Name: פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: למד ליצור פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה באמצעות סיכת מינוטיה. שיטה זו מאפשרת מדידת הימוסטזה ותהליכי ריפוי פצעים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר סטיבן וילסון וליסה וילסבאכר על הדיונים המועילים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH HL054737.

הערה: נהלי שימוש בדג זברה אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי של קליפורניה בסן פרנסיסקו וועדת שימוש. 1. הכנת כלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס סיכת פרטים קטנה לבעל סיכה ומהדק את הסיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים טיפ נאה, לכופף בזהירות את קצה הפין כדי ליצור וו קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למניפולציה וייצוב של העובר במהלך פציעה, תכופף את הקצה של מד 28 ½ מחט אינץ &#39;רכובה על מזרק אינסולין באמצעות צבת מחט-האף. </li></ol> 2. הכנת עוברי דג הזברה לפגיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת זוגות רבייה דג הזברה ולאסוף ביצים במי ביצה (60ug / מלחי אקווריום מ&quot;ל) כפי שהוצג קודם 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למים ביצה כאשר הם עובר כ -8 שעות לאחר הפריה (hpf) כדי למנוע melanization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר dechorionate שתי פוסט יום הפריה (DPF) לפני הניסוי באמצעות מלקחיים טיפ נאה. <br/&gt; הערה: ניתן נפצע עוברים בכל עת לאחר שהמחזור מתחיל. הנתונים המוצגים כאן הוא עבור 2 DPF עוברים, אך הטכניקה יושמה בהצלחה בעוברים עד 5 DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העוברים עם 0.02% חומצה שנאגרו 3-aminobenzoic (Tricaine) כ 10 דקות לפני מניפולציות. </li></ol> 3. כלי מכניים פגיעה של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים בהרדמה לשקופית דיכאון בסטראו לנתח באמצעות pipet העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצד החלק הקצר של מחט המזרק כדי לתפעל את העובר עם היד הדומיננטית, למקם את העובר בצד שלה עם משטח הגחון מול מן המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הפינים הפרטים הקטנים עם הקצה מחודד ישירות על משטח הגחון של הדגים האחוריים לפתיחה ואברי המין. מקם את הפינים פרטים הקטנים בזווית קלה, כך שהקצה המעוגל הוא מסוגל לחדור מבעד periderm ישירות לוריד הזנב (איור 1 &lt;/ Strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט המזרק כדי לתפעל את העובר, לנקב את וריד הזנב עם סיכת הפרטים הקטנה על ידי הקשה על העובר לסיכה להתחבר הסיכה לתוך הווריד מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט המזרק, למשוך את העובר מפיני הפרטים הקטנים כדי ליצור קרע קטן בכלי. הערה: פגיעה מוצלחת תגרום לדימום מיידי מהווריד. </li></ol> 4. ניתוח של עצירת דימום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עוברים רק עם בעליל תאי דם להליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להתחיל את הטיימר בהקדם סיכת הפרטים הקטן היא משכה מהספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את הטיימר בהקדם איבוד דם יכול להיות דמיין מהפצע. כאשר איבוד דם מהפצע מפסיק, לעצור את שעון העצר ולהקליט זמן כולל שזמן דימום. אם הקרישה היא עכבות, להקליט את הזמן כאשר יש כבר לא נראה תאי דם במחזור. </li></ol> 5. ניתוח של ריפוי פצעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קופהבעלי חיים לא-פגיעה על מנות הדמיה זכוכית תחתונה למיקרוסקופיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רוב המים הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את העוברים ב.3-1.2% התכה נמוכה המומסים agarose במי ביצה, מחוממים לבין 42 ו -45 מעלות צלזיוס ותוספת של 0.02% Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי עמדה על צדם באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose מתקרר, למלא את הצלחת עם Tricaine 0.02% במי ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות brightfield, epifluorescence, או confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עובר מן agarose באמצעות מלקחיים ולהעביר חזרה למי ביצה. </li></ol>

<ol><li>Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGore%2C+AV+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22">Cold Spring Harb Perspect Med</a>. 2 (5), a006684(2012).</li>
<li>Boatman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+hematopoiesis+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Assaying hematopoiesis using zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).</li>
<li>Ellett, F., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+vertebrate+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+organism+to+study+development+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model organism to study development of the immune system.</a> Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).</li>
<li>Lieschke, G. J., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fish immunology.</a> Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>LeBert, D. C., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound repair.</a> Semin Immunol. , (2014).</li>
<li>Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology.</a> J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li>
<li>Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-inflicted+injury+of+zebrafish+embryonic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (71), e4351(2013).</li>
<li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-induced thrombosis in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).</li>
<li>Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fibrinogen+in+zebrafish+results+in+symptoms+consistent+with+human+hypofibrinogenemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia.</a> PLoS One. 8 (9), e74682(2013).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+zebrafish+antithrombin+III+triggers+disseminated+intravascular+coagulation+and+thrombosis%2C+revealing+insight+into+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemophilia+model+in+zebrafish%3A+analysis+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis.</a> Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+genetic+model+for+hemostasis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis.</a> J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+blood+coagulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Analysis of blood coagulation in the zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev Biol. 7, 48(2007).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).</li>
<li>Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fibrin+formation+and+platelet+and+endothelial+cell+activation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).</li>
<li>Bielczyk-Maczynska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loss+of+function+screen+of+identified+genome-wide+association+study+Loci+reveals+new+genes+controlling+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis.</a> PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

דג הזברה שימשה בהצלחה כמודל לסוגים שונים של פצעים כולל פציעת לייזר 13-15, פקקת מושרה לייזר 16, ופצע 10 אפיתל. אנו מדווחים על שיטה של פציעה מכאנית שהיא פשוט לביצוע ומייצר פציעה מבוקרת במודל in vivo כי הוא נוח מאוד למיקרוסקופיה בזמן אמת. תוצאות פציעה בתגובה לעצרת דם מהירה וניתן למדידה ותכנית תיקון פצע שחזור שניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ וידאו וtimelapse. האנטומיה שלהם פשוטה ...

דג הזברה שימש באופן נרחב לחקר מגוון נושאים בביולוגיה של כלי הדם, כולל התפתחות כלי דם, אנגיוגנזה והתפתחות המטופויאטית ופתולוגיה1-3. עוברים מפתחים מחזור דם תפקודי כמו גם לויקוציטים ומרכיבים אחרים של מערכת החיסון המולדת עד יום אחד לאחר ההפריה (dpf) 1,4,5. שימור התגובה הדלקתית והלויקוציטים לפציעה הפך את עובר דג הזברה למודל אינפורמטיבי לתהליכים דלקתיים מגוונים כמו זיהום שחפת, דלקת מעיים והתחדשות רקמות6-9. עוברי דג הזברה שימשו לחקר דלקת הקשורה לפציעה, במיוחד בהקשר של פציעת אפיתל ותגובת הנויטרופילים10,11. פגיעה בעובר גורמת לתגובה תאית שמורה מאוד מהתאים באתר הפגיעה ותאי החיסון המולדים המגויסים להגיב לפגיעה ולווסת את רזולוציה11,12. מודלים אחרים של פגיעות השתמשו בפולסי לייזר ממוקדים כדי למקם מרחבית פגיעה בסוגי תאים ספציפיים כולל נוירונים, תאי שריר וקרדיומיוציטים13-15. 
עוברי דג הזברה שימשו כמודל לחקר המוסטזיס ופקקת בתנאים של מניפולציה פרמקולוגית וגנטית, תוך שימוש בהיווצרות פקקת מכנית ולייזר16-19. נראה כי מרכיבי מפל הקרישה השתמרו היטב וטרנסגניקה אפשרה מחקרים מפורטים של שקיעת טרומבוציטים ופיברין באתר הקרישה17,20,21. הנוהל המוצג במאמר זה משלים את השיטות הללו על ידי מתן מערכת לחקר פגיעה בכלי דם מכניים וכתוצאה מכך פריצת כלי דם, היווצרות פקקת ופתרון כלי דם.

<table><tbody><tr><td>Minutia Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>קוטר קצה 0.0125 מ"מ, קוטר מוט 0.1 מ"מ</td></tr><tr><td>מחזיק סיכות</td><td>Fine Science</td><td>Tools 26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים עם קצה עדין</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקע שקופית</td><td>אקולוגית מימית</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>נמוכה נמס אגרוז</td><td>לונזה&nbsp;</td><td>50081</td><td>מחומם מראש ל-42 &ordm; C</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>כלי הדמיה תחתונים</td><td>מזכוכית Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>אולימפוס</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>מלחי</td> אקווריום Zeiss <td>Axio Observer</td><td></td></tr> מזרק אינסולין <tr><td></td><td>אוקיינוס</td><td></td><td></td>מיידי</tr><tr><td>עם מחט 28.5 גרם</td><td>בקטון דיקינסון&nbsp;</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

עוברי דג הזברה (Danio rerio) הוכיחו את עצמם כמודל רב עוצמה לחקר מגוון תהליכי התפתחות ומחלות. התפתחות חיצונית ושקיפות אופטית הופכים את העוברים הללו למתאימים במיוחד למיקרוסקופיה, וקווים טרנסגניים רבים המתייגים סוגי תאים ספציפיים עם חלבונים פלואורסצנטיים זמינים, מה שהופך את עובר דג הזברה למערכת אידיאלית להמחשת האינטראקציה בין סוגי תאים כלי דם, המטופואטיים ואחרים במהלך פציעה ותיקון in vivo. גנטיקה קדימה ואחורה בדגי הזברה מפותחת היטב, ומניפולציה פרמקולוגית אפשרית. אנו מתארים מודל פגיעה מכנית בכלי הדם באמצעות טכניקות מיקרומניפולציה המנצלות כמה מהתכונות הללו כדי לחקור תגובות לפגיעה בכלי הדם כולל המוסטזיס ותיקון כלי דם. באמצעות שילוב של וידאו ומיקרוסקופ זמן-lapse, אנו מדגימים כי שיטה זו של פגיעה בכלי הדם מביאה לתגובות מדידות וניתנות לשחזור במהלך המוסטזיס ותיקון פצעים. שיטה זו מספקת מערכת לחקר פגיעה ותיקון כלי דם בפירוט במודל של בעל חיים שלם.

פגיעת כלי מכאנית בוצעה על 2 DPF עוברים (איור 2 א - ג). תוצאות פציעה בתגובת קרישה מהירה ואמינה, כפי שנמדדו על ידי זמן הפסקת דימום (איור 2 ד). כדי לקבוע אם או לא הבדלים בתגובת הקרישה ניתן היו למדוד, הירודין נוגד הקרישה היה מנוהל לעוברים על ידי הזרקה לתוך Duct של קיביה מייד לפני פציעתם (5-10 NL של יחידה 1 לμl הירודין מומס במים) (ל הפגנה של זריקות לDuct של קיביה, ראה מאמר יופיטר קודם 23) 24. הממשל של הירודין לפני פציעה גרם ...

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פגיעה מכנית בכלי דם בעוברי דג זברה. מודל פציעה זה מספק פלטפורמה לחקר המוסטזיס, דלקת הקשורה לפציעה וריפוי פצעים באורגניזם המתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה בזמן אמת.

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא ליצור פגיעה מכנית בכלי דם בעוברים של דגי זברה. הדבר מושג על ידי דקירה של הווריד המרכזי (coddle vein) של עובר דג הזברה באמצעות סיכה דקה. לאחר מכן, מוערכת ההמוסטזיס על ידי מדידת משך הזמן שבו דם זורם באופן פעיל מהפצע.לאחר מכן, מבוצעת מיקרוסקופיה של צילומי רצף (time lapse microscopy) כדי להמחיש היבטים של ריפוי פצעים, כגון תיקון כלי דם. התוצאות מראות כי ניתן להשתמש בפגיעה מכנית בכלי דם בעוברים של דגי זברה כדי למדוד באופן הדיר באופן עקבי היבטים של המוסטזיס ותיקון פצעים, כגון זמני דימום והזמן הדרוש להחזרת זרימת הדם. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני עכברים ומודלים סטנדרטיים אחרים של פגיעה הוא שבעובר דג הזברה, ניתן להמחיש בקלות דלקת, המוסטזיס ותיקון באמצעות מיקרוסקופיה בזמן אמת.בתחילה, הכניסו סיכת מינוטיה למחזיק סיכות וקבעו את הסיכה באמצעות פינצטה עדינה. כופפו בזהירות את קצה הסיכה כדי ליצור וו קטן לטיפול בעובר ולייצבו במהלך הפגיעה. השתמשו בפלייר שפיץ כדי לכופף את קצהו של מחט במידה 28 ובאורך חצי אינץ', המורכבת על מזרק אינסולין.בשלב הבא, הכינו עוברים של דגי זברה על ידי הקמת זוגות רבייה ואיסוף ביצים לתוך מי ביצים (egg water) כפי שהודגם בעבר. כאשר העוברים מגיעים לגיל שמונה עד 24 שעות לאחר ההפריה (HPF), הוסיפו PTU למי הביצים כדי למנוע פיגמנטציה ביום השני לאחר ההפריה (DPF). השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר את מעטפת הביצה (dechorionate) מהעוברים והרדימו את העוברים באמצעות ריכוז סופי של 0.02% Buffered trica לפני פגיעה מכנית בכלי הדם העובריים.השתמשו בפיפט העברה כדי להניח עוברים הרדומים על תבנית עם שקעים (depression slide). בעודכם נשענים על מיקרוסקופ דיסקציה עם הצד הקצר והשטוח של מחט מזרק ביד הדומיננטית, מקמו את העובר על צדו כך שהבטן פונה הרחק מהמחט. כעת מקמו את סיכת הדיוק (minutia pin) כך שהקצה שלה יפנה ישירות אל הבטן של הדג, אחורי הפתח העורגניטלי.החזיקו את הכלי בזווית קלה, כך שהקצה המעוקל יוכל לחדור דרך הפרידרם ישירות אל וריד ה-coddle. לאחר מכן, השתמשו במחט המזרק כדי למניפולציה של העובר. השתמשו בסיכת מיניאטורה כדי לנקב את וריד ה-coddle, על ידי טפיקה של העובר אל תוך הסיכה, כדי לתקוע מעט את הסיכה בתוך הווריד בעזרת מחט המזרק.משכו את העובר הרחק מסיכת המינוטיה כדי ליצור קרע קטן בכלי הדם. פגיעה מוצלחת תגרום לדימום מיידי מהוריד. עבור הליך זה, בחרו רק עוברים עם תאי דם הנראים בזרימה.כאשר סיכת המינוטיה (minutia pin) במקומה, שלפו אותה מהכלי וברגע שניתן להבחין באיבוד דם מהפצע, הפעילו טיימר. כאשר איבוד הדם מהפצע נפסק, עצרו את הטיימר ורשמו את הזמן הכולל כזמן דימום; אם הקרישה מעוכבת, רשמו את הזמן שבו אין עוד תאים במחזור הדם הנראים לעין. העבירו את בעלי החיים לאחר הפציעה לצלחות דימוג בעלות תחתית זכוכית לצורך מיקרוסקופיה, והסירו את רוב מי הביצים, ולאחר מכן כסו את העובריים ב-0.3 עד 1.2% low melting agarose המועשר ב-0.02% trica וחומם לטמפרטורה שבין 42 ל-45 degrees Celsius.השתמשו בפינצטה כדי למקם את העוברים על צדדיהם. לאחר שה-aro יתקרר, מלאו את הצלחת ב-0.02%trica במי ביצים (egg water). השתמשו במיקרוסקופיה של שדה בהיר (brightfield), פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית או מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לרכוש תמונות לאחר הדמיון.השתמשו בפינצטה כדי להעביר את העוברים בחזרה למי ביצים. סרטון זה מציג פגיעה מכנית בכלי דם שבוצעה בעובר PF דו-ממדי. ניתן לראות איבוד דם פעיל ואחריו הפסקה של הדימום; הפגיעה גורמת לתגובת קרישה מהירה ואמינה, כפי שנמדד לפי הזמן עד להפסקת הדימום, כדי לקבוע אם ניתן למדוד הבדלים בתגובת הקרישה.הנוגד קרישה odin ה diberikan לעוברים באמצעות הזרקה לתעלת QVA מיד לפני הפגיעה. כפי שמוצג כאן, התרופה האריכה באופן משמעותי את זמני הדימום בהשוואה לבקרת הווקטור (vehicle control). בסרטון זה, ניתן לראות עדות לנזק לכלי דם ולקרישה מיד לאחר הפגיעה, תוך שימוש בקווי טרנסגניים עבור סמנים של תאי אנדותל ותאי דם אדומים.תמונות נרכשו מדי חמש דקות לאורך תקופה של 12 שעות, המציגות את השלבים השונים של תיקון הפצע. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו גורמים לפגיעה מכנית בעוברים של דג הזברה.

mechanical-vessel-injury-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

השיטה שהוצגה כאן מהווה פגיעה המדויקת של עוברי דג זברה לחיות עם פעימות ליזר באנרגיה גבוהה ועל ניתוח בדיעבד של פגיעות אלה וההתאוששות שלהם עם זמן. אנו גם מראים איך שכותרת גנטית בודדה או קבוצות של תאי שריר שלד יכולות להיות במעקב בזמן ואחרי ניזק מושרה אור ליזר.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

המטרה של פרוטוקול זה היא לפרט את השיטה החדשנית להערכת תפקוד הלב הסגור של הדגים העובריים תחת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים.

ניתוח הזחה של אוטם שריר הלב מכני (יהלום) חושף Segmental של תפקוד הלב של מעובריים בדג

שינינו את מודל ירידה במשקל של מרמארו לדגי זברה בוגרים כדי לבחון רוחב של פתולוגיות בעקבות פגיעה מוחית טראומטית בוטה (TBI) והמנגנונים שבבסיס ההתחדשות העצבית שלאחר מכן. מודל TBI קהה זה הוא מדרגי, מעורר TBI מתון, בינוני או חמור, ומשיב הטרוגניות פציעה שנצפו ב- TBI האנושי.

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

מתוארת שיטת הזרקה תוך-צפקית חדשה (IP) בדגי זברה בוגרים. בעת טיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הליך זה יעיל יותר משתי שיטות ה- IP שדווחו בעבר. הטכניקה תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל במודל דגי הזברה.

טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית

פרוטוקול זה מתווה שיטה להשתלת חרוז מגנטי בלב דג הזברה המתפתח באמצעות מיקרו-כירורגיה, המאפשר מניפולציה של כוחות מכניים in vivo והפעלת זרם סידן תלוי גירוי מכני בתאים אנדוקרדיאלים.

מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.

הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי

למד ליצור פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה באמצעות סיכת מינוטיה. שיטה זו מאפשרת מדידת הימוסטזה ותהליכי ריפוי פצעים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

גלה סרטונים נוספים