Name: טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: למד טכניקת טיהור חלבון לזיהוי Sumoylation ו-Ubiquitination של חלבוני קינטוכור Ndc10 ו-Ndc80 בשמרים Saccharomyces cerevisiae. השיטה משתמשת ב-Western blot לאישור השינויים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר אוליבר קרשר על התמיכה והייעוץ ולחברי מעבדת בסראי על תמיכתם והערותיהם על המאמר. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הפנימי של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. צמיחה של תאי שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן שמרי תאים ב 30 מיליליטר של YPD (טבלה 1) בבקבוק קטן. לדגור על 30 מעלות צלזיוס הלילה עם רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים לצפיפות אופטית של 0.2 ב 600 ננומטר (OD 600 = 0.2) ב -50 מיליליטר של YPD לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות לצפיפות אופטית של 1.0 ב 600 ננומטר (OD 600 = 1.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגות במשך 5 דקות XG ב 2000 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במים סטריליים 40 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות XG ב 2000 לשטוף את התאים. בטל supernatant ולאחסן את התא גלולה ב -20 ° C. </li></ol> 2. הפקה של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 0.5 מיליליטר של חיץ guanidine קר כקרח (טבלה 1) עבור assay הנפתח באמצעות חרוזים superflow Ni-נת&quot;ע או חיץ (טבלה 1) לimmunoprecipitation. שמור צינורות על קרח בכל העת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 2 מ &#39;צינור כובע בורג l. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את אותו הנפח של חרוזי זכוכית (טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים לנצח את התאים במקצף חרוז מיני (טבלה של חומרים) למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר, ואז מניח על קרח במשך 2-3 דקות. חזור על זה שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת במהירות גבוהה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. בדקו את התאים על ידי הדמיה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שתאי lysed. הערה: תאי lysed יופיעו רוחות כהות וחסרות גבול או צורה מוגדרת. בצורה אופטימלית לפחות 80% מהתאים יש lysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב חור בחלק התחתון של הצינור באמצעות סיכת דחיפה ומקום באוסף צינור חרוטי 15 מיליליטר (כובע בורג צריך להיות משוחרר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 כדי לאסוף את lysate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate לצינור צנטריפוגות מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את החלבונים שחולצו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של החלבונים המופקים באמצעות אסא החלבוןערכת y (טבלה של חומרים) ולנרמל את כל התמציות להכיל את אותה הכמות של חלבון. תביא את הנפח הכולל למ&quot;ל 1 עם חיץ מתאים. הערה: בסביבות 5 מ&quot;ג של חלבון כולל מתקבל 50 OD 600 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 50 μl (חלבון מיקרוגרם 250 אם החלבון הכולל שחולץ מהצעד 2.10 הוא 5 מ&quot;ג) כתמצית כל תא (WCE). הוסף 50 μl של חיץ 2x Laemmli מדגם (טבלת 1) ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. עומס 10 μl של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). </li></ol> 3. טיהור של HF-Smt3 conjugates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את חרוזים Ni-נת&quot;ע superflow (הטבלה של חומרים) נחוצים לניסויים על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (800-1,500 XG) דקות 1 (של חרוזים לדגימה 100 μl). הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 5x עם 1 מיליליטר של PBS (טבלה של חומרים): היפוך העליון יתרתחתון עד חרוזים הם resuspended, לאסוף החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות חרוזים ב 1 מיליליטר של חיץ guanidine (טבלה 1) וaliquot אותם למספר הצינורות המתאימים לדגימות להיות מעובד. לאסוף החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. מערבבים את חרוזים גם על ידי היפוך העליון על חלק תחתון. הערה: מערבבים חרוזים גם על ידי היפוך תחתון העליון מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, להוסיף 950 μl של WCE הנותר (משלב 2.11: הפקה של חלבונים) לחרוזי superflow Ni-נת&quot;ע 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 800-1,500 דקות 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 50 μl כsupernatant (SUP). הוסף 50 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. עומס 10 μl של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: אנאלי כתם מערבייסיס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעם עם 1 מיליליטר של חיץ guanidine למשך 5-10 דקות על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 5x עם 1 מיליליטר של שבירת חיץ (טבלת 1) למשך 5-10 דקות על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 90 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של imidazole 1 M. הערה: Imidazole מסייע לנתק את החלבון שלו מתויג מחרוזי Ni-נת&quot;ע בשל אינטראקציה מתחרה בין imidazole והחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, אז צנטריפוגות ב13,000 XG במשך 30 שניות. מעבירים את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl 10-20 העומס של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). הערה: 10-20 μl מתאים ל0.5-1.0 מ&quot;ג הקלט, אם 5 מ&quot;ג של WCE משמש. </li></ol> 4. Immunoprecipitation של חלבונים קינטוכור מתויג Myc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ג&#39;ל אנטי-ג-Myc זיקת agarosetibody (טבלה של חומרים) נחוץ לניסויים (25 μl של שרף לדגימה) על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (800-1,500 XG). הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x השרף לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ: על-תחתון העליונה היפוך עד השרף resuspended, לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות שרף ב 1 מיליליטר של החיץ וaliquot אותם למספר הצינורות המתאימים לדגימות להיות מעובד. לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. הערה: מערבבים את השרף גם על ידי היפוך על-תחתון-עליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 950 μl של WCE הנותר (משלב 2.11: הפקה של חלבונים) עד 25 μl של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 800-1,500 דקות 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 50 μl כsupernatant (SUP). הוסף 50 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. Loמודעה 10 μl של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x השרף לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ: על-תחתון העליונה היפוך עד השרף resuspended, לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend השרף במדגם של חיץ SUMEB (טבלת 1) 100 μl. הערה: מאגר מדגם SUMEB מכיל 8 M אוריאה ו -1% SDS (מצב denaturing חזק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, אז צנטריפוגות ב13,000 XG במשך 30 שניות. מעבירים את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl 10-20 העומס של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). הערה: 10-20 μl מתאים ל0.5-1.0 מ&quot;ג הקלט, אם 5 מ&quot;ג של WCE משמש. </li></ol> 5. ניתוח כתם המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תמציות חלבון על 4-12% Bis-טריס ג&#39;לי (טבלה של חומרים) וPerfאלקטרופורזה ORM ב 120 V 90 דקות (ריצת חיץ: טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מג&#39;ל לקרום nitrocellulose (טבלה של חומרים) באמצעות מנגנון העברה ליום 30 בV עבור 90 דק &#39;(העברת חיץ: טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הקרום ב5% חלב / 1x TBST (טבלת 1) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני (טבלה של חומרים) 5% חלב / C הלילה ב 4 ° 1x TBST. לנוגדנים עיקריים, השתמש דילול של 1: 1,000 (נוגדנים נגד דגל ואנטי-UB) או 1: 5,000 (נוגדן אנטי-Myc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x קרום במשך 10 דקות כל אחד עם 1x TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נוגדנים משני (טבלה של חומרים) 5% חלב / 1x TBST עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש דילול 1: 5000 של נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x קרום במשך 10 דקות כל אחד עם 1x TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם worki ECLפתרון ng (טבלה של חומרים) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הקרום לסרט X-Ray הכחול רגיש (טבלה של חומרים) ולפתח באמצעות מפתח אוטומטי (טבלה של חומרים). </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mub1%2FUbr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216(2013).</li>
<li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li>
<li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li>
<li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li>
<li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+controls+HEC1+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li>
<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תגי epitope כגון HA, Myc, דגל, וGST נמצאים בשימוש נרחב לאנליזה ביוכימית של חלבונים. בנייה של זנים עם HF-Smt3 וחלבוני קינטוכור מתויג Myc, כגון Ndc10 וNdc80, מאפשרת זיהוי של PTMs כגון sumoylation וubiquitination. HF-Smt3 ניתץ assay מאפשר זיהוי של חלבוני קינטוכור sumoylated, Ndc10 וNdc80 (איור 1). פרוטוקול טיהור הזיקה וניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי הדגל להקים את הספציפיות של אינטראקציה בין HF-Smt3 וחלבוני יעד, כמו חלבונים שונה שלא זוהו בזן השליטה ללא HF-Smt3. ה...

Ubiquitination וsumoylation לאפשר נטיה של היוביקוויטין ומשתנה כמו-יוביקוויטין הקטן (SUMO; Smt3 בcerevisiae ס 1) לחלבון מטרה, בהתאמה. PTMs של חלבוני קינטוכור להשפיע על הרמות הסלולריות שלהם ואינטראקציות בין חלבונים במהלך שלבי מחזור התא שונים על מנת להבטיח הפרדת כרומוזומים נאמן. לדוגמא, רמות סלולריות של Cse4 / CENP-וחלבון קינטוכור החיצוני Dsn1 מוסדרות על ידי proteolysis בתיווך היוביקוויטין להבטחת יציבות הגנום 2-5. יציבות של קבצים מצורפים קינטוכור-microtubule שגויים דורשת B קינאז Ipl1 / אורורה, שphosphorylates מתחמי Dam1 וNdc80 ישירות אינטראקציה עם microtubules 6-8. למרות זיהוי של למעלה משבעים חלבוני קינטוכור, יש מעט מאוד מחקרים שיבדקו את השינויים של חלבונים אלה עם PTMs, למשל, יוביקוויטין וסומו. מגבלה עיקרית היא היכולת לשמור על PTMים במהלך טיהור והמיעוט של נוגדנים מותאמים אישית עבור זיהוי של PTMs כגון sumoylation, זרחון, מתילציה, ואחרים. אפיון של חלבוני קינטוכור sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, וNdc80 מנוצל נוגדן מותאם אישית 9. בנוסף, Ndc10 היה מעורב כמצע לubiquitination 10. האדם Hec1 (Ndc80 בcerevisiae ס) הוא גם מצע עבור ubiquitination, מוסדר על ידי האנזים APC / C-hCdh1 E3 11. לכן, Ndc10 וNdc80 הם מועמדים טובים לאופטימיזציה של הפרוטוקול לזהות שני sumoylation וubiquitination בס cerevisiae. כדי להקל על זיהוי של sumoylation, בנינו זנים המבטאים HF-Smt3 וNdc10 מתויג Myc או Ndc80. השימוש בתגי epitope (HF: His6-הדגל) ממזער את הרקע בשל תגובה צולבת הנצפה לעתים קרובות בסרום polyclonal הועלה נגד חלבון מועמד. אנחנו המצאנו פרוטוקול לזיקהלטהר conjugates HF-Smt3 ולאחר מכן השתמש באנטי-דגל מסחרי ואנטי-Myc נוגדנים כדי לזהות הנוכחות של Ndc10 sumolyated וNdc80 בהכנת Smt3 מטוהרת. לubiquitination, אנחנו המצאנו פרוטוקול immunoprecipitation שונה המשמר ubiquitination של חלבוני קינטוכור myc-מתויגים וביצעו ניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי-UB מסחרי כדי לזהות ubiquitination של Ndc10 וNdc80.

<table><tbody><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>BioSpec מוצרים</td><td>11079105</td><td>קוטר 0.5 מ"מ</td></tr><tr><td>מיני מקצף חרוזים</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 תאים משבש</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody המיוצר בארנב</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד דגל M2 המיוצר בעכבר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>נוגדן ראשוני, דילול 1:1,000</td></tr><tr><td>נוגדן c-Myc (A-14)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>נוגדן ראשוני, דילול 1:5,000</td></tr><tr><td>נוגדן עכבר מטוהר חד שבטי 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>נוגדן ראשוני, דילול 1:5,000</td></tr><tr><td>יוביקוויטין (P4G7) נוגדן חד-שבטי</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>נוגדן ראשוני, דילול 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, נוגדן משני שלם Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td> מקושר HRP<td>, דילול 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>נוגדן משני, דילול 1:5,000</td></tr><tr><td>בדיקת חלבון DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 מ"מ גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריס</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 מ"מ, 10 באר</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS מאגר ריצה</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE העברת מאגר Novex</td><td></td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>סרט רנטגן רגיש כחול</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>מפתח אוטומטי</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 מ"ג</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 מ"ג</td></tr></tbody></table>

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של sumoylation וubiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור ndc10 וndc80

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

לאחר translational שינויים (PTMs), כגון זרחון, מתילציה, acetylation, ubiquitination, וsumoylation, להסדיר את תפקידם של חלבונים רבים. PTMs של חלבוני קינטוכור שמקשרים עם DNA centromeric לתווך הפרדת כרומוזום נאמן לשמור על יציבות הגנום. גישות ביוכימיות כגון ספקטרומטר מסה וניתוח כתם המערבי הנפוצות ביותר לזיהוי PTMs. הנה, שיטת טיהור חלבון מתוארת המאפשרת זיהוי של שני sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בSaccharomyces cerevisiae. מתח שמבטא Smt3 מתויג polyhistidine-הדגל (HF-Smt3) וmyc-מתויג Ndc10 או Ndc80 נבנה ומשמש למחקרים שלנו. לגילוי של sumoylation, אנחנו המצאנו פרוטוקול לזיקה לטהר מתויגים חלבוני sumoylated באמצעות חרוזים ניקל ושימוש בניתוח כתם מערבי עם אנטי-Myc נוגדנים לזהות Ndc10 sumoylatedND Ndc80. לגילוי של ubiquitination, אנחנו המצאנו פרוטוקול לimmunoprecipitation של חלבוני myc-מתויגים ושימוש בניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי-UB להראות שNdc10 וNdc80 הם ubiquitinated. התוצאות שלנו מראות כי epitope מתויג חלבון עניין בו-הדגל מתויג מתח Smt3 מאפשר זיהוי של PTMs מרובה. מחקרים עתידיים צריכים לאפשר ניצול של טכניקה זו כדי לזהות ולאפיין אינטראקציות חלבון שתלויות בPTM ספציפי.

כדי לזהות sumoylation של חלבוני קינטוכור Ndc80 וNdc10, זנים עם HF-Smt3 וחלבונים מתוייגים Myc קינטוכור (Ndc80 או Ndc10) נבנו (טבלה 2), כפי שתוארו בעבר 9,12. conjugates HF-Smt3 היו מטוהר זיקה באמצעות חרוזים Ni-נת&quot;ע. ניתוח מערבי כתם של מטוהר HF-Smt3 עם גילוי אפשר נוגדן אנטי הדגל של צורות sumoylated של מצעי SUMO שנעדרו במתח השליטה ללא HF-Smt3 (איור 1 א ו -1 B, פנל משמאל). כצפוי, צורות רבות של מצעי SUMO אותרו במתח HF-Sm...

כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות סומילציה ואוביקיטינציה של חלבוני הליבה הקינטית של שמרים בתהליך הנבטה, NDC 10 ו-NDC 80. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף תאי שמרים המבטאים SMT three עם תג His-Flag ו-NDC 10 או NDC 80 עם תג Myc, והפקת תמציות חלבון מתאים אלו. השלב השני הוא טיהור של קונג'וגטים של SMT three עם תג His-Flag לצורך זיהוי סומילציה, או שיקוע חיסוני של חלבוני ליבה קינטית עם תג Myc לצורך זיהוי אוביקיטינציה.בשלב הבא, סומיליציה או יוביקיטינציה מזוהות באמצעות אנליזת western blot. בסופו של דבר, נוכחות של תבנית סולם (laddering pattern) עבור NDC 10 ו-NDC 80 מאשרת שחלבונים אלו עברו סומיליציה ויוביקיטינציה. שיטת טיהור החלבונים המתוארת מאפשרת זיהוי של סומיליציה ויוביקיטינציה של חלבוני ה-connico, ‏NDC 10 ו-NDC 80, בשמר השמרים *Saccharomyces cerevisiae*.ה-cci שלי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהזן שיצרנו כולל שתי התקפות אפיתופים, אחת על חלבון הבדיקה והשנייה המאפשרת זיהוי של הסימולציה. השימוש בתגיים אלו מפחית את הרקע הנובע מתגובה צולבת הנצפית לעיתים קרובות בעת שימוש בסרומים פוליקלונליים.הדגמה של נוהל זה תבוצע על ידי Canero Uni, עמית מחקר במעבדתי. חלבונים רצויים יופקו ממשקעי תאי שמרים שהוכנו מראש ואוחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. השעה את התאים ב-0.5 milliliters של בופר קר מהקרח.השתמשו בבופר guine אם התמצית מיועדת לבדיקת pull-down באמצעות חרוזי nickel nitrile, tri acetic acid או nickel NTA superflow. השתמשו בבופר A אם התמצית מיועדת לשיקוע חיסוני (immunoprecipitation). שמרו את המבחנות על קרח בכל עת.העבירו את תרחיפי התאים לשפופרות של שני מיליליטר. סגרו את כל שפופרת באמצעות פקק הברגה. הוסיפו נפח של חרוזי זכוכית השווה לנפח תרחיף התאים.הריצו את התאים במיני bead beater למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הניחו את המבחנות על קרח למשך שתי עד שלוש דקות. חזרו על תהליך ה-bead beating והקירור על קרח שלוש פעמים. בצעו ערבול ב-Vortex במהירות גבוהה בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 עד 60 דקות.בדקו את התאים באמצעות ויזואליזציה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא כי התאים עברו ליזיס. תאים שעברו ליזיס ייראו כדמויי רפאים כהים וללא גבול או צורה מוגדרת. באופן אופטימלי, לפחות 80% מהתאים צריכים להיות בליזיס.בשלב הבא, השתמשו בסיכה כדי ליצור חור בתחתית המבחנה. סגרו את מכסה הבורג באופן רופף והניחו את המבחנה בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter. סבבו בצנטריפוגה ב-1000 ×g למשך דקה אחת.כדי לאסוף את הליזט, העבירו את הליזט למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה וסבבו ב-15,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לאסוף את החלבונים שהופקו. לאחר מדידת ריכוז החלבונים שהופקו באמצעות ערכה לבדיקת חלבונים, נרמלו את כל התמציות כך שכל אחת תכיל את אותה כמות של חלבון. השלימו את הנפח הכולל ל-1 mL באמצעות הבאפר המתאים.כחמישה מיליגרם של חלבון כולל מתקבלים מ-50 OD 600 של תאים. שמרו 50 microliters של החלבון המופק כתמצית תאים שלמה. 950 microliters הנותרים של תמצית החלבון ישמשו מאוחר יותר לטיהור חלבונים או להשקעה חיסונית (immunoprecipitation) של חלבונים המסומנים ב-MT.הוסיפו 50 µL של תמיסת דגימה laly בריכוז 2x ל-50 µL של תמצית תאים שלמים. דגרו את הדגימות ב-100 °C בבלוק חימום למשך שלוש עד חמש דקות לפני ניתוחן באמצעות western blot. התחילו את ההליך על ידי הכנת חרוזי ה-nickel NTA superflow הדרושים לטיהור.השג את כמות החרו지를 הדרושה באמצעות סרימרגציה במהירות נמוכה למשך דקה אחת. הסר את הנוזל העליון ושטוף את החרוזים ב-PBS. הוסף 1 mL של PBS והפוך את המבחנה מלמעלה למטה עד להשעיה מחדש של החרוזים.אספו את החרו지를 על ידי סרכוז במהירות נמוכה והסירו את הנוזל העליון. שטפו את החרוזים באופן זה סה"כ חמש פעמים. השביו את החרוזים ב-1 ml של guine buffer וחלקו אותם למספר המבחנות התואם למספר הדגימות שיועבדו.אסוף את החרוזיים באמצעות סרכזגיה במהירות נמוכה והסר את הנוזל העליון מכל דגימה. הוסף 950 µL של תמצית תאים שלמים, שהוכנה מוקדם יותר, ל-100 µL של החרוזיים.דגרו על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורה של 4°C למשך ארבע שעות לפחות או למשך הלילה. סבבו בצנטריפוגה במהירות של 800 עד 1500 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4°C. שמרו 50 µL מהנוזל העליון (supernatant).הוסף 50 µL של תמיסת דגימה Laemmli בריכוז פי 2 לסופרנאט זה והדגר ב-100 °C בבלוק חימום למשך שלוש עד חמש דקות. 10 µL מכל דגימה ינותחו מאוחר יותר ב-western blot. שטוף את חרוזי ה-nickel NTA superflow פעם אחת עם 1 mL של תמיסת שטיפה למשך חמש עד 10 דקות על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, שטפו את החרו지를 חמש פעמים עם 1 mL של breaking buffer. לאחר השטיפה האחרונה ב-breaking buffer, השעיו את החרוזים ב-90 µL של 2x laly sample buffer. הוסיפו 10 µL של 1 M iole כדי לסייע בדיסוציאציה של החלבון בעל תג his מהחרוזים מסוג nickel NT.A. הדגירו בבלוק חימום בטמפרטורה של 100 °C למשך שלוש עד חמש דקות. ערבבו ב-Vortex ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-13,000 ×g למשך 30 שניות.העבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. כדי להתחיל בהליך זה, השגיחו את הכמות הדרושה של anti cmic aero affinity gel antibody באמצעות סרקיגציה במהירות נמוכה. הסירו את הנוזל העליון, שטפו את הסורבנט בבופר A. הוסיפו 1 mL של בופר A והפכו את המבחנה מלמעלה למטה עד להשעיה מחדש של הסורבנט.אספו את השרף באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה והסִירו את הנוזל העליון (supernatant). שטפו את השרף חמישה פעמים בסך הכל. השביו את השרף ב-1 mL של באפר A וחלקו אותו לאליקוטים במספר המבחנות התואם למספר הדגימות שיועבדו.אסוף את השרף באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה והסר את הנוזל העליון. הוסף 950 microliters של תמצית תאים שלמים ל-25 microliters של שרף. הדגר על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך לילה. למחרת, בצע סנטריפוגציה במהירות של 800 עד 1500 times G למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.שמרו 50 µL מה上נאטנט. הוסיפו 50 µL של 2x LAM B sample buffer לסנאטנט זה והדגירו ב-100 °C בבלוק חימום למשך שלוש עד חמש דקות. שטפו את השרף עם buffer a; הוסיפו 1 mL של buffer a והפכו את המבחנה עד שהשרף יסבסב מחדש.אספו את שרף הניקוי על ידי סבב צנטריפוגה במהירות נמוכה והסירו את הנוזל העליון לאחר הסרת הנוזל העליון משטיפה האחרונה. השהו את השרף ב-100 µL של בפר דגימה (sample buffer) והדגירו בבלוק חימום בטמפרטורה של 100 °C למשך שלוש עד חמש דקות. ערבבו במכשיר וורטקס ולאחר מכן צנטריפוגו ב-13,000 ×g למשך 30 שניות.העבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. לבסוף, טענו את כל הדגימות שנאספו מפרוטוקול זה. בניתוח Western blot באמצעות ג'ל SDS page, נעשה שימוש בזני שמרים המבטאים poly histamine flag tagged SMT three או HF SMT three וכן MT tagged NDC 80 ו-NDC 10, כדי לזהות סימולציה של חלבוני קינטוכור.שלושה מצעים של HF SMT three טוהרו באמצעות זיקה באמצעות חרוזי ניקל וזוהו בעזרת נוגדן Anti-Flag. NDC 80 מסומן זוהה במצעי HF SMT three כאשר נבדקו בעזרת נוגדן anti mic. היעדרם של חלבונים שעברו מודיפיקציה בזני הביקורת ללא HF SMT three מעיד על ספציפיות האינטראקציה בין HF SMT three לבין חלבוני המטרה שלו.יתרה מכך, סכימה של NDC 80 ו-NDC 10 פחתה בתאים שטופלו ב-NOCO desole כדי לזהות יוביקיטינציה של NDC 80 ו-NDC 10. NDC 80 או NDC 10 המסומנים ב-Myc עברו שיקוע חיסוני (immunoprecipitation), ובוצע ניתוח western blot באמצעות נוגדנים przeciw ל-Myc ונגד יוביקוויטין. ניתוח של תמצית תאים שלמים ושל עליון (supernatant) אישר את הביטוי של NDC 80 M ו-NDC 10 M. דגימות שעברו שיקוע חיסוני ונבדקו עם נוגדן przeciw ל-MIC הראו רצועות מרובות בעלות משקל מולקולרי גבוה, מה שמרמז על כך ש-NDC 80 ו-NDC 10 מכילים מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות. תבנית של "סולם" (laddering pattern) בדגימות שעברו שיקוע חיסוני ונבדקו עם נוגדן przeciw ליוביקוויטין הראתה כי NDC 80 ו-NDC 10 עוברים יוביקיטינציה.תבניות הסולם (laddering patterns) של NDC 80 ו-NDC 10 הוגברו על ידי טיפול במעכב פרוטאוזום MG 1 32. הדבר מאשר עוד כי אלו מייצגים poly ubiquitination. לאחר צפייה בסרטון זה, תגייעו להבנה טובה של טכניקת טיהור החלבונים המאפשרת זיהוי של mation וחיסון של bat NN.

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים...

זיהוי של חלבון Ubiquitination

זיהום של ההכנות של הריבוזומים אוקריוטים מטוהרים באמצעות שיטות מסורתיות על ידי שיתוף טיהור nucleases ו פרוטאזות משפיע לרעה על ניתוחים ביוכימיים ומבניים במורד הזרם. שיטה מהירה ופשוטה טיהור chromatographic משמש כדי לפתור את הבעיה הזו באמצעות הריבוזומים שמרים כמערכת מודל.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

סרטון זה מתאר שיטה לחלץ ולטהר פפטידים יוביקוויטיניל המכילים שאריות פפטידים די-גליצין מתערובת פפטידים מורכבת. השיטה המוצגת עשויה לסייע בזיהוי אתרי יוביקוויטינציה מקוריים בחלבון.

מיצוי מבוסס אימונוזיקה של פפטידים יוביקוויטינילטים: טכניקה לחילוץ סלקטיבי של פפטידים מתויגים של יוביקוויטין משברי פפטידים מטוהרים

סרטון זה מדגים את שיטת in vitro עבור SUMOylation של חלבוני סובסטרט באמצעות מפל אנזימים רציף. יתר על כן, מצב SUMOylated של החלבון מזוהה באמצעות אלקטרופורזה וטכניקת immunoblotting.

בדיקת SUMOylation: טכניקה במבחנה לזיהוי מצב SUMOylation של חלבוני סובסטרט על ידי immunoblotting

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

למד טכניקת טיהור חלבון לזיהוי Sumoylation ו-Ubiquitination של חלבוני קינטוכור Ndc10 ו-Ndc80 בשמרים Saccharomyces cerevisiae. השיטה משתמשת ב-Western blot לאישור השינויים.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

גלה סרטונים נוספים