אימות של Nanobody ונוגדנים מבוסס In vivo ניסויי גידול xenograft NIRF הדמיה בעכברים באמצעות Ex Vivo Cytometry הזרימה ומיקרוסקופי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים לביצוע אימות ex vivo של ניסויי הדמיה פלואורסצנטיים קרובים לאינפרא אדום בעכברים באמצעות ננו-גופים מתויגים פלואורופור ונוגדנים קונבנציונליים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע אימות ex vivo של ניסויי הדמיית קסנוגרפט פלואורסצנטיים באינפרא אדום בעכברים באמצעות ארבעה גופי ננו מסומנים או נוגדנים קונבנציונליים. זה מושג תחילה על ידי מתן פלואורו קרוב לאינפרא אדום, ארבעה נוגדנים ספציפיים לאנטיגן מסומנים ונוגדנים קונבנציונליים לעכברים הנושאים קסנוגנים חיוביים ושליליים כאחד. השלב השני הוא ביצוע הדמיה in vivo.

לאחר ההדמיה, העכברים מוקרבים כדי להסיר את הקסנוגרפטים, המעובדים לאנליזות ex vivo. בסופו של דבר, ציטומטריית זרימה ex vivo ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשות לאימות תוצאות הדמיה in vivo. היתרון של שיטה זו על פני שיטות קיימות כמו הדמיה גרעינית, הוא שהשימוש בצבע פלואורסצנטי קרוב לאינפרא אדום מאפשר השוואה מקיפה של הדמיה רב-מודאלית במבחנה, in vivo ו-ex vivo עם בדיקה בודדת לציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית והדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדמיית הגידול, כגון מיקום גרורות במהלך ניתוח ומעקב אחר יעילות הטיפולים האנטי-גידוליים. תיוג הנוגדנים בכוח פלואורו מאפשר כימות מדויק ex vivo של נוגדנים הקשורים לתא. זה מאפשר לנו להבחין אם סינגלים ספציפיים שאנו רואים in vivo נובעים מנוגדנים, קשורים לאנטיגנים על פני התא, או לא ספציפיים בגלל מה שנקרא אפקט החדירות והשמירה המשופרים.

שבעה עד תשעה ימים לאחר הזרקת תאי הגידול כאשר הגידולים צריכים להיות בקוטר של כשמונה מילימטרים. מוכנים לדמות את העכברים תחילה, למרוח משחת עיניים ולאתחל את מערכת ההדמיה. לאחר מכן מקם את העכברים המורדמים על הבמה המחוממת כשהגידולים שלהם מכוונים למצלמה.

שמור על 1% עד 2% ISO פלואור למשך הליך ההדמיה באמצעות סעפת האיזוף פלואור הממוקמת בתא ההדמיה. עקוב אחר קצב הנשימה. אם יש כאלה מהירים מדי, אז ההרדמה קלה מדי, ואם היא איטית או לא סדירה, אז ההרדמה עמוקה מדי.

לאחר מכן דמיין את העכברים לאחר קבלת תמונת הבסיס. הזרקו לעכברים 50 מיקרוגרם של LOR שישה 80 מבני נוגדנים מסומנים. עשו זאת בנפח של 200 מיקרוליטר מלח לווריד הזנב.

לאחר הדמיה, המתת חסד של העכבר והרכיב אותו על גוש קלקר ונקה אותו עם 70% אתנול. לאחר מכן חתכו את העור כדי לחשוף את הגידולים. הסר את הגידולים בעזרת אזמל ושמור על הגידולים שלמים.

לאחר ההסרה, חתכו את הגידולים לשניים והעבירו מחצית לצלחת של תמיסת P-B-S-A-E-B-S-F על ICE לניתוח פקס והעבירו את החצי השני לקר פעמיים, 4% PFA לאימונוהיסטוכימיה. לאחר 24 שעות בקיבוע בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הגידולים ל-PBS עם 30% סוכרוז ושמרו אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שהם שקעו לחלוטין בתמיסה. לאחר מכן חותכים את הגידולים לקוביות שישתלבו בתבניות קריו.

ממלאים את התבניות בתרכובת OCT ומעבירים את גושי הגידול לתבניות. הרקמה חייבת להיות שקועה במלואה ב-OCT. לאחר מכן מעבירים את תבניות הקריו לקרח יבש וכשהם קפואים לחלוטין, מאחסנים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לעבד אותם.

כדי להכין את התאים, העבירו את חצי הגידול לתא, מסננים במסננת. חותכים אותו לשלוש עד ארבע חתיכות, ואז מוציאים את הבוכנה ממזרק של שני מיליליטר ומשתמשים בבוכנה כדי לרסק את הרקמה כנגד המסננת. אסוף את התמיסה הזורמת דרך המסננת לאחר ריסוק הרקמות, שטוף את המסננת עם PBS.

לאחר מכן העבירו את המתלה שנאסף לצינור חדש וסובבו אותו ב-500 גרם למשך חמש דקות. אנו משעים את גלולת התא ב -10 מיליליטר PBS עם 0.2% BSA. לאחר מכן ספרו את התאים ב-1 עד 5 מיליון תאי לימפומה לצינור פקס של חמישה מיליליטר, וסובבו את הצינור ב-500 גרם והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן השעו את התאים ב -100 מיקרוליטר PBS עם 0.2% BSA. בשלב זה, ניתן לחסום FCR באמצעות נוגדן לקשירת FC gamma R.המתן 10 דקות ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS עם 0.2% BSA. כעת הוסף נוגדן חד שבטי נגד CD 45 כדי לזהות את הלויקוציטים.

דגרו על התאים במשך 20 דקות בחושך עם נוגדן זה, ולאחר מכן השתמשו בשתי שטיפות כדי להסיר אותו ממש לפני ניתוח הפקס. צבעו את התאים בפרופידיום יודיד למשך 15 דקות על קרח כדי לזהות תאים מתים. לאחר מכן שטפו אותם עם PBS רגיל.

עקוב אחר זה על ידי Resus השעיית התאים ב -150 מיקרוליטר של PBS והמשך את העובדות. לעכברים הוזרקו 50 מיקרוגרם של גוף ננו ונוגדנים חד שבטיים כדי להעריך את הספציפיות של המבנים המסומנים בפלואורסצנט. להדמיה in vivo.

כל ההדמיות בוצעו שש שעות לאחר זרימת ההזרקה. ניתוח ציטומטרי של תרחיפי תאי גידול הראה תיוג ספציפי של תאי גידול חיוביים לאנטיגן עם שני צימודי AF שישה 80. לא היה תיוג לא ספציפי של תאים שליליים לאנטיגן עם אף אחד מהמבנים.

הגידול. קטעי קריו הראו תיוג חזק וכמעט הומוגני של תאים חיוביים לאנטיגן עם גוף הננו. עם זאת, הנוגדן החד-שבטי נתן אנטיגן הומוגני חלש בהרבה כצפוי.

גידולים שליליים לא הראו צביעה של הנוגדן, גידולים שליליים הראו צביעה מפוזרת לא ספציפית בחלל הבין-תאי לאחר הזרקת הנוגדן הקונבנציונלי. זה היה דומה מאוד לסצנת הצביעה באנטיגן. גידולים חיוביים לאחר הזרקת הנוגדן הקונבנציונאלי לאחר שליטה.

ניתן לבצע את חלק ההדמיה של טכנולוגיה זו ביום אחד לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תיוג רדיו של גופי ננו על מנת לחקור את ההפצה הביולוגית של המצומדים המוזרקים לרקמות שונות או שאלות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע אימות מולטי-מודאלי ex vivo של חווית ההדמיה הקרינה שלך in vivo, קרוב לאינפרא אדום עם בדיקה עם תווית פלואורו ארבע.

בכך מספק לך טכניקה להערכת מבני נוגדנים חדשים להדמיה מולקולרית פרה-קלינית.