Name: הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: למד הדמיה ברזולוציה סופר של סינפסות תאי הרוצח הטבעי (NK) בשיטת STED על מישורי שומנים bilayer נתמכי-זכוכית. פרוטוקול זה מאפשר חקר מפורט של מבני הסינפסה החיסונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאמילי מייס ומאליני מוקהרג'י על ניתוח הדמיה ודה-קונבולוציה. העבודה במעבדת ליו נתמכה בחלקה על ידי מענק התמיכה הליבה של מרכז ביילור-יוסטון לחקר האיידס מספר AI36211 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, קרן המשפט של קרוליין וייס למחקר ברפואה מולקולרית, קרן המחקר לפיילוט לילדים של בית החולים לילדים בטקסס, ותוכנית המחקר ההתפתחותי של לימפומה SPORE ממכללת ביילור לרפואה ומכון המחקר המתודיסט.

<ol><li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li>
<li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li>
<li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time%2C+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+%28TIRF-STED-FCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li>
<li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

החידוש במחקר הנוכחי הוא שהוא משלב טכניקת SLB עם STED ללמוד סינפסות תא NK. מחקרים קודמים צילמו bilayer השומנים עם TIRF ללמוד היווצרות תאי T סינפסה 8 וסחר במולקולת איתות על קרום הפלזמה 6. אחרים תארו הדמיה STED של סינפסות תא NK באמצעות שקופיות זכוכית מצופה נוגדן 13,14. השיטה ההיברידית המתוארות כאן עוד בונה על מאמצים אלה על ידי ההדמיה סינפסה תא NK עם הבהירות המשופרת המוענקת על ידי הדמיה ברזולוציה סופר על פני השטח bilayer שומנים בדם, אשר מודלים טובים יותר המשטח הדינמי של APC. למרות SLBs הוא ממברנות מלאכותיות חסרות של שלד תא, רפסודות שומנים בדם, וligands האחר שתאי יעד בפועל או נגמ&quot;שים בעלי, טכניקה זו יכולה לשחזר תכונות חשובות כגון הניידות והתמצאות של הליגנדים. הדבר זה מאפשר למערכת SLB לשמש כגישת הרדוקציוניסטית בt לנתחהוא התרומה של קולטנים וligands בודדים להיווצרות של IS והדינמיקה של IS. התכונה החשובה ביותר של SLBs היא שחוקרים יכולים לשלב טכניקה זו עם גישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה confocal וTIRF. כניסתה של מיקרוסקופיה STED עוד יותר מגדילה את היתרון הזה, מספק תובנות חסרות תקדים למחקר והיישומים הקליניים שלה. ביקורת פוטנציאלית אחד של מערכת זו היא שSLB לא כראוי לחקות את פני השטח המורכבים של APC, ובכך הוליד תכונות אנטומיים פוטנציאל הלא-פיסיולוגיות בסינפסות וכתוצאה מכך. אמנם נכון שהרפרטואר המוגבל של מולקולות פני השטח על SLB לא לשחזר את פני השטח מאוכלסים הטרוגני של APC באופן מלא, מגבלה זו יכולה להיות גם יתרון בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לקבוע את ההשפעה של אינטראקציות קולט ויגנד בודדות על היווצרות הסינפסה . Tהנה כמה צעדים מכריעים בתהליך. בין הקריטי ביותר הוא חמצון של יפוזומים למנוע באמצעות כל הזמן באמצעות ארגון לעקור את החמצן בצינור והפתרון, כמו בשלבים 1.10, 2.6, 2.11 ו. חמצון של השומנים יגרום ניידות שומנים ירד, שהקשתה על היכולת של חלבוני פני השטח כדי לנוע בחופשיות ולהשתתף בבניית הסינפטי כך. כמו כן, הוא גם חיוני כדי להסיר את כל כלורופורם בliposome על ידי lyophilization (שלב 1.2). בקביעת צפיפות חלבון בbilayer השומנים בדם, יש חשיבות לפיזור ראשון חרוזים סיליקון לתוך השעיה הומוגנית חופשית מאשכולות. במידת צורך, ניתן ליישם sonication של חרוזים. בהרכבת SLB, הצעדים המוקדמים (5.1-5.8) בה coverslips מנוקים, הטיפות ממוקמות, וcoverslip מודבק חיוניים. טעות בכל אחד מאלה יכול לחייב תחילת הניסוי מעל (מהרישה של הסעיף 5). מסיבה זו, זהתרגול טוב כדי לנקות יותר מאשר coverslips יהיה צורך כדי לחסוך זמן במקרה של תקלה. ללא אשכולות הוא הנושא השכיח ביותר בעבודה עם מערכת זו. אם, כאשר לדמיין את התאים בשלב האחרון, אחד לא מצליח למצוא שום סינפסות ניאון, יש כמה צעדים שניתן לנקוט. כתם נוסף לקולטן על פני קרום תאו המקור ניתן להוסיף לחדר כדי לוודא שהתא לא יצר סינפסה עם bilayer, בעוד תאים יכולים לדבוק הלא-במיוחד על פני השטח coverslip זכוכית או bilayer, חלבוני פני השטח synaptically-מעורבים צריכים מופיע אשכולות להבדיל במטוס של ממשק התא-bilayer, ואילו חלבוני פני השטח היה מעורבים בקרב אמורים להופיע כתמים מפוזרים כסביב ההיקף של התא. צריכה שיטה זו נכשלת, יש לבדוק התאים שלהם באמצעות זרימת cytometry כדי להבטיח שהסמן המסוים אחד מקווה ללמוד בא לידי ביטוי בשפע נאות על פני התא. הגנה של מחזור משטח מסויםידוע ins להיות למטה מוסדר מעל לטווח ארוך בתרבות vivo. בעוד פרטי פרוטוקול זה במפורש כיצד לחזות היווצרות הסינפסה תאי NK, מערכת SLB יכול לשמש כדי לחקור היווצרות הסינפסה בכל immunocyte ניתן להעלות על הדעת, פשוט על ידי החלפה של יגנד העיקרי בשלב 5.11. ligands מרובה גם ניתן להוסיף בו-זמנית. אחד גם לא צריך להשתמש במערכת streptavidin ביוטין לדבקות חלבוני פני השטח בתוך bilayer. ניקל-נ.ת.ע: אינטראקציות היסטידין גם בת-קיימא. עם זאת, בשל החוזק הגבוה והספציפיות של streptavidin: האינטראקציה ביוטין, המעבדה שלנו מעדיפה מערכת זו. אפשר גם לשנות את הריכוז של תאים הוסיפו על bilayer מהצפיפות שנקבעה בשלב 5.13, כמו גם את משך תקופת הדגירה לאחר מכן כדי לצפות סינפסות בשלבים שונים של התבגרות. זה אפילו יכול להתבצע בשידור חי, אם כי זה כמובן אינו כולל את האפשרות של הדמיה str תאיתuctures (אלא אם כן הם כבר מסומנים עם תג ניאון התמזגו; המעבדה שלנו משתמשת בכמה שורות תאים שהשתנו כאמור). בשל הרמה הגבוהה של התאמה אישית אפשרית בפרוטוקול זה, אחד יכול להשתמש בטכניקת SLB הבסיסית, יחד עם ההדמיה STED, כדי לטפל במגוון רחב מאוד של שאלות באימונולוגיה, ביולוגיה של תא, וביוכימיה, כולל דינמיקה בסיסית שומנים 15, היווצרות הסינפסה 16, גרורות איתות תאית 17, ותאים סרטניים 18.

סינפסה החיסונית (IS) נמצאת בצומת קריטית להפעלת תא ותפקוד 1. זה המדיום העיקרי שבאמצעותו מצגת אנטיגן וחסינות תא בתיווך מתבצעים. המחקרים המיקרוסקופיים המוקדמים של היווצרות הסינפסה מנוצלים מערכת המצומד תאי תאים 2. המגבלה העיקרית בגישה זו היא שרוב conjugates ייחשב &quot;בפרופיל&quot;, כפי שהוא היה, ובכך מגביל את מבטו של הצופה של המבנה הסינפטי עצמו. בשנת 1999, המעבדה דסטין התייחסה מגבלה זו על ידי שימוש בטכניקת bilayer שומנים נתמך זכוכית (SLB) 3, שהיה חלוצה קודם לכן על ידי 4,5 המעבדה McConnel. גישה זו מסולק תאי הצגת אנטיגן (נגמ&quot;שים) לטובת משטח שומנים מישוריים-נתמך זכוכית, שאליו יכולים להיות מצורפים חלבונים ולנוע בחופשיות בשני ממדים. באמצעות שיטה זו, דסטין ועמיתים הצליחו להציץ ישירות לתוך tהוא סינפסה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוה, ובפעם הראשונה לקבל מבט &quot;פנים אל פנים&quot; במבנה של IS. עם השימוש במערכת SLB, הפרטים שבה ניתן דמיינו IS הוגבל רק על ידי המגבלות של טכניקות הדמיה הנוכחיות 6-8. באמצעות שימוש בטכניקות תאורה סטנדרטית, הרזולוציה המינימלית (כלומר, מרחק מינימאלי בין שני עצמים נפרדים שבה הם יכולים להיות מכובדים) כבר &lt;200 ננומטר על בסיס הקריטריון של ריילי 9. מגבלה זו מעכבת את ההדמיה של מבנים המרכיבים את סינפסה יפים מאוד, בקנה מידה מולקולרית, ועד פיתוח טכניקות הדמיה ברזולוציה סופר 10-12, הדמיה של מבנים אלה הייתה מרותקת להדמיה של תאים קבועים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. עם כניסתו האחרונה של מגוון רחב של טכניקות ברזולוציה סופר, כגון SIM (מיקרוסקופיה תאורה מובנה), PALM (מיקרוסקופיה photoactivated לוקליזציה), STORM (מיקרוסקופיה אופטית שחזור stochastical), וSTED 10-12, חוקרים יכולים ללמוד מבנים הסינפטי אלה בפירוט חסר תקדים, שבו יש בתורו סיפק הבנה הבהירה יותר ויותר של עכשיו. היתרונות של מיקרוסקופיה STED תוארו לפני 13. כאן אנו מתארים הדמיה ברזולוציה סופר עם מיקרוסקופיה STED מצויד בליזר דלדול 660 ננומטר החדש שפותח. בהשוואה לליזר דלדול 592 ננומטר הקונבנציונלי, לייזר 660 nm מאפשר מבחר רחב יותר של צבעי ניאון (ראה http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), במיוחד אלה fluorophores האדומה. פרסומים אחרים תארו ההדמיה STED של סינפסות תא NK בשקופיות זכוכית מצופה נוגדן 13,14. כאן, מערכת SLB בשילוב עם מיקרוסקופ STED ברזולוציה הסופר ללמוד סינפסה תא NK. טכניקה זו יש יתרון על פני antibody-שקופיות מצופים של להיות פסיפס נוזל, שבו חלבוני המשטח המשובצים יכולים לנוע בחופשיות במשטח שטוח דו-ממדי (מישור xy). זה נאמן יותר מחקה את פני השטח האורגניים וניידים של תא מטרה, וכתוצאה מכך יותר טוב משחזר את היווצרות סינפסה החיסונית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. המטרה של פרוטוקול זה היא לספק למשתמש הקצה עם תיאור מפורט של איך תמונת סינפסה החיסונית של תאי NK על ידי שילוב של מערכת SLB ומיקרוסקופיה STED ברזולוציה סופר. זה יספק למשתמש קצה עם את הצעדים דרושים כדי: להכין ליפוזומים, לבנות bilayers-משובץ חלבון, לקבוע את צפיפות החלבון על bilayers השומנים בדם, ולרכוש תמונות ברזולוציה סופר באמצעות מיקרוסקופ STED. טכניקות אלה אינן מוגבלים לתחום האימונולוגיה, ויכולות להיות מנוצלת באופן רחב על פני מגוון רחב של תחומים.

<table><tbody><tr><td>18:1 (&דלתא; 9-CIS) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850375C</td><td>תכשיר ליפוזום</td></tr><tr><td>18:1 כמוסת ביוטיניל PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (מלח נתרן) Avanti</td><td>&nbsp;</td><td>ברקוד 870273C&nbsp;</td><td>הכנת ליפוזום</td></tr><tr><td>גז ארגון, איירגז דחוס</td><td>&nbsp;</td><td>UN1006</td><td>תכשיר ליפוזום</td></tr><tr><td>ליופילייזר</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Freezone 7740020</td><td>הכנת ליפוזום</td></tr><tr><td>צינורות ליופילייזר</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>7540200</td><td>הכנת ליפוזום</td></tr><tr><td>עמודות כרומטוגרפיה</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-205558</td><td>הכנת ליפוזום</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>אמביון&nbsp;</td><td>AM9856</td><td>תכשיר ליפוזום</td></tr><tr><td>5 מ' NaCl</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9759</td><td>תכשיר ליפוזום</td></tr><tr><td>אוקטיל-ובטא;-D-גלוקופירנוסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>O1008</td><td>הכנת ליפוזום</td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html? LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html; FrName=Spectra%2FPor+RC+צינורות; rtm=ערכה;#KIT">מעבדות ספקטרום&nbsp; </a></td><td>132676</td><td>הכנת ליפוזום</td></tr><tr><td>96 בארות צלחת פוליסטירן תחתונה V (לא מטופלת)</td> <td>קביעת צפיפות נוגדנים</td> <td>קורנינג</td><td>3896</td></tr><tr><td>חרוזי סיליקה לא מתפקדים</td><td>מעבדות באנגס&nbsp;</td><td>קביעת צפיפות נוגדנים</td> <td>SS06N</td></tr><tr><td>צינורות FACS</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>14-959-2A&nbsp;</td><td>קביעת צפיפות הנוגדנים</td></tr><tr><td>חרוזי MESF של QuantumTM</td><td>Bangs Laboratories</td><td>קביעת צפיפות נוגדנים</td><td>משתנה</td></tr><tr><td>קזאין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>C0875</td><td>הכנת ליפידים דו-שכבתיים</td></tr><tr><td>HEPES תמיסת מלח חוצצת + 1% HSA</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>הכנת שומנים דו-שכבתית</td></tr><tr><td>סטרפטווידין&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים&nbsp;</td><td>434301</td><td>הכנת ליפידים דו-שכבתיים</td></tr><tr><td>חלבון ביוטיניל עם תווית פלואורסצנטית&nbsp;</td>הכנה <td>ביתית</td><td></td><td>ליפידים דו-שכבתיים</td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>80608</td><td>הכנת ליפידים דו-שכבתית</td></tr><tr><td>25x75 מ"מ כיסוי זכוכית</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>10812</td><td>הכנת ליפידים דו-שכבתית</td></tr><tr><td>מי חמצן (30%)</td><td>פישר סיינטיק&nbsp;</td><td>BP2633</td><td>הכנת ליפידים דו-שכבתיים</td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>258105</td><td>תכשיר ליפידים דו-שכבתי</td></tr><tr><td>D-ביוטין</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>B20656</td><td>הכנת ליפידים דו-שכבתיים</td></tr><tr><td>נייר עדשה</td><td>VWR&nbsp;</td><td>54826-001</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>שמן טבילה מסוג F</td><td>Leica&nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Leica TCS STED</td><td>Leica</td><td></td><td>להדמיה</td></tr></tbody></table>

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

המערכת הדו-שכבתית של השומנים המישוריים הנתמכת בזכוכית שימשה במגוון דיסציפלינות. אחד היישומים השימושיים ביותר של טכניקה זו היה בחקר היווצרות סינפסות אימונולוגיות, בשל היכולת של שכבות השומנים המישוריות הנתמכות בזכוכית לחקות את פני השטח של תא מטרה תוך יצירת ממשק אופקי. ההתקדמות האחרונה בהדמיה ברזולוציה גבוהה אפשרה למדענים לראות טוב יותר את הפרטים הקטנים של מבנה הסינפסות. במחקר זה, אחת הטכניקות המתקדמות הללו, דלדול פליטה מגורה (STED), משמשת לחקר המבנה של סינפסות תאי הרג טבעי (NK) על שכבת השומנים הדו-שכבתית הנתמכת. מסופק כאן פרוטוקול קל לביצוע המפרט: כיצד להכין פוספוליפידים סינתטיים גולמיים לשימוש בסינתזה של שכבות דו-שכבתיות הנתמכות בזכוכית; כיצד לקבוע באיזו צפיפות חלבון בריכוז נתון תופס את אתרי ההתקשרות של השכבה הדו-שכבתית; כיצד לבנות שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת המכילה נוגדנים כנגד קולטן CD16 המפעיל תאי NK; ולבסוף, כיצד לדמות תאי NK אנושיים על שכבה דו-שכבתית זו באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של STED, תוך התמקדות בהפצת גרגירים ליטיים חיוביים של פרפורין ואקטין חוטי בסינפסות NK. לפיכך, בשילוב מערכת דו-שכבתית של שומנים מישוריים הנתמכת בזכוכית עם טכניקת STED, אנו מדגימים את ההיתכנות והיישום של טכניקה משולבת זו, כמו גם מבנים תוך-תאיים בסינפסה אימונולוגית NK ברזולוציה על.

איור 1 מציג את התוצאה של צפיפות הנוגדן על bilayer השומנים. העיקרון הוא להשתמש חרוזים סטנדרטיים כדי להפוך את עקומת התקן של MESF לעומת MFI באמצעות cytometry זרימה (א). MFI של סדרת המדגם הוסב לMESF באמצעות העקומה סטנדרטית. צפיפות הנוגדן על bilayer השומנים מתואם באופן ליניארי עם ריכוז הנוגדנים (B). איור תמונת STED המשולש הצבע 2 תכנית של סינפסה NK על bilayer שומנים מישוריים זכוכית תמיכה. נוגדן Anti-CD16 על bilayer השומנים מצטבר, מפעילה מערך F- אקטין ואת הקיטוב וחדירה של perforin דרך הרשת F- אקטין בלוח המוקד של סינפסה החיסונית בתאי NK. שימוש בגישה משולבת זו, ניתן לצפות בצורה נקיה microclusters של fluorescently שכותרתו אנטי-CD16 בתוך SLB, אשר ישירות משקף את האשכולות של CD16 על תא NK. בהשוואה לתמונת confocal הקונבנציונלית, מבנה CENTRA CD16אשכול l ניתן להבחין בקלות רבה יותר בתמונה STED בשל הקרינה הסביבה המדולדלת. יתר על כן, ultrastructure של cytoskeleton אקטין נתפס עם רזולוציה משופרת באופן משמעותי. עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות 16,17, גרגרי ממס perforin חיובי נראים ממוקמים מעל האזורים של צפיפות F- אקטין נמוכה בתמונה STED, פרט מכריע שרובו הולך לאיבוד בתמונה confocal. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> איור 1. צפיפות של נוגדן 3G8 על bilayer שומנים. () מתאם לינארי בין MESF וMFI לסדרה סטנדרטית. (ב) קשר לינארי בין צפיפות חלבון וריכוז סדרת דילול חלבון מדגם ל, המציגה את מספר המונומרים חלבון fluorescently שהכותרת ל יחידת שטח כפונקציה של ריכוז הולך וגובר על si מצופה שומניםחרוזים Lica. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> איור 2. ההדמיה STED של סינפסה NK על bilayer שומנים מישוריים. תאים הראשוניים NK היו מגורה על SLB מכיל biotinylated אנטי-CD16 (אדום) שכותרתו fluorescently, קבועים, permeabilized, ולאחר מכן מוכתם בphalloidin (כחול) ואנטי-F- אקטין (ירוק). תא יחיד היה צילם ראשון תחת הגדרת confocal הרגילה, ולאחר מכן הגדרת STED. תמונות Confocal וSTED היו deconvoluted באמצעות תוכנת הויגנס. סרגל, 1 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מתארים כאן שילוב של טכניקת דו-שכבת השומנים הנתמכת בזכוכית ליצירת סינפסות אימונולוגיות עם טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED). מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים את ההוראות הדרושות לביצוע מוצלח של שתי טכניקות אלה.

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד ללכוד בהצלחה תמונות ברזולוציה גבוהה (super resolution) של סינפסות אימונולוגיות של תאי NK (תאי קטלנים טבעיים) על שכבה ליפידית דו-שכבתית נתמכת. דבר זה מושג על ידי בניית שכבה ליפידית פלנרית נתמכת בזכוכית המכילה נוגדנים נגד הרצפטור CD 16 המפעיל של תאי NK בתוך שקפיות עם תא (chamber slides). תאי NK שבודדו מראש מתווספים לאחר מכן לשכבה הליפידית הפלנרית המוטמעים בה הנוגדנים, ולאחר מכן התאים נצבעים עבור f actin ופרפורין.השלב הסופי הוא דימוי של סינפסות תאי ה-NK שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ STEAD, ובסופו של דבר דימוי של סינפסת ה-NK על שכבת ליפידים דו-שכבתית נתמכת. שימוש ב-STEAD מציג את סינפסת תאי ה-NK בפירוט מוגבר, מה שמאפשר ויזואליזציה של העל-מבנה של שלד התא מאקטין ושל גרנולות ליטיות חיוביות ל-perran הממוקמות מעל אזורים בעלי צפיפות נמוכה של F actin. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמחסום ליפידי מישורי נתמך בזכוכית יכול לדמות את ממברנת הפלסמה של תא מטרה, והחלבון על מחסום ליפידי מישורי זה.הם יכולים לנוע לצדדים, דבר שיכול לדמות טוב יותר את ההיווצרות של סינפסה חיסונית רלוונטית מבחינה לוגית. מסמך זה עשוי לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, ולאפשר לחוקרים להדמיות את היווצרות הסינפסה באופן מבוקר ובפירוט, דבר שאינו בר-ביצוע באמצעות גישות מיקרוסקופיות ומסחריות. פוסט-דוקטורנט וסטודנט לתואר מתקדם ידגימו את ההליך להרכבת שכבה ליפידית מישורית נתמכת בזכוכית.ראשית, הכינו 100 milliliters של תמיסת piranha על ידי ערבוב של מי חמצן 30% עם חומצה גופריתית ביחס של אחד לשלוש בתוך כלי כימי. הניחו שתי זכוכיות כיסוי מלבניות מספר 1.5 בתוך תמיסה זו למשך 20 עד 30 דקות לצורך ניקוין. הוציאו מבקרור אחת של ליפידים DOPC בריכוז 400 micromolar שהוכנו מראש, ומבקרור אחת של ליפידים biotin PE בריכוז 80 micromolar שהוכנו מראש.העבירו אותם על קרח למיכל הארגון לאחר הסרת חמצן (deoxy oxygenating) ממשפופרת מיקרו-צנטריפוגה חדשה באמצעות ארגון. הוסיפו יחד את ה-DOPC וה-biotin PE ביחס של אחד ለአחד. הנפח הספציפי ישתנה בהתאם לצרכים הניסויים, אך צריך להיות לפחות 2 µL.יש לאטום את מבחנה התערובת ואת מבחנות הריאגנטים הבודדות לפני החזרת הסולם למקרר. לאחר סיום הניקיון, יש לשטוף היטב את לוחות הכיסוי במים מזוקקים. יש להניח ללוחות הכיסוי להתייבש באוויר למשך מספר דקות, ולאחר מכן לשאוב 1.5 µL מתערובת הליפוזומים ולהניח אותה כטיפה אחת באחד מתאי הנתיבים של שקופית התאים.השימוש בשתי טיפות לכל נתיב הוא מקובל אך אינו הכרחי. כעת, הניחו במהירות וביעילות את כיסוי הזכוכית היבש מעל הטיפות, וודאו כי המרחק בין הטיפות מספיק כדי שלא יתמזגו לאחר הנחת כיסוי הזכוכית. בנוסף, וודאו שהטיפות נותרות עגולות ומוגדרות היטב מבלי לגעת בדפנות התא.לחץ בחוזקה בין כל נתיב ומסביב לו כדי להבטיח אטימה הרמטית למים של המכסה. סמן את מיקומי הטיפות באמצעות טוש סימון. לאחר מכן, העבר 100 µL של תמיסה מימית של 5% casing דרך התא כדי לחסום את השכבה הכפולה.יש לוודא שלא נותרו בועות בתוך תא הזרימה. לאחר מכן, מזריקים 100 µL של streptavidin בריכוז של 333 ng/mL לכל נתיב. לאחר דגירה של 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, שוטפים על ידי העברת 3 mL של HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin דרך כל נתיב.כדי להסיר את עודפי ה-streptavidin, הוסף 100 µL של anti-CD16 מסומן פלואורסצנטית ומסומן בביוטין בריכוז החלבון שנקבע מראש כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן הדגר בחושך למשך 20 עד 30 דקות. שטוף שוב על ידי העברת 3 mL של HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin דרך כל נתיב. לאחר מכן, העבר 100 µL של D-biotin בריכוז 25 nM דרך התא כדי לקשור כל עודף של streptavidin ובכך למנוע את הסיכוי לקישור לא ספציפי של streptavidin לתאים.בשלב הבא, ספרו את תאי ה-NK האנושיים ותלהם מחדש בריכוז של 500,000 למילליטר ב-HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin. שטפו את ה-D biotin מהתא באמצעות שלושה מיליליטרים נוספים של HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin לכל נתיב. לאחר שהתאים תולו מחדש בריכוז הרצוי, הוסיפו 100 µL לכל נתיב.הנח את התא באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 עד 60 דקות. לאחר תקופת אינקובציה זו, קבע את התאים באמצעות 4% paraform aldehyde בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות. שטוף על ידי העברת 3 mL של phosphate buffered saline דרך כל נתיב כדי להסיר את ה-paraform aldehyde.לאחר מכן, הוסיפו 400 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לפני הדגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בשלב הבא, צבעו את ה-f actin וה-perforin על ידי הוספת 2 µL של Phin מדלל המסומן פלואורסצנטית ושל נוגדן מונוקלונלי anti-perforin המסומן פלואורסצנטית; הדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפני השטיפה, באמצעות העברת 3 mL של תמיסת PBS (phosphate buffered saline) דרך התא. התא מוכן לתחילת הדמיה.הפעל את כל מודולי החומרה הדרושים של מיקרוסקופ ה-stead. הפעל את תוכנת ניתוח התמונות והפעל הן את מודול הסריקה הרזוננטית והן את מודולי ה-stead. לאחר ביצוע בחירות אלו, המתן כமூשלושה עד חמישה דקות עד שהתוכנה תעלה.לחצו על לשונית התצורה (configuration) בחלק העליון של המסך ובחרו בהגדרות הלייזר (laser config). לאחר מכן, הדליקו את האור הלבן ואת לייזרי ה-592 nanometer הקבועים. בחרו בעדשה עם הגדלה של 100x ויישרו את קרן לייזר העירור עם לייזר הדיפלציה (depletion) ב-592 nanometer.בחרו את מודול תצורת הלייזר, כבו את לייזר הדלטוריה (depletion) של 592 וסמנו כפעיל את לייזר הדלטוריה של 660 ננומטר. הניחו את הזכוכית על הבמה מעל העדשה. התמקדו בתאים הקשורים לאזור השכבה הכפולה (bilayer) המסומנת, באמצעות מנורת האור הלבן והעיניות.כעת חזרו ללשונית הרכישה (acquisition) שנמצאת מימין ללשונית התצורה (configuration). לחצו על לשונית המעבר לאור לבן (switch to white light), הפעילו את המודול וגררו את קו לייזר העירור לאורך הגל המתאים. לאחר בחירת הגלאי הרצוי והגדרת טווח הגילוי, לחצו על כפתור הסריקה הרצופה (sequential) בסרגל הכלים של הרכישה בצד שמאל, כדי להעלות את דיאלוג הסריקה הרצופה בחלק התחתון של סרגל הכלים השמאלי.פעולה זו מאפשרת למשתמש להוסיף רצפים מרובים, כאשר לכל רצף קרן עירור שונה עבור צבע שונה. לחצו בין הפריימים ולאחר מכן הגדירו את גלאי תדר העירור ואת טווח הגילוי עבור כל צבע נוסף. לאחר אופטימיזציה של כל ההגדרות, לחצו על start כדי להתחיל בתהליך הרכישה.תמונת ה-STEAD בצבעים משולשים של סינפסת תאי NK על שכבת ליפידים מישוריים נתמכת בזכוכית מראה כי נוגדן anti-CD 16 המוצג באדום מצטבר על שכבת הליפידים ומעורר יצירה של F-actin, וכן את הקיטוב והחדירה של perforin המוצג בכחול דרך רשת ה-F-actin במיקוד המרכזי. באמצעות גישה משולבת זו, ניתן להבחין בבירור במקבצי מיקרו של anti-CD 16 המסומנים פלואורסצנטית בתוך שכבת הליפידים הנתמכת בזכוכית, אשר משקפים ישירות את ההצטברות של CD 16 על תא ה-NK. בהשוואה לתמונת קונפוקלית קונבנציונלית, מבנה הטבעת של מקבץ ה-CD 16 המרכזי מובחן בקלות רבה יותר בתמונת ה-STEAD הודות להפחתת הפלואורסצנציה הסביבתית.יתרה מכך, המבנה העל-מיקרוסקופי של שלד האקטין נראה ברזולוציה משופרת באופן משמעותי. בהתאם לתצפיות קודמות, הגרנולות הליטיות החיוביות ל-perin נראות ממוקמות מעל אזורים בעלי צפיפות F actin נמוכה. בתמונת ה-stead, פרט מכריע זה אובד ברובו בתמונת הקונפוקאל. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן להשלימה תוך כארבע שעות במידה ומבוצעת כראוי במהלך העבודה.חשוב לזכור לשמור על הדגימה ללא חמצן על ידי דחיקה חוזרת של החמצן באמצעות ארגון, ובזמן הרכבת התא על ידי הנחה מהירה של זכוכית כיסוי על הדגימה וטבילתה בתמיסת המעטפת.

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

מאמר זה מתאר שיטה לחזות היווצרות הסינפסה virological HIV-1 המעטפה הנגרמת על bilayers זכוכית הנתמכים מישוריים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך פנימית (TIRF) השתקפות. השיטה ניתן גם לשלב עם כתמים immunofluorescence לזהות הפעלה חלוקה מחדש של מולקולות איתות המתרחשים במהלך היווצרות ה-HIV-1 המעטפה הנגרמת סינפסה virological.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ של יריעות אור הסריג כדי לדמיין אינטראקציות בין תאי T חיים ותאים מציגי אנטיגן. השיטה כוללת מיקוד יריעת אור סריג דקה במיוחד על זוג תאים המקיימים אינטראקציה כדי לקבל סדרה של תמונות דו-ממדיות, המשולבות לקבלת תמונות ארבע-ממדיות ברזולוציה גבוהה החושפות את הדינמיקה המרחבית-זמנית של האינטראקציה בין התא לתא.

מיקרוסקופ גיליון אור סריג כדי להמחיש אינטראקציות קולטן-ליגנד בתאים חיים

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית היווצרות הסינפסה החיסונית בתאי הרג טבעי (NK) על שכבה דו-שכבתית שומנית נתמכת (SLB). ה-SLB מסומן תחילה עם ליגנד קולטן של תא NK המתויג כפלואורופור, ולאחר מכן דגירה עם תאי NK. לאחר מכן, התאים מוכתמים עבור אקטין פולימרי גרגירים ליטיים חיוביים perforin. גישה זו מאפשרת הדמיה של היווצרות סינפסות באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

הדמיה ברזולוציית על של היווצרות סינפסה אימונולוגית של תאי NK על דו-שכבה ליפידית נתמכת

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר היווצרות סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים ראשוניים לבין דו-שכבות שומנים נתמכות (SLB). חלבוני פני השטח של תאי T מתקשרים עם ליגנדות בהתאמה המשותקות על SLB כדי ליצור סינפסה חיסונית, ואחריה תנועה של גרגירים ליטיים לכיוון הסינפסה, אשר מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

טכניקת מבחנה לחקר אינטראקציה של תאי T עם דו-שכבות שומנים מישוריות נתמכות

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול להדמיה על ידי Nanoscopy STED שני צבעים סינפסה החיסונית ציטוטוקסיות של תאי NK סכמו על זכוכית. שימוש בשיטה זו אנו מקבלים רזולוציה ננומטר תת -100 של חלבוני סינפסה ושלד התא.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

למד הדמיה ברזולוציה סופר של סינפסות תאי הרוצח הטבעי (NK) בשיטת STED על מישורי שומנים bilayer נתמכי-זכוכית. פרוטוקול זה מאפשר חקר מפורט של מבני הסינפסה החיסונית.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

גלה סרטונים נוספים