברחבי הניסויים (λ2). זה אולם מאוד לעתים רחוקות נצפה בתנאי שימוש בdesניסויי cribed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנתוני כיול נמצאים בסוף כל מדידת pH, לבדוק אם הערכים מחושבים המקבילים שונים מערכי pH המשמשים לכיול. אם זה המקרה, אז להתאים את כל ערכי ה- pH בניסוי שנקבעו לכיול באמצעות ההליך הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המנה הבאה (Q, את ההבדל בין ערכים / ההבדל נמדד בין ערכי הכיול). הכפל את כל המערך על ידי ש הפוך ההתאמה הסופית על ידי הוספה או גריעה כך שהערכים מחושבים יהיו שווים את ערכי כיול המקביל. </li></ol></li></ol> 3. מדידות של מחירים ראשוניים של NHE7 ידי מהיר Li + ספיג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על צלחות גם רב (6 עד 24 גם) ולהפוך לחומצתם או באמצעות NH 4 + טכניקת ההעמסה שתוארה לעיל או לחלופין nigericin אלבומין בסרום שור החמצה / (BSA) תיארה ב -20. </li><li&gt; צלחות לשטוף פעמיים במהירות באמצעות פתרון השטיפה-שתואר לעיל ולאחר מכן דגירה התאים בפתרונות ספיגה המכילים 1-10 ליתיום מ&quot;מ (מעט מתחת לערכי ק&quot;מ) וריכוזים הרצויים של קטיונים ו / או מעכבים של ריבית לסכום הרצוי של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על משך ספיגה קצר ועקבי (בדרך כלל דקה אחת או נמוך יותר) כדי להבטיח תחבורה הפועלת בתנאי שיעורים ראשוניים. כמו כן יש לוודא כי כל הפתרונות המשמשים לספיגה הם איזוטוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זמן הספיגה, לחסל בזהירות בינוני הספיגה ולשטוף את התאים ארבע פעמים עם פוספט קר כקרח שנאגרו (PBS). לבצע שטיפות אלה מהר ככל האפשר (פחות מ -10 שניות לארבעה מהם הוא אידיאליים) כדי למנוע זרימת ליתיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים ב- 25% חומצה חנקתית. החל 250 μl לכל טוב של 25% חומצה חנקתית ולתת לו לשבת במשך שעה לפחות 1, אז גרוטאות היטב עם כל הסוף של קצה פיפטה ולהעביר את כל ההשעיה גם במיל חדשצינור crocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב15,000 XG (טמפרטורת חדר) כדי להסיר את הפסולת התאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את תוכן ליתיום של supernatants ידי ספקטרום בליעה אטומית 21. הערה: חברות שונות מספקות ספקטרומטרים קליטה אטומיים, אשר צריך להיות מצוידים במנורת קתודה חלולה ליתיום. עקוב אחר ההוראות של היצרן מכונה אלה הם מאוד מדויקים, אבל גם די עדינים. </li></ol>

<ol><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-type+H%2B-ATPase+in+vesicular+trafficking%3A+targeting%2C+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li>
<li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway%3A+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li>
<li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li>
<li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li>
<li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li>
<li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li>
<li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation%2C+microcephaly%2C+epilepsy%2C+and+ataxia%2C+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li>
<li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li>
<li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li>
<li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+B+Neuropsychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li>
<li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+studies+in+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li>
<li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer%27s+disease+in+the+ADNI+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li>
<li>Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+primary+structure%2C+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Na%2B%2FH%2B+Exchanger+NHE7+effects+a+Na%2B+coupled%2C+but+not+K%2B+coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li>
<li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li>
<li>Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na%2FH+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenomic+Effects+of+Cisplatin%3A+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li>
<li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2%2C+NH3%2C+and+metabolic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-H%2B+exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped%2C+fluorescent+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li>
<li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBG+and+RhCG%2C+the+putative+ammonia+transporters%2C+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li>
<li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B%3A+a+new+gas+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבחור תאים לבטא תאית Na + / H + מחליפי בקרום הפלזמה מבלי לשנות הרצף הראשוני שלהם על ידי מוטגנזה מכוונת. ניתן לאפיין מחליפי האלה עכשיו. שיטה זו מבוססת על הרעילות התאית של פרוטונים תאיים כדי לבחור שורות תאים שתבטאנה Na + / H + מחליפי לפוחי בקרום הפלזמה. זה יכול להיות אפשרי, בעיקרון, לשימוש קטיונים אחרים שעשויים להיות חשוד להיות מועברים, כגון Li ...

רוב התאים תאיים להציג pH luminal חומציים, שהוא פרמטר מרכזי להתבגרות, סחר, מחזור של חלבונים או הורמונים ונוירוטרנסמיטורים טעינה. הוכח כי שיפוע pH בין תוכן cytosol ולפוחי מופק על ידי H vacuolar + ATPases 1, מצמידים את מובילי כלוריד CLC לפוחי 2. שניהם בנוק-אאוט (KO) עכברים וחולים אנושיים, את החשיבות של מובילים אלה כבר מסומן על ידי פנוטיפים הכבדים הנגרמים על ידי מוטציות בגנים שלהם 3-6. בני משפחת SLC9A מחליפי נתרן-מימן, המכונים גם NHEs לNa + / H + מחליפי, הוכח להיות effectors מפתח בpH התוך התאי ורגולצית נפח תא, כמו גם בתחבורה וקטורים שווים חומצה-בסיס על פני epithelia . חוץ מזה NHEs קרום פלזמה, שלוש שמורים ביותר Na + / H + מחליפי, 6 nhe, 7ו -9 באים לידי ביטוי ברשת טרנס-Golgi ובendosomes מוקדם 7. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם הפרעה כמו-Angelman או כריסטנסן תסמונות 8-9, אוטיזם מבוסס משפחה 10 וקשב וריכוז והיפראקטיביות 11-12. מחליפי אלה גם היו מעורבים בבעיות ניווניות כגון אלצהיימר רגישות מחלה 13 וגנים רציפים פיגור שהכלי X צמוד תסמונות 14. יחדיו, מחקרים אלה מדגישים את החשיבות של NHEs תאיים אלה בהתפתחות מוח ו / או פונקציה. הלוקליזציה תאית של מחליפי אלה מונעת מדידות מדויקות של הסלקטיביות יונם, כיוון תחבורה, פרמטרים הקינטית, ורגולציה. כמו במקרה של כל המובילים באו לידי ביטוי בתאים תאיים, שקשה מאוד להעריך פעילות ביוכימית שלהם ומכאן להבין באופן מלא התפקידים הפיסיולוגיים שלהם וmechanהאיזמים בסיס ההשלכות פתולוגיות שלהם. בהתבסס על ריכוז K + הגבוה cytosolic, ההשערה ביותר המקובלת היו שהם עובדים כמובילי פרוטון בזרימת בשילוב K +. קיומה של נזילה כזו פרוטון ששער, כפי שהוא עשוי לאזן שאיבת פרוטון על ידי V-ATPases על מנת לשמור על pH לפוחי מצב יציב. מטרת מאמר זה היא חזותי (i) להפגין שיטה המאפשרת את הבחירה הגנטית של שורות תאים המבטאות את מובילי לפוחי כזה בקרום הפלזמה שלהם, וכן (ii) להציג שתי גישות עצמאיות כדי למדוד את הפונקציות של מובילים אלה. לפני שלושה עשורים, Pouysségur וFranchi יש חלוץ גישה גנטית שאפשרה שיבוט ואפיון המולקולריים של בני משפחת nhe 15. זו התבססה על הרעילות של פרוטונים תאיים כשיטת הקרנה. הצעד הראשון היה להשיג שורות תאים לקוייםבכל בורסה + / H + Na הביע בקרום הפלזמה, באמצעות ההפיכות של טרנספורטר זה. Fibroblasts (קו תא CCL39) היה מראש עם Na + או Li + ולאחר מכן הניח במדיום תאי חומצי (pH 6.5) עבור שעה 2. זה הוביל למותם של תאים לבטא Na + / H + חילופי פונקציונליים ולבחירה של תאי antiporter לקוי (קו תא PS120) 16. כשטפח במדיום ללא יקרבונט, תאים אלה רגישים מאוד להחמצה תאית אקוטית. כתוצאה מכך, הביטוי של כל מנגנון זרימת פרוטון פונקציונלי בקרום הפלזמה ייבחר באופן חיובי (ראה 17) אם תאים אלה מוגשים לacidifications תאית האקוטי. טכניקות החמצה כזו יכולה לשמש כדי לבודד שורות תאים עם סחר בפגמים המאפשרים ביטוי בכפייה של NHEs תאית WT בקרום הפלזמה. כאוקריוטים Na + / H+ מחליפי הם electroneutral, הם לא ניתנים למדידה על ידי גישות אלקטרו שנוצלו בהצלחה רבה כדי למדוד ערוצים. כתב-יד זה ולכן מדגים כיצד למדוד את הפעילות של מחליפי זה על ידי מדידות pH תוך תאיות וקינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. כמושגי יסוד הם אותו הדבר, זה מעניין לשים לב שרבים מהתהליכים שפותחו עבור סעיף הבחירה משמשים גם ישירות למדידות פונקציונליות. מעניין, יש לנו ציינו כי פגם הסחר הנוכחי בשורות התאים שנבחרו בגישה שתוארה בכתב היד הזה מוביל לביטוי גדול יותר של חלבוני לפוחי אחרים בקרום הפלזמה כגון ערוץ אשלגן לפוחי TWIK1 18. זה מצביע על כיוון הבחירה של מנגנון פגם שימור כללי לחלבונים הטרנסממברני לפוחי. מכאן הליך בחירה זו והתאים שמייצרים מאימהווה כלי מבטיח לקהילה המדעית עובדת על חלבוני הקרום של תאים תאיים. כמו גם שיטות המדידה שהוצגו כאן עשויות להיות ישימות ללימוד מובילים שאינם electrogenic אחרים.

<table><tbody><tr>ציוד <td></td><td></td><td>תרבית תאים סטנדרטי</td><td>משמש לבחירת הרג H+ המורכבת ממכשירים רבים עם מספרים קטלוגיים שונים</td></tr><tr><td>חממה עם CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>חממה ללא מכשיר CO2</td><td>Heraeus</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים זרימה למינארי PSM1200NF</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM בינוני</td><td>סיגמא</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS זהב</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר ספיגה אטומית עם מערכת תנור זימן</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>סיגמא</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>חומצה חנקתית</td><td>סיגמא</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>סט מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td><td>Leica</td><td></td><td>מורכב ממכשירים רבים עם מספרי קטלוג שונים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אוטומטי הפוך</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr>אירועי <td>לייקה</td><td>פלואורסצנטית</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> תושבת מנוע 11504166 <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>נורית שידור LED&nbsp;</td><td>Leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ממונעת</td><td>Leica</td><td>11522068</td> 11531172 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלט מצלמה</td> 11888424 <td>Leica</td><td>11888373</td> 11507807 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישה/ניתוח תמונות</td><td>Leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>אופטיקה</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>מנורת קסנון פלואורסצנטית</td><td>Leica</td> מצלמה <td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מצלמה 8100601</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td> metafluor/Mmfluor <td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה רגישה ל-pH, BCECF-AM</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>ניגריצין</td><td>סיגמא</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון פונקציונלי של na<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

החמצת endosomal היא קריטית עבור מגוון רחב של תהליכים, כגון מחזור חלבון והשפלה, הפחתת רגישות הקולטן, וטעינת מוליך עצבי בשלפוחית ​​סינפטית. החמצה זו מתוארת בתיווכה של ATPases פרוטון, מצמידים את מובילי כלוריד CLC. מאוד-נשמרים מובילי פרוטוני electroneutral, Na + / H + מחליפי (nhe) 6, 7 ו -9 גם באה לידי ביטוי בתאים אלה. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם מחלות ניווניות קוגניטיביים ואנושיות. באופן פרדוקסלי, את תפקידם להישאר חמקמק, כמו הלוקליזציה תאית שלהם מנעה אפיון פונקציונלי מפורט. כתב יד זה מראה שיטה לפתור את הבעיה הזו. זה כולל את הבחירה של שורות תאים שעברו מוטציה, מסוגלת לשרוד החמצת cytosolic חריפה על ידי שמירת NHEs תאית בקרום הפלזמה. לאחר מכן הוא מתאר שני פרוטוקולים משלימים כדי למדוד את הסלקטיביות היון ופעילותשל מחליפי הבאים: (i) המבוסס על מדידות pH תוך תאיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו, וכן (ii) המבוסס על קינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. ניתן להסיק פרוטוקולים אלה על מנת למדוד מובילים שאינם electrogenic אחרים. יתר על כן, הליך הבחירה שהוצג כאן מייצר תאים עם הפנוטיפ פגום שימור תאיים. לכן תאים אלו יהיו גם להביע את חלבוני קרום לפוחי אחרים בקרום הפלזמה. האסטרטגיה הניסיונית המתוארת כאן עשויה לכן מהווה כלי רב עוצמה פוטנציאלית ללמוד חלבונים תאיים אחרים שלאחר מכן באו לידי ביטוי בקרום הפלזמה יחד עם לפוחי Na + / H + מחליפי המשמשים לבחירה.

בחירה: הבחירה + הורג H מבוססת על דיפוזיה של הבסיס החלש אמוניום, כמתואר באיור 1 א. ההשפעה של בסיסים חלשים ודיפוזיה חומצות על pH תוך התאי כבר חלוצה ידי וולטר בורון ומשתפי פעולה 22. הרעיון האלגנטי להשתמש בתופעה זו כדי לייצר החמצה קטלנית לבחירה גנטית חיובית אז שפותחה על ידי ז&#39;אק Pouysségur 17. תחת פרוטוקול כזה, pH התוך התאי יורד ל 5.5 לאחר שלב השטיפה. תאים שאינם מ...

החלק הראשון של מאמר זה מראה כיצד לבחור קווי תאים מוטנטיים המבטאים מחליפי Na+/H+ שלפוחיתיים בקרום הפלזמה שלהם. החלק השני מספק פרוטוקולים המבוססים על מדידות pH תוך-תאיות וקליטת יונים מהירה, המשמשים לקביעת סלקטיביות היונים והפרמטרים הקינטיים של מחליפים אלה.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את הפעילות של מחליפי נתרן-פרוטון המבטאים בתוך התא. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בחירת תאים המבטאים את מחליפי נתרן-פרוטון בתוך התא בממברנה הפלזמית באמצעות סלקציה של הרג פרוטוני (proton killing selection). כשלב שני, התאים שנבחרו עוברים חמצצת, ולאחר מכן נמדד התאוששות ה-pH התוך-תאי כדי לאשש את פעילות חילוף הנתרן-פרוטון בתאים.לאחר מכן, נמדדת הקינטיקה המהירה של הובלת היונים כדי לקבוע את קבועי הזיקה עבור הקטיון המובל והמעכבים. בסופו של דבר, ניטור השינויים ב-pH התו-תאי והקינטיקה המהירה של תאי הסומות הנבחרים מאפשרים את האפיון הפונקציונלי של חילופי החלבונים התו-תאיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי של נשאי מוטציות או שימוש בתאי per, הוא שהיא מאפשרת ביטוי של נשאי תאי-פנים מסוג wild type בממברנה הפלזמטית, מה שמאפשר למדוד את תפקודם באופן ישיר.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Mallory poet, מדענית מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורת הריגת הפרוטונים, ראשית, דגרו את התאים המבטאים את מחליף הנתרן-פרוטון התוך-תאי הרלוונטי בתמיסות טעינה בטמפרטורה של 37 °C ובאינקובטור נטול פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת. לאחר מכן, שאבו את תמיסות הטעינה ושטפו את התאים פעמיים במצע טרי.לאחר השטיפה השנייה, שאבו את המדיום והדגירו את התאים בתמיסת התאוששות באינקובטור נטול פחמן דו-חמצני. לאחר שעה נוספת, החליפו את מדיום ההתאוששות במדיום תרבית רגיל וגדלו את התאים בתנאי תרבית סטנדרטיים. חזרו על מחזור סלקציה זה פעמיים בשבוע עד להופעת קלונים יציבים לצורך דימות של ה-pH הפלואורסצנטי התוך-תאי של התאים.ראשית, הכינו מערך דימוי המורכב ממיקרוסקופ הפוך המחובר למצלמת וידאו ברגישות גבוהה, עם מסנני התאבכות בעלי פס צר של 450 nanometers ו-490 nanometers, המשולבים עם מסנני צפיפות ניטרלית של קוורץ המתאימים לעירור. במידת האפשר, השתמשו בסט המסננים ובתנאי התאורה המתאימים כדי לקבוע ערכי פלואורסצנציה דומים לערוצים 1 ו-2, כך שהיחס יתקרב לאחד, לצורך מדידת הפעילות קדימה של מחליף הנתרן-פרוטון. לאחר מכן, חמצצו את התאים באמצעות דגירה של שעה אחת בתמיסת טעינה של אמוניום.בהיעדר פחמן דו-חמצני במהלך חמש הדקות האחרונות של הדגירה, צבע את התאים באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH ביחס רציומטרי. בסיום תקופת הדגירה, שטוף את התאים בתמיסת טעינה של אמוניום כדי להסיר את הגשש החוץ-תאי, והנח את התאים הצבועים על המיקרוסקופ. בחר את אזורי העניין שבהם יימדדו ערכי הפלואורסצנציה לפי הצורך.לאחר מכן, רשמו מספר תמונות כדי לקבוע קו בסיס והזרימו לתאים את תמיסת ה-RIN כדי להחיל ירידה בפלואורסצנציה. לאחר שה-pH יתייצב, הזרימו לתאים את התמיסה הרלוונטית למדידת שיעורי ההתאוששות של ה-pH, כפי שהם מתווכים על ידי חילוף ליתיום-מימן, נתרן-מימן או אשלגן-מימן. כעת, הזרימו לתאים את תמיסת ה-hippies בתוספת פוטסיום כלוריד וגרין.לאחר מכן, אספו את מדידות הפלואורסצנציה מהתמונות וייצאו את הנתונים לתוכנת גיליונות נתונים בפורמט טקסט כדי למדוד את הקצב הראשוני של מחליף הנתרן-פרוטון. שבע, באמצעות ספיגת ליתיום מהירה, חמצצו את התאים ואת פלטות הרב-בארים בטכניקת טעינת ה-Imodium כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, שטפו את הפלטות פעמיים במהירות כפי שהודגם.לאחר מכן, דגרו את התאים בתמיסות ספיחה המכילות 1 עד 10 µM ליתיום ובריכוזים הרצויים של הקטיון או המעכבים הרלוונטיים. בסיום תקופת הספיחה, הסירו בזהירות את מדיום הספיחה ושטפו במהירות את התאים ארבע פעמים ב-PBS קר בקרח, בתוך פחות מ-10 שניות סך הכל, כדי למנוע דליפה של ליתיום. לאחר מכן, בצעו ליזיס לתאים ב-250 µL של חומצה חנקית 25% לכל באר למשך שעה אחת לפחות. גרוש את תוכן כל באר באמצעות קצה טיפ הפפיטה בסיום הדגירה והעבירו את הסספנסיות מכל באר למבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות. לבסוף, צנטריפוגו את הדגימות למשך חמש דקות ב-15,000 G בטמפרטורת החדר כדי להסיר את השאריות התאיות, ולאחר מכן מדדו את תכולת הליתיום של הנוזל העליון באמצעות ספקטרוסקופיית בליעה אטומית.על פי הוראות היצרן, סלקציית הריגה בפרוטונים מבוססת על דיפוזיה של בסיס חלש של אמוניום. לדוגמה, תאים שאינם מבטאים מחליף נתרן-פרוטון תפקודי בממברנה הפלזמית אינם יכולים להשיב ערך pH ניטרלי, ולכן מראים מראה מוחמצ טיפוסי עם צורה שטוחה וציטוזול גרנולרי, כפי שניתן לראות בתמונה מייצגת זו לאחר מחזורי סלקציה חוזרים, תאים ששרדו באופן מלא ויציב. עם זאת, ההחמצה יוצרת שיבוטים תאיים בודדים כפי שניתן לראות כאן; כפי שהודגם, ניתן לאפיין את הפעילות ואת הסלקטיביות היונית של מחליפי נתרן-פרוטון התוך-תאיים המבטאים בממברנה הפלזמית על ידי מדידת השינויים ב-pH התוך-תאי המושרים תחת תנאים ניסיוניים שונים, כפי שנצפה בגרפים אלו בעקבות החמצה על ידי טעינת Imodium.בכל הנוגע לקינטיקה של האנזים, ניתן להשתמש בתגובת המינון עבור קצבי הספיגה הראשוניים כדי לגזור את ערכי קבוע הזיקה עבור התסמינים ואת ערכי קבוע העיכוב עבור המעכבים. למעשה, מאפיין מעניין של הנשאים הוא שקטיונים מצמדים שונים יתחרו על ההובלה, מה שמאפשר למדוד את קבוע הזיקה לנתרן באמצעות תחרות עם ספיגת ליתיום, כפי שמוצג באיור זה בעקבות הליך זה. ניתן לבצע ניסויים נוספים, כגון BioInnovation של פני התא המשולב עם השתקת RNA, כדי לוודא שהנשא המדובר אכן מבוטא בממברנת הפלזמה.

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

אלקטרופורציה שימשה להחדרת חלבוני אפקטור אלימות חיידקים מטוהרים ישירות לתאים אוקריוטיים חיים. לוקליזציה של חלבונים נוטרה על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מחקרים על סחר, תפקוד ואינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חלבונים אקסוגניים פעילים, ומונעת את הצורך בביטוי הטרולוגי בתאים אוקריוטיים.

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

פרוטאוליפוזומים משמשים לחקר תעלות מטוהרות וטרנספורטרים שהוקמו מחדש בסביבה ביוכימית מוגדרת היטב. מודגם הליך ניסיוני למדידת פליטה בתיווך חלבונים אלה. מתוארים השלבים להכנת פרוטאוליפוסומים, ביצוע ההקלטות וניתוח נתונים כדי לקבוע כמותית את התכונות הפונקציונליות של החלבון המשוחזר.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

ננו-בודים הם כלים חשובים בביולוגיה מבנית ומהווים פוטנציאל גדול להתפתחות של מטיפולים. עם זאת, הבחירה של nanobodies עם תכונות מעכבות יכול להיות מאתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM) לסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרי ממברנות אלקטרוגניות.

מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקר חלבוני ממברנה אלקטרוגניים על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדיקה זו מספקת פלטפורמה לקריאה פונקציונלית של תעלות יונים מרובות המבוטאות אנדוגנית בשורות תאי אפיתל.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות של פוטנציאל ממברנה למחקר פונקציונלי בתפוקה גבוהה של שתי תעלות יונים אנדוגניות בשני קווי תאי אפיתל

חקור אפיון פונקציונלי של מחליפי Na+/H+ תאיים באמצעות בחירת הרג פרוטונים ומדידת שחזור pH תוך-תאי. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר של תעבורה יונית בממברנת פלזמה.

אפיון פונקציונלי של Na

גלה סרטונים נוספים