Name: חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו את שיטת NAME לזיהוי מהיר של מעכבי חלבון ה-nucleocapsid של HIV-1 באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילמיד. פרוטוקול זה מאפשר גילוי תרכובות המעכבות פעילות chaperone ללא צורך בסימון רדיואקטיבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) ועל ידי MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

<ol><li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li>
<li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+functions%2C+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li>
<li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li>
<li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features%2C+processing+states%2C+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleation%2C+reverse+annealing%2C+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li>
<li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li>
<li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li>
<li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li>
<li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li>
<li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li>
<li>Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA%2FDNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li>
<li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization%2C+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+Protein%3A+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22MedChemComm%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li>
<li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones%3A+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Chemmedchem%22%5BJournal%5D)">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li>
<li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li>
<li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+RNA+chaperone+proteins%3A+from+functions+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li>
<li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li>
<li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li>
<li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li>
<li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

NAME הוא assay המאפשר להעריך את העיכוב של פעילות המלווה של חלבון nucleocapsid של HIV-1, יעד מעניין בחיפוש של תרופות נגד HIV רומן במהירות. NC anneals מהיר ובחומצות גרעין טמפרטורת חדר שיציבה מתקפל אחרת דורש denaturation התרמי בטמפרטורה גבוהה ואחרי חישול זהיר. Assay יכול להתבצע עם או באורך מלא NC או עם המקוצץ (12-55) NC: בשני המקרים שתי חומצות גרעין (RNA ועותק DNA משלים) הן מרותקים במהירות. זה עולה בקנה אחד עם תצפית ספרות עם פפטיד NC הקטוע: חישול הוא ביוזמת ההיתוך היעילה של הגזע של cTAR אחרי אינטראקציה של הלולאה שלה משלימה הפסגה, שהוא אתר NC חלש מחייב, עם הרצף המשלים של לולאת פסגת TAR, ובסופו דרך כמה ביניים יציבים להוארך היברידי המרותק. 21 NC הוא prot יציב מאודעין וכמה בעיות בעת ביצוע NAME יכולים להתרחש. זה מאוד חשוב עם זאת להוסיף SDS טרי בטעינת ג&#39;ל המאגר משמש כדי לעצור את התגובה: אם זה לא יושג, ג&#39;ל לא יציג את להקות חומצות גרעין בעמדות הנכונות. למעשה, NC הוא חלבון חומצת גרעין מחייב, כך שכדי לחזות בצורה נכונה TAR / heteroduplex cTAR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה SDS חייב להיות נוכח בטעינת ג&#39;ל המאגר לפגל החלבון ולשחרר אותו מהמתחם ההדוק שלה עם חומצות הגרעין. זהו גם פתרון בעיות אפשריות של הניסוי, כלומר ההיווצרות של להקות השתנו בזמן ריצת ג&#39;ל. השפעה זו בולטת במיוחד כאשר באורך המלא NC הועסק, כמו באיור 2, והוא צמוד לנוכחות של הזנב N-terminal הבסיסי ביותר, שיש לו השפעה חזקה על צבירת חומצות גרעין. הנוכחות של הזנב הבסיסי המסוף הופכת את תגובת חישול יותר קשה להיות מעוכבת, כתכניתn באיור 3 מתחם באמצעות 1, intercalator השחלה נציג, כלומר intercalator יעיל במיוחד בייצוב מבני גזע הלולאה של TAR ושל cTAR. למעשה, זה סוג של אינטראקציה עם חומצות גרעין הוא מועדף כאשר בליטות ולולאות לקטוע את רצף הסליל הכפול, המאפשרים להשחלה קלה יותר של מתמירים מגושמים לזוגות הבסיסים. ייצוב של TAR וcTAR ידי קלסרים חומצות גרעין אלה נותח בעבר על ידי קביעת העלייה בטמפרטורת ההתכה של שני oligonucleotides. 14 יתר על כן, העלייה בטמפרטורת התכה בקורלציה עם העיכוב של חישול זרז על ידי HIV-1 NC, הבא להקמתה המופחתת של TAR / cTAR heteroduplex ומצביע על כך שintercalators השחלה היא כיתה מעניינת של קלסרים עבור מבנים דינמיים של RNA כגון אלמנט TAR. 14 מנגנון פעולה מופעל על compo אלהunds ניתן תוקף נוסף על ידי ביצוע assay NAME בפורמטים חלופיים שונים, כפי שמוצג באיור 4: במקרה של intercalators העיכוב של heteroduplex המרותק מוגבר כאשר התרופה הודגרו עם שני oligos המקופל. תרכובות הפועלות במנגנון פעולה שונה, כגון קלסרים ישירים של חלבון NC, תהיה מושפעות פחות מהמצב preincubation שונה. assay שם מבוצע בשתי השיטות ולכן יכול לשמש מסך ספריות של תרכובות לזיהוי מעכבי NC, וגם להעריך את המנגנון המשוער של פעולה של הלהיטים החיוביים תוך חיפוש התרופות נגד HIV הממוקדים בNC. ברור, השימוש בטכניקות אלה לבד כאשר הטענה למנגנון ספציפי של פעולה של מעכבי NC מזוהים אינו מספיק, ויש צורך במבחנים ביוכימיים מתאימים אחרים כדי לקיים את נחת העבודה. 14 לבסוף, יש להדגיש כי שם משתמש ביותראנזימים מטוהרים, או רקומביננטי או סינטטיים, מתן מידע יקר על עיכוב &quot;במבחנה&quot; של NC על ידי התרכובות נבדקו. זהו &quot;הכוח והחולשה&quot; של assay: שם יכול גם להשלים הקרנה וירטואלית והדמיה מולקולרית מתקרבת בצעדים הראשוניים של תוכניות גילוי תרופות, המאפשרת לבנות במהירות ולנתח מערכות יחסים מבנה-פעילות וסופו של דבר הפניית עיצוב הסינתזה וסמים. עם זאת, כפי שמבחני ביוכימיים אחרים המשמשים בפרויקטים לפיתוח תרופות בHIV, NAME לא נותן מידע על ההשפעות של מעכבים משוערים בתאים נגועים בנגיף.

חלבון nucleocapsid NCp7 (NC) מסוג וירוס הכשל החיסוני אנושי 1 (HIV-1) הוא חלבון קטן, בסיסי הקשור באופן הדוק עם RNA הגנומי בווירוס המדבק הבוגר, ששיחק תפקיד מרכזי בתרבות נגיף כקו-פקטור בשעתוק לאחור , הכרת הגנום, ואריזה. 1-3 NC פועל כמלווה חומצות גרעין מזרזות היציבות של מבני חומצות גרעין יציבים והחישול של רצפים משלימים. פעילות חומצות גרעין צבירתה מתגוררת בעיקר בחומצות אמינו 11 תחום N-terminal תוך פעילות ערעור יציבות דופלקס כבר ממופות למבנים שלה אבץ אצבע (12-55 פפטיד). 4 החלבונים הטעונים חיובי מוריד את המחסום אלקטרוסטטי של תגובת חישול ו מגביר את הקצב שבו שני רצפים משלימים נפרדים לבוא ביחד. חומצות גרעין המקופלות בקונפורמציה היציבה דורשות פעילות המלווה של NC לfacilitatדואר חישולם 5 הדבר חשוב במיוחד בשעתוק לאחור, שבי NC הוא קריטי באירועי העברת גדיל:. בהעברת גדיל מינוס, DNA תחנת גדיל מינוס, רק retrotranscribed, יש להעביר ומרותק לרצף משלים באזור R בסוף 3 &#39;של הגנום RNA תבנית. 6 למרות שהעדיפו thermodynamically, תגובה זו אינה מתרחשת באופן נרחב בהעדר NC בשל נוכחותם של המבנה היציב של האזור מגיב הפעלת טרנס RNA (TAR) באזורי R, שחייב להיות משויך לעותק ה- DNA שלו (cTAR DNA). 7 אזורי cTAR וTAR הם, למעשה, מובנים מאוד עם קונפורמציה גזע לולאה אופיינית. חלבון NC denatures סיכות אלה, ומקדם העברת מינוס גדיל על ידי הגדלת שיעור חישול מולקולאריים בין גדילי חומצות גרעין המשלימים. המנגנון של חישול NC של TAR וcTAR נחקר ביסודיות ודהscribed כassay חישול TAR בכמה עבודות מחקר והתכנית המוצעות מתוארת בביקורות מצוינות. 8-11 בסיכום, NC מערער את המבנה השניוני של רנ&quot;א היציב כמו TAR-RNA, מערער את המבנה המשני של הרצף משלים, cTAR-DNA שלה , ומקדם את תגובת חישול של RNA / DNA הובילה לTAR / היווצרות heteroduplex cTAR. 10,11 כתוצאה מכך, צעד גדיל-העברה בעת שכפול HIV הוא מועדף. 12 NC הוא יעד אטרקטיבי לפיתוחם של חומרים חדשים מאז ההפרעה האפשרית הנגרמת על ידי מולקולות קטנות לכיוון צפון קרוליינה הייתה לגרום לירידה של השעתוק לאחור של הגנום הנגיפי כתוצאה מפעילות NC התפשרה. 2,13 יכלו גישה זו סופו של דבר להוביל לפיתוח של תרופות אנטי-HIV מוצלחים. במהלך הקרנה לNC מעכבי 14 פיתחנו assay להסתמך על התכונות הידועותשל nucleocapsid לערער את היציבות ביעילות ובoligonucleotides המשלים לחשל. 10,11 אנחנו קראנו לזה N ucleocapsid M nnealing- ediated lectrophoresis assay E (שם). assay NAME משתמש NC לתווך בין חישול עותקים ביציבות מובנה של חומצות גרעין משלימות, במקרה של oligonucleotide המתאים לחלק הפסגה של רצף TAR-RNA עם הרצף שלה משלים DNA (cTAR) להניב TAR ההיברידי / heteroduplex cTAR . הניתוח של TAR / תגובת חישול cTAR בנוכחות NC יכול להיחקר על ידי אלקטרופורזה יליד ג&#39;ל polyacrylamide (עמוד). פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע assay שם כדי לחשל במהירות בטמפרטורת חדר oligonucleotides המקופל במבני סיכת ראש יציבים, כיצד לנתח את התוצאה של התגובה ופתרון בעיות אפשריות של הניסוי. תיוג הרדיואקטיבי של חומצות גרעין לא ביקש, וdetectiעל להקות oligonucleotide יכול להתבצע על ידי שיטות צביעה קונבנציונליות. Assay, שמעסיק גם את החלבון באורך מלא רקומביננטי או גרסה סינתטית קטועה של NC, מאפשר זיהוי של intercalators השחלה עיכוב NC, פעילות במיתאם עם חזק מחייב לRNA ו- DNA. 14

<table><tbody><tr><td>cTAR, 29-mer DNA אוליגו. מותפל. HPLC מטוהר</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>מאחסנת את פתרון המלאי&nbsp; ב-20 מעלות; C&nbsp;</td></tr><tr><td>TAR, 29-mer RNA oligo. מותפל. HPLC מטוהר.&nbsp; &nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>מאחסנת את מחיר המלאי ב-80 מעלות; C&nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55) פפטיד NC</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>אחסן את תמיסת המלאי ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>שפופרות 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>שפופרות 0.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>טיפים לסינון ביוספרה 0.1-10 ומיקרו; l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסינון ביוספרה 2-20 ומיקרו; l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסינון ביוספרה 200&nbsp; ומיקרו; l</td><td>מסנן מזרק Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>0.22&nbsp; ומיקרו; m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>קרלו ארבה</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0252-2.5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic חומצה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום פרכלורט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>222283-100G</td><td>אחסן את 1&nbsp; פתרון M ב-20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>GE בריאות מדעי החיים</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>הכן את תמיסת 10% טרי לפני השימוש</td></tr><tr><td>תמיסה מוכנה לשימוש Acrylamide-bis 40% (19:1)</td> <td>Merck Millipore</td><td>1006401000</td><td>Polyacrylamide הוא נוירוטוקסיק מאוד: ללבוש כפפות במהלך יציקת הג'ל</td></tr><tr><td>Tris ultrapure</td><td>Applichem</td><td>A1086, 1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC מים מטופלים</td><td>אמביון</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22,621,408</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרומטר</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר UV-VIS למבדה 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח בסיסי PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II RNA ג'ל מכתים</td><td>לונזה</td><td>50523</td><td>בצע את הדילול של 1/10,000 ב-TBE 1x. אחסן אותו בחושך ב-4&nbsp; &deg; C למשך שבועיים.</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה Geliance 600</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חישול בתיווך nucleocapsid אלקטרופורזה (name) assay מאפשר זיהוי המהיר של hiv-1 nucleocapsid המעכבים

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA או DNA המקופל בקיפול tridimensional היציב הם מטרות מעניינות בפיתוח אנטי-סרטני או תרופות אנטי. במקרה של HIV-1, חלבונים נגיפיים המעורבים בוויסות של פעילות הווירוס מזהים כמה חומצות גרעין. חלבון nucleocapsid NCp7 (NC) הוא חלבון עיקרי המסדיר כמה תהליכים בעת שכפול וירוס. NC הוא למעשה מלווה לערער את יציבות מבנים משניים של RNA ו- DNA והקלת חישולם. איון של NC הוא גישה חדשה ומעניין ליעד טיפול אנטי HIV. N ucleocapsid M nnealing- ediated lectrophoresis E assay (שם) פותח כדי לזהות מולקולות מסוגלת לעכב את ההיתוך וצריפה של RNA ו- DNA המקופל בתצורות tridimensional יציבים thermodynamically, כגון מבני סיכת ראש של TAR ואלמנטי cTAR של HIV, על ידי חלבון nucleocapsid של HIV-1. הבדיקה החדשה מעסיקה או מחדשcombinant או החלבון הסינתטי, וoligonucleotides ללא הצורך בתיוגם הקודם. ניתוח התוצאות מושגת על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית ג&#39;ל polyacrylamide (עמוד) ואחריו מכתים חומצות גרעין קונבנציונלי. הפרוטוקול דיווח בעבודה זו מתאר כיצד לבצע assay שם עם החלבון באורך מלא או הגרסה המקוצצת שלה חסרת תחום N-terminal הבסיסי, שני מוסמכים כמלווי גרעין חומצות, וכיצד להעריך את העיכוב של פעילות מלווה NC על ידי השחלה intercalator. יתר על כן, שם יכול להתבצע בשני מצבים שונים, שימושי כדי לקבל אינדיקציות על המנגנון המשוער של פעולה של מעכבי NC המזוהים.

איור 1 מציג תוצאת נציג assay Nucleocapsid חישול המתווכת אלקטרופורזה (שם), שבוצע i) עם חלבון רקומביננטי באורך מלא, ii) ללא חלבון, כלומר ערבוב cTAR + TAR ודוגר עד השעה 1 בRT, וiii ) אותו assay הופיע עם (12-55) NC, פפטיד סינטטי חסר 11 חומצות אמינו של תחום N-terminal. (נתיבים מרכזיים TAR-מקופל מראש וcTAR היו מעורבים והיווצרות של TAR heteroduplex המרותק / cTAR הייתה פיקוח בנוכחות NC רקומביננטי באורך מלא (נתיבים שמאליים של איור 1), בהעדר החלבון באיור 1 ), ובנוכחות של (12-55 פפטיד NC) (הנתיבים הנכונים מקוצצים באיור 1). פקדים: מקופלים cTAR, מקופל TAR, ומרותק היברידיים (TAR / cTAR), שהושגו באמצעות denaturation התרמי של המבנים המקופלים ביציבות של TAR לcTAR אחרי annealin האיטי שלהםז. 14 היכולת של NC לפגל שני רצפי חומצות גרעין יציבים לסליל heteroduplex האריך בבירור: חלבון NC באורך מלא מוביל מייד להיווצרות של TAR / היברידי cTAR: 0 &#39;מציין את הזמן המינימלי שעובר בין תוספת של NC ל דוגמאות ותוספת של חיץ טעינת ג&#39;ל, אשר עוצר את התגובה; היווצרות מלאה כבר הושגה לאחר 15 זמן דגירה &quot;. העלייה בעוצמת heteroduplex המרותקת מקבילה לירידה בעוצמת oligonucleotides cTAR וTAR המקופל. היווצרות heteroduplex מושגת גם בנוכחות של הצורה קטועה, כלומר (12-55) NC, המאשרת את הפעילות הביולוגית של פפטיד הסינתטי. בהעדרו של החלבון או של הפפטיד היווצרות heteroduplex לא נצפה, וTAR וoligonucleotides cTAR לא לחשל בטמפרטורת חדר לheteroduplex (איור 1). בכל הניסויים, ההיווצרות מהירה של חומרי ביניים לא יציבים (&quot;מתחמי ביניים&quot; באיור 1) שירידה לאורך הזמן הוא ציין, באופן עקבי עם המנגנון המוצע של חילופי גדיל באמצעות סיכות הראש של cTAR וTAR עד חומצות גרעין הנכונות מתקפלות. 17 פתרון בעיות אפשריות של הניסוי הוא חוסר SDS במאגר טעינת ג&#39;ל. בהעדר SDS בGLB התוצאה של התגובה מוצגת באיור 2 והשוואה לתוצאה עם GLB + SDS. TAR-מקופל מראש וcTAR היו מעורבים וטופחו במשך 3 שעות בRT של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם חלבון NC באורך מלא רקומביננטי. לאחר הדגירה הדגימות פוצלו לשתיים: למאגר טעינת המחצית ג&#39;ל אחד ללא SDS (GLB) נוספו, ואילו למחצית אחרת GLB היה עם SDS (GLB SDS). דוגמאות הועמסו על הג&#39;ל, ואת המיקום של להקות חומצות גרעין היה דמיין אחרי ג&#39;ל המנוהל על ידיכתמי צבע. כאשר NC היה נוכח אבל הדגימות עמוסות GLB, כל להקות חומצות הגרעין הוזזו עד: זה צפוי ומציינת חזק מחייב בין החלבון וחומצות גרעין. התוצאות עם GLB SDS מוצגות בימין הקיצוני של ג&#39;ל: התוספת של SDS denatures החלבון ומשחררת חומצות גרעין מהמתחם היציב עם החלבון, המאפשר השוואה עם קבוצת הביקורת. Assay השם משמש כדי להעריך את היכולת של השחלה intercalators לייצב מבני חומצות גרעין דינמיים ומעכבים את פעילות NC מלווה. 14 intercalators Threading הם מולקולות ריחניות מישוריים הוחלפו על ידי שרשרות צד מגושמות הממוקמים באתרים נגדיים של מערכת הטבעת, כגון anthraquinone ניתן לראות באיור 3 א. 18 intercalators אלה מסוגלים להשחיל דרך הסליל הכפול של חומצות גרעין, לבסוף איתור הרשתות בצד שלהם בכל חריץ של כפולסליל. 19,20 איור 3 מציג את התוצאה של assay שם בנוכחות המתחם 1, intercalator השחלה ידועה, 18 בנוכחות באורך מלא NC או של הפפטיד הקטוע. בשני המקרים, היווצרות ההיברידית TAR / cTAR על ידי NC היא מופחתת על ידי הגדלת הריכוז של intercalator, ואילו, באותו הזמן, בסך של TAR החופשי ועליית cTAR. הצורה קטועה של החלבון חסר זנב N-terminal (12-55NC) היא יותר רגישה לעיכוב פעילותו: הבדל זה אומת עם כל התרכובות שנבדקו עד כה. Assay השם יכול להתבצע בשתי דרכים, או על ידי מראש דוגרים מתחם הבדיקה עם NC, ואחריו תוספת של oligonucleotides המקופל (מצב NC-preincubation), או על ידי preincubating מתחם המבחן במשך 15 דקות עם מצעי חומצות גרעין המקופלים , ואחריו תוספת של NC ודגירה נוספת במשך 15 דקות (אוליגו-PRמצב eincubation). למרות זמן הדגירה הכללי הוא זהה בשני מצבים שונים, preincubation עם oligonucleotides המקופל לפני תוספת של NC מאפשר יותר זמן לשחלה של intercalators לחומצות גרעין המקופל. התוצאה היא ייצוב חזק של המבנים הדינמיים שלהם ולעיכוב קל של פעילויות מלווה NC. הניתוח של assay שם בשני המצבים ולכן משפר את ההבדלים במנגנון פעולה של מעכבי NC, כפי שמוצג באיור 4: כאשר מתחם 1 נותח בשמו במצב אוליגו-preincubation (איור 4, נתיבים משמאל) זה מראה עיכוב חזק של חישול בתיווך NC, ואילו עיכוב הרבה יותר נמוך נצפה במצב NC-preincubation (איור 4, נתיבים מימין). אנא שים לב כי לקביעת ריכוזים מעכבים בזמן הקרנת סטים של תרכובות הקשורות עם assay זה ובתנאים אלה, כל התנסותment חייב להתבצע לפחות בשלושה עותקי שימוש בריכוזים צפופים (במיוחד סביב ערך IC 50). 14 <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> איור 1:. Assay שם עם באורך מלא NC ועם (12-55) NC TAR המקוצץ המקופל וcTAR, כל 1 מיקרומטר, הודגרו עם NC רקומביננטי או עם (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) ל0 דקות, 15 דקות, 30 דקות ושעה 1. TAR וcTAR מודגרות בהיעדר החלבון (0 דקות, 15 דקות, 30 דקות ושעה 1) שמשו כביקורת שלילית. TAR המקופל, cTAR המקופל וTAR ההיברידי / cTAR מתקבלים לאחר denaturation התרמית ואחריו במבחנה חישול שמשו כקבוצת ביקורת. התגובות אז היו הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג&#39;ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. <html><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> איור 2:. אפקט של SDS במאגר טעינת ג&#39;ל (GLB) בעת ניתוח TAR / cTAR חישול על ידי NC TAR וcTAR, prefolded בTNMg 1x, הודגרו עם אורך מלא רקומביננטי NC (oligos / NC = 1/8) במשך 3 שעה בטמפרטורת חדר או על 37 מעלות צלזיוס. GLB או GLB SDS נוספו לאחר מכן לדגימות מודגרות עם NC. בקרות: TAR, cTAR וTAR ההיברידי המרותק / cTAR (כל 1 מיקרומטר). אלקטרופורזה בוצעה באמצעות 12% ג&#39;ל polyacrylamide בTBE 1x; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. נתון זה שונה מאיור S4 של:. Sosic, א &#39;ואח&#39; עיצוב, סינתזה והערכה ביולוגית של TAR וקלסרים cTAR כHIV-1 מעכבי nucleocapsid 4 MedChemComm, 1,388-1,393, doi:. 10.1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> איור 3: (א) מבנה כימי של intercalator השחלה 1. (B) השפעה של השחלה intercalator 1 הוערך על ידי assay NAME. מקופל TAR וcTAR, כל 1 מיקרומטר, הודגרו בנוכחות הריכוזים מצויינים של המתחם 1 עם האורך מלא NC או עם (12-55) NC, כל 8 מיקרומטר. TAR המקופל, מקופל cTAR וTAR heteroduplex המורחב / cTAR שימש כקבוצת ביקורת. התגובות אז היו הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג&#39;ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> איור 4: אוליגו-preincubation לעומת מצבי NC-preincubation: השפעות על assay NAME mod אוליגו-preincubation.דואר: TAR מקופל ומקופל cTAR, כל 1 מיקרומטר, היו preincubated עם הריכוזים מצויינים של intercalator השחלה 1 במשך 15 דקות, ולאחר מכן במשך 15 דקות נוספות בנוכחות באורך המלא NC (8 מיקרומטר) NC-preincubation. מצב: ריכוזים המצוינות של intercalator השחלה 1 היה preincubated עם האורך המלא NC (8 מיקרומטר) במשך 15 דקות, ולאחר מכן במשך 15 דקות נוספות בנוכחותו של TAR המקופל ומקופל cTAR, כל 1 מיקרומטר. TAR המקופל, מקופל cTAR וTAR heteroduplex המורחב / cTAR שימש כקבוצת ביקורת. כל התגובות לבסוף הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג&#39;ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator.

פרוטוקול זה מתאר את NAME, בדיקה המאפשרת זיהוי מהיר של מולקולות המסוגלות לעכב במבחנה את פעילויות המלווה של חלבון נוקלאוקפסיד HIV-1.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

המטרה הכוללת של הניסוי היא זיהוי מהיר של מולקולות המסוגלות לעכב את פעילויות השפרונית (chaperone) של חלבון הנוקלאוקפסיד של HIV-1. In vitro, חלבון ה-NC הוא חלבון קטן ובסיסי מאוד, שמבנהו מאופיין בדומיין טרמינלי גמיש ובשני אצבעות אבץ (zinc fingers) שמורות מאוד המעורבות באינטראקציה עם חומצות גרעין ויראליות. NC מקיימת אינטראקציה עם ה-hairpin של tar RNA ועם רצף ה-DNA המשלים לו, CT A r, ומקדמת את ההמסה של המבנים השניים שלהם כדי להפוך אותם לזמינים לקישור של ההיבריד tar-tar.הפרוטוקול מבוצע באמצעות שימוש בחלק האפיקלי של רצפי tar ו-sitar כאשר אלו מעורבבים יחד ומודגרים עם nc. ההיבריד נוצר על ידי השרה ומסלולים המגיבים עם אוליגנוקלאוטידים המעכבים את היווצרות ההיבריד המזורזת על ידי NC. תוצאת התגובה מנותחת באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל פוליאקרילאמיד; ל-TAR ול-CA יש ניידות שונה בג'ל בהשוואה להיבריד.ריכוזים גדלים של threading ב-inter collator מובילים לירידה של ההיבריד במקביל להופעה של tar חופשי ו-CT A. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים, כגון gel shift analysis או tar kneeling, הוא שאינה דורשת מניפולציה מוקדמת של חומצות גרעיניות, כגון סימון רדיואקטיבי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום גילוי התרופות, כגון מעכבי HIV one ו-C באופן כללי. כמי שחדשים בשיטה זו, אנו מתקשים בארגון הכללי של הפרוטוקול, ובמיוחד בדילול סדרתי של כל מלאי, בזמן האינקובציה המדויק ובנוהל הנכון לעצירת התגובה.כדי להתחיל בהליך זה, הכין 10 µL של תמיסת סטוק בריכוז 1 µM של TAR עם אוליגנוקלאוטיד ו-10 µL של 1 µM CT A בבופר TNMG 1X. חמם את המבחנות לכ-95 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן צנן אותן לטמפרטורת החדר כדי ש-TAR ו-CT A ישחזרו את מבני ה-stem bulge loop שלהם. כדי להכין תמיסה בריכוז 1 µM של היבריד TAR CT A כביקורת, ערבב 1 µL של 10 µM TAR עם 1 µL של 10 µM CT A בבופר TNMG 1X.מלאו את המבחנה במי DEPC עד לנפח כולל של 10 µL. לאחר מכן, דנאטורו את האוליגנוקלאוטידים על ידי חימום המבחנה ל-95 °C למשך חמש דקות. השאירו אותה להתקרר באיטיות לטמפרטורת החדר כדי לאפשר ל-tar להיקשר (anneal) לרצף המשלים שלו, CT A, וליצור את ההיבריד דו-גדילי tar CT A. כאשר כל התמיסות התקררו לטמפרטורת החדר, בצעו ספין קצר בצנטריפוגה, לאחר מכן הוסיפו 3 µL של GLB עם SDS לכל תמיסה וערבבו אותה בתוך המבחנה שלוש פעמים.השאירו את הדגימות על קרח עד לשלב הטעינה. בהליך זה, הכינו 10 µL של מהלולים בריכוזים של 500 µM, 250 µM, 50 µM ו-5 µM של compound one במים מזוקקים (milli Q water). לאחר מכן, הכינו 27.5 µL של tar בריכוז 4 µM ו-27.5 µL של CTA בריכוז 4 µM בבפר TNMG 1X.חממו את שתי המבחנות לכ-95 °C למשך חמש דקות כדי לקפל את המבנים, והשתמשו ב-2.5 µL מתמיסות האוליגונוקלאוטידים המקופלות הללו לשלבים הבאים. לאחר מכן, דללו במים את תמיסות המקור של חלבון ה-NC ושל NC 12 to 55 peptide לריכוז של 80 µM. כאשר תמיסות ה-TAR וה-CAR יתקררו לטמפרטורת החדר, בצעו סבב קצר של סנטריפוגה לשתי המבחנות, ולאחר מכן הכינו 20 מבחנות ריקות שעברו עיקור והניחו שתי שורות של 10 מבחנות בכל אחת מהן במעמד לדגימות מעבדה.לאחר מכן, הוסף 2.5 µL של ה-tar המקופל לכל מבחנה בשורה הראשונה. לאחר מכן, הוסף 2.5 µL של CT A מקופל לכל מבחנה. בשורה השנייה, הוסף שני מיקרוליטרים של התרכובת המתאימה, דילול אחד ל-tar ול-CT A r.החליפו את התרכובת במים בדגימות עבור ניתוח NC ופפטיד NC 12 to 55 בביקרות. דגרו את הדגימות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, ערבבו את דגימות ה-CT A R עם דגימות ה-tar התואמות.הוסיפו מיקרוליטר אחד של 80 micromolar NC לדגימות המיועדות לניתוח NC, או מיקרוליטר אחד של 80 micromolar NC 12 to 55 peptide לדגימות המיועדות לניתוח NC 12 to 55 peptide. לאחר 15 דקות נוספות של דגירה בטמפרטורת החדר, עצרו את התגובה על ידי הוספת שלושה מיקרוליטרים של GLB עם SDS לכל דגימה. בצעו פיפוט של התערובת בכל מבחנה שלוש פעמים ולאחר מכן הניחו אותה על קרח.חזור על שלב זה באמצעות הדגימות עבור ניתוח NC ו-NC 12 to 55 peptide ושמור את הדגימות על קרח עד לשלב ההטענה. כעת, הסר את המכסה של מכשיר הג'ל. טען 13 µl מכל דגימה לתוך הבארות.החזירו את המכסה של מכשיר הג'ל לפני הפעלתו. הריצו את הג'ל במשך שעתיים ו-30 דקות במתח קבוע של 200 volts עד שהצבע נדדה למרחק של 1.5 סנטימטרים מעל תחתית הג'ל. לאחר מכן, הניחו את הג'ל במכל מתאים עם תמיסת צביעה רצויה לחומצות גרעיניות למשך 30 עד 45 דקות תוך כדי ערבוב.הניחו את הג'ל על מערכת דימות בטרנסלומינטור כדי לזהות את חומצות הגרעין באמצעות האות הפלואורסצנטי. השם assay משמש להערכת היכולת של threading inter collators לייצב מבני חומצות גרעין דינמיים ולעכב את פעילות ה-NC chaperone. Threading inter collators הם מולקולות ארומטיות פשוטות המוחלפות בשרשראות צדדיות מסורבלות הממוקמות בצדדים מנוגדים של מערכת הטבעות, כגון ה-anthraquinone המוצג כאן.איור זה מציג את תוצאות בדיקת השם בנוכחות תרכובת אחת, שהיא אינטרקלטור (intercalator) מוכר, בנוכחות NC באורכו המלא או של הפפטיד הקטוע. בשני המקרים, היווצרות ה-tar ct, היבריד של NC, פוחתת ככל שריכוז האינטרקלטור עולה. במקביל, כמות ה-tar החופשי וה-CT A R עולה.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בתמיסת טעינה JA עם SDS. זהו שלב קריטי להצלחה מיטבית של name. נניח ששלב זה לא יבוצע, לא יהיה ניתן להבחין בפסי חומצות גרעיניות במערכת הג'ל.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע MSA עבור אוליגונוקלאוטידים בטמפרטורת החדר המקופלים למבנים יציבים, וכיצד לנתח את תוצאות התגובה, תוך שימוש בחלבון NC רקומביננטי באורכו המלא או בפפטיד NC סינתטי קטוע כדי לזהות אינטרפולטורים המעכבים את nc. זכרו כי עבודה עם אקרילאמיד ופולי-אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן בעת ביצוע פרוטוקול זה.

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating...

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

הבנת קונפורמציות של אנטיגנים על פני השטח של הנגיף נדרשת כדי להעריך את נטרול הנוגדנים ולהדריך את התכנון של אימונוגנים יעילים לחיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי המתבטא על פני תאים שעברו טרנספטציה על ידי נוגדנים ספציפיים נגד Env.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

תחרות צמיחה בין נגיפים כמעט איזוגניים מספקת מדידה רגישה לקביעת כושר השכפול היחסי. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV-1, תחרות התפשטות וגידול וירוסים ושיטות ניתוח המותאמות להניב תוצאות רגישות ועקביות.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ"א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

שיטות איתור שגרתית ניצול גנום ויראלי הגברה מוגבלים על ידי חוסר יכולתם להפלות זיהומיות של חלקיקים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לסייע אפליה של חלקיקים norovirus זיהומיות באמצעות איגוד aptamer, פיזור אור דינאמי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

כאן אנו מתארים Rev immunoprecipitation בנוכחות של שכפול HIV-1 עבור ספקטרומטריה המסה. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות לזיהוי גורמי נוקלאוולאר המעורבים במחזור הזיהומיות של HIV-1, וחלים על מודלים אחרים של מחלות לאפיון מסלולים בעלי מחקר.

זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

מאמר זה מציג שיטה פשוטה להכנת אנטיגן של 4 יחידות המגלוטינציה לבדיקה סרולוגית של נגיף מחלת ניוקאסל. על ידי קביעה מדויקת של טיטר ההמגלוטינציה של האנטיגן, בשילוב עם שיטת טיטרציה לאחור קפדנית יותר, ותהליך התאמה מוגדר היטב, הוא משפר את יעילות הבדיקה, מפחית תוצאות חיוביות כוזבות ומשפר את מעקב המחלות בעופות.

אופטימיזציה של הכנת אנטיגן לבדיקת עיכוב המגלוטינציה של סרולוגיה של נגיף מחלת ניוקאסל

למדו את שיטת NAME לזיהוי מהיר של מעכבי חלבון ה-nucleocapsid של HIV-1 באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילמיד. פרוטוקול זה מאפשר גילוי תרכובות המעכבות פעילות chaperone ללא צורך בסימון רדיואקטיבי.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

גלה סרטונים נוספים