טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות סימולציה ונוכחות בכל מקום של חלבוני ליבה קינטיים של שמרים, NDC 10 ו-NDC 80. זה מושג על ידי קצירת תאי שמרים המבטאים דגל שריקה מתויג SMT 3 ו-MT מתויג NDC 10 או NDC 80, וייצור תמציות חלבון מתאים אלה. השלב השני הוא לטהר את דגל השריקה המתויג SMT שלושה מצומדים לזיהוי סיכום או לזרז חיסונית חלבוני ליבה קינטיים של mik tagg לזיהוי ubiquitination.

לאחר מכן, סיכום או אוביקוויטינציה מזוהה על ידי ניתוח כתמים מערביים. בסופו של דבר, נוכחותו של דפוס סולם עבור NDC 10 ו-NDC 80 מאשרת כי חלבונים אלה מדומים ונמצאים בכל מקום. שיטת טיהור החלבון המתוארת מאפשרת זיהוי הן של סימולציה והן של אוביקוויטינציה של חלבוני הקוניקו ND C 10 ו-NDC 80 בסקרו השמרים הניצנים.

ה-CCI שלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלזן שיצרנו יש שתי התקפות אפיטופ, האחת על חלבון הבדיקה, והשנייה מאפשרת זיהוי סימולציה. השימוש בתגים אלה מפחית את הרקע עקב תגובתיות צולבת הנצפית לעתים קרובות בעת שימוש בסרום רב-שבטי.

ההדגמה של הליך זה תיעשה על ידי Canero Uni, עמית מחקר במעבדה שלי. חלבונים מעניינים יופקו מכדורי תאי שמרים שהוכנו בעבר ואוחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס. החייאה, השעו את התאים ב 0.5 מיליליטר חיץ קר כקרח.

השתמש במאגר גינות אם התמצית מיועדת לבדיקה נפתחת באמצעות ניקל ניטריל, חומצה טרי אצטית או חרוזי ניקל NTA. השתמש במאגר A אם התמצית מיועדת למשקעים חיסוניים. שמור את הצינורות על קרח כל הזמן.

העבירו את מתלי התאים לשני מיליליטר. הברג שניים מכסה לכל צינור. הוסף נפח של חרוזי זכוכית השווה לנפח חרוז ההשעיה של התא.

מקציפים את התאים במקצף חרוזים מיני במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ואז מניחים את הצינורות על קרח למשך שתיים-שלוש דקות. חזור על הכאת החרוזים והציפוי שלוש פעמים. מערבולת במהירות גבוהה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות.

בדוק את התאים על ידי הדמיה מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים עוברים ליזה. תאים שעברו ליזה יופיעו כרוחות רפאים כהות וחסרי גבול או צורה מוגדרת. באופן אופטימלי יש לשקר לפחות 80% מהתאים.

לאחר מכן, השתמש בסיכת דחיפה כדי לנקב חור בתחתית הצינור. הנח את מכסה הבורג בצורה רופפת והנח את הצינור בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 1000 פעמים G למשך דקה אחת.

כדי לאסוף את הליזאט, העבירו את הליזאט לצנטריפוגה של צינור מיקרו צנטריפוגה בטמפרטורה של 15,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החלבונים המופקים. לאחר מדידת ריכוז החלבונים המופקים באמצעות ערכת בדיקת חלבון, נרמל את כל התמציות כך שכל אחת תכיל את אותה כמות חלבון. הביאו את הנפח הכולל למיליליטר אחד עם המאגר המתאים.

כחמישה מיליגרם של חלבון כולל מתקבלים מ-50 OD 600 של תאים. שמור 50 מיקרוליטר מהחלבון המופק כתמצית התא השלמה. 950 המיקרוליטרים הנותרים של תמצית חלבון ישמשו מאוחר יותר לטיהור חלבונים או משקעים חיסוניים של חלבונים מתויגים MT.

הוסף 50 מיקרוליטר של שני מאגר דגימה ל-50 מיקרוליטר של תמצית תאים שלמים. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך שלוש עד חמש דקות לפני שתנתחו אותן לפי כתם מערבי. התחל הליך זה על ידי הכנת חרוזי הזרימה של ניקל NTA הדרושים לטיהור.

השג את כמות החרוזים הדרושה לצנטריפוגה במהירות נמוכה למשך דקה אחת. הסר את הסופרנטנט ושטוף את החרוזים עם PBS. הוסף מיליליטר אחד של PBS והפוך את החלק העליון של הצינור מעל התחתון עד שהחרוזים מושעים מחדש.

אסוף חרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה והסר את הסופרנטנט. שוטפים את החרוזים בצורה זו בסך הכל חמש פעמים. השעו את החרוזים במיליליטר אחד של חוצץ גיני וציינו אותם למספר הצינורות המתאימים לדגימות שיש לעבד.

אסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה והסר את הסופרנטנט עבור כל דגימה. הוסף 950 מיקרוליטר מתמצית התא השלמה. הוכן מוקדם יותר ל -100 מיקרוליטר מהחרוזים.

דגירה על משטח נדנדה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות או למשך הלילה. צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 עד 1500 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. חסוך 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט.

הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה של שני x laly לסופרנטנט זה ודגירה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך שלוש עד חמש דקות. 10 מיקרוליטר מכל דגימה ינותחו מאוחר יותר על ידי Western Blot. שטפו את חרוזי הניקל NTA פעם אחת עם מיליליטר אחד של מאגר גיני למשך חמש עד 10 דקות על משטח נדנדה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את החרוזים חמש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר שבירה לאחר הכביסה הסופית עם מאגר שבירה השעו מחדש את החרוזים ב-90 מיקרוליטר של שני x מאגר דגימה. הוסף 10 מיקרוליטר של יול מולארי אחד כדי לעזור לנתק את החלבון המתויג שלו מהניקל NT. חרוזים דוגרים בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך שלוש עד חמש דקות. מערבולת לאחר מכן צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G למשך 30 שניות.

העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. כדי להתחיל בהליך זה, השג את הכמות הדרושה של נוגדן ג'ל אנטי סמיק על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. הסר את הסופרנטנט, שטוף את השרף עם מאגר A הוסף מיליליטר אחד של מאגר A והפוך את החלק העליון מעל התחתון עד שהשרף מושעה מחדש.

אוספים את השרף על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ומסירים את הסופרנטנט. שוטפים בסך הכל חמש פעמים. השעו את השרף במיליליטר אחד של מאגר A והכניסו למספר הצינורות המתאימים לדגימות שיש לעבד.

אוספים את השרף על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ומסירים את הסופרנטנט. הוסף 950 מיקרוליטר של תמצית תאים שלמים ל-25 מיקרוליטר שרף דגירה על משטח נדנדה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת. צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 עד 1500 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

חסוך 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה של שני x lam לסופרנטנט זה ודגר ב-100 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך שלוש עד חמש דקות. שוטפים את השרף עם מאגר ומוסיפים מיליליטר אחד של מאגר, חלק עליון הפוך מעל התחתית עד שהשרף מושעה מחדש.

אסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה והסר את הסופרנטנט לאחר הוצאת הסופרנטנט מהכביסה הסופית. השעו מחדש את השרף ב-100 מיקרוליטר של מאגר דגימת סומה בדגירה ב-100 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך שלוש עד חמש דקות. מערבולת לאחר מכן צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G למשך 30 שניות.

העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. לבסוף, טען את כל הדגימות שנאספו מפרוטוקול זה. בדף SDS, ג'ל לניתוח כתמים מערביים, נעשה שימוש בזני שמרים המבטאים דגל פולי היסטמין המתויג SMT 3 או HF SMT 3 ו-MT מתויג NDC 80 ו-NDC 10 כדי לזהות סימולציה של חלבוני קינטיקו.

שלושת המצעים של HF SMT טוהרו באמצעות חרוזי ניקל וזוהו עם נוגדן נגד דגל. NDC 80 עם חפיר סכום התגלה בשלושת המצעים HF SMT כאשר נבדק עם נוגדן נגד מיקרופון. היעדר חלבונים מותאמים בזני הבקרה ללא HF SMT 3 מצביע על הספציפיות של האינטראקציה בין HF SMT 3 לחלבוני המטרה שלו.

יתר על כן, סיכום של NDC 80 ו-NDC 10 מופחת בתאים שטופלו ב-NOCO כדי לזהות אוביקוויטינציה של NDC 80 ו-NDC 10. מיק תייג ND C 80 או ND C 10 היה משקע חיסוני וניתוח כתמים מערביים בוצע עם ניתוח נוגדנים נגד MIC ואנטי יוביקוויטין של תמצית תאים שלמים וסופרנטנט אישר את הביטוי של NDC 80 M ו-NDC 10 M דגימות משקעות חיסוניות שנבדקו עם אנטי MIC הראו מספר רצועות משקל מולקולרי גבוהות המצביעות על כך ש-NDC 80 ו-NDC 10 מכילים שינויים לאחר התרגום. דפוס סולם של דגימות משקעים חיסוניים שנבדקו עם אנטי יוביקוויטין הראה כי ND C 80 ו-ND C 10 נמצאים בכל מקום.

דפוסי הסולם של NDC 80 ו-NDC 10 שופרו על ידי טיפול במעכב פרוטאזום MG 1 32. אישור נוסף לכך שאלו מייצגים poly ubiquitination לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את טכניקת טיהור החלבון המאפשרת זיהוי וחיסון של עטלף NN.