הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד ללכוד בהצלחה תמונות ברזולוציה גבוהה של הסינפסות האימונולוגיות של תאי הרג טבעיים או תאי NK על שכבת השומנים הדו-שכבתית הנתמכת. זה מושג על ידי בניית שכבת שומנים מישורית נתמכת זכוכית המכילה נוגדנים כנגד קולטן CD 16 המפעיל תאי NK בשקופיות תא. תאי ה-NK שבודדו בעבר מתווספים לאחר מכן לשכבת השומנים המוטמעת בנוגדנים המישוריים, ואחריהם צביעה של התאים ב-f אקטין ופרפורין.

השלב האחרון הוא הדמיה של הסינפסות של תאי ה-NK המתקבלות באמצעות מיקרוסקופ הסטד, ובסופו של דבר הדמיה של סינפסת ה-NK על שכבת השומנים הדו-שכבתית הנתמכת. השימוש במקום מציג את סינפסת תאי ה-NK בפירוט משופר, המאפשר הדמיה של מבנה האולטרה של שלד הציטו של האקטין וגרגירי ליטי חיוביים פראן הממוקמים על אזורים בעלי צפיפות אקטין F נמוכה. אז העיקר של טכניקה זו הוא שמחסום השומנים הרגיל התומך בזכוכית יכול לחקות את קרום הפלוס של תא טאק, החלבון על מחסום השומנים הרגיל הזה.

הם יכולים לנוע לרוחב, מה שיכול לסכם טוב יותר את היווצרות הסינפסה החיסונית הרלוונטית מאוד מבחינה הגיונית. מסר זה יכול לעזור לענות על נוצרים מרכזיים בתחום האימונולוגיה, ולאפשר לחוקרים לדמיין את היווצרות הסינפסות באופן מבוקר עם פירוט, דבר שאינו ניתן להשגה על ידי שימוש בגישות מסחריות ומיקרוסקופיות. עמית פוסט-דוקטורט, ציור ומענק לסטודנטים לתארים מתקדמים ידגימו את ההליך להרכבת שכבת השומנים המישורית הנתמכת בזכוכית.

ראשית, הכינו 100 מיליליטר תמיסת פיראנה על ידי ערבוב של 30% מי חמצן עם חומצה גופרתית ביחס של אחד לשלושה בכוס לתמיסה זו. הנח שני פתקי כיסוי מלבניים מספר 1.5 למשך 20 עד 30 דקות בזמן ניקוי פתקי הכיסוי. אחזר שפופרת אחת של 400 שומני DOPC מיקרו-מולאריים שהוכנו בעבר ושפופרת אחת של 80 שומני PE ביוטין מיקרו-מולאריים שהוכנו בעבר.

העבירו אותם על קרח למיכל הארגון לאחר חמצון דאוקסי צינור מיקרו צנטריפוגה חדש עם ארגון. חבר יחד את ה-DOPC וביוטין PE ביחס של אחד לאחד. הנפח הספציפי ישתנה בהתאם לצרכי הניסוי, אך צריך להיות לפחות שני מיקרוליטר.

כל דאוקסי מחמצן את צינור התערובת ואת צינורות הריאגנטים האישיים לפני החזרת הסולם למקרר. לאחר סיום הניקוי, יש לשטוף היטב את החלקות הכיסוי במים מזוקקים. הנח את המכסה להחליק החוצה לייבוש באוויר למשך מספר דקות, ולאחר מכן משוך 1.5 מיקרוליטר מתערובת הליפוזום והוציא בטיפה אחת לאחד מתאי הנתיב של מגלשת תא.

השימוש בשתי טיפות לכל נתיב הוא אופייני אך לא הכרחי. כעת, במהירות וביעילות, הנח את החלקת הכיסוי היבש מעל הטיפות, וודא שהטיפות מרווחות מספיק כדי שלא יתמזגו לאחר הנחת החלקת הכיסוי. יתר על כן, וודאו שהטיפות נשארות עגולות ומוגדרות היטב מבלי לגעת בשולי קירות החדר.

לחץ כלפי מטה בחוזקה בין ומסביב לכל נתיב כדי להבטיח אטימה אטומה למים בין המכסה. החלקה והחלקה, סמן את מיקומי הטיפות באמצעות עט טוש. לאחר מכן העבירו 100 מיקרוליטר של מעטפת מימית של 5% דרך החדר כדי לחסום את השכבה הדו-שכבתית.

נסו לוודא שאין בועות בתא הזרימה. לאחר מכן יש להזריק 100 מיקרוליטר של אדין סטרפט בריכוז של 333 ננוגרם למיליליטר לכל נתיב. לאחר הדגירה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, יש לשטוף על ידי הזרמת שלושה מיליליטר של תמיסת מלח עם אלבומין סרום אנושי של 1% בכל נתיב.

כדי להסיר את עודפי הטריטין, הוסף 100 מיקרוליטר של ביוטינילציה פלואורסצנטית המסומנת אנטי CD 16 בריכוז החלבון שנקבע בעבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט לאחר הדגירה בחושך למשך 20 עד 30 דקות. שטפו שוב על ידי הזרמת שלושה מיליליטר של תמיסת מלח עם אלבומין אנושי של 1% בכל נתיב. לאחר מכן הזרימו 100 מיקרוליטר של ביוטין D בריכוז של 25 ננו-מולרי דרך התא על מנת לקשור כל טאבין STR עודף ובכך לבטל את הסיכוי לקשירה לא ספציפית של טאבין STR לתאים.

לאחר מכן, ספרו תאי NK אנושיים והשעו אותם מחדש בריכוז של 500,000 למיליליטר בערימות של תמיסת מלח עם 1% אלבומין בסרום אנושי. שטפו את ביוטין D מהתא עם עוד שלושה מיליליטר של תמיסת מלח עם 1% אלבומין בסרום אנושי לכל נתיב. לאחר שהתאים הושעו מחדש בריכוז הרצוי, הוסף 100 מיקרוליטר לכל נתיב.

הנח את החדר בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% למשך 30 עד 60 דקות. לאחר תקופת דגירה זו, תקן את התאים עם 4% אלדהיד פרפורמים בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות. שטפו על ידי הזרמת שלושה מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט בכל נתיב כדי להסיר את הפרפורם אלדהיד.

לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של חיץ חוסם לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, יש לצבוע אקטין ופרפורין על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של Phin מדולל עם תווית פלואורסצנטית ונוגדנים חד שבטיים נגד פראן מדגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפני הכביסה על ידי העברת שלושה מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט דרך החדר. החדר מוכן לתחילת ההדמיה.

הפעל את כל מודולי החומרה הדרושים של המיקרוסקופ הקבוע. הפעל את תוכנת ניתוח התמונה והפעל גם סריקת תהודה וגם מודולי סטד. לאחר ביצוע בחירות אלה, המתן כשלוש עד חמש דקות עד שהתוכנה תתחיל.

לחץ על לשונית התצורה בחלק העליון של המסך, בחר תצורת לייזר. לאחר מכן הפעל את האור הלבן ואת הלייזרים הקבועים של 592 ננומטר. בחר את המטרה פי 100 ויישר את קרן לייזר העירור עם לייזר דלדול של 592 ננומטר.

בחר את מודול תצורת הלייזר, כבה את לייזר הדלדול 592 והפעל את לייזר הדלדול של 660 ננומטר. הנח את השקופית על ה-stagמעל העדשה. הבא את התאים הקשורים באזור הדו-שכבתי המסומן למיקוד באמצעות מנורת האור הלבן והעיניות.

לאחר מכן חזור ללשונית הרכישה ישירות מימין ללשונית התצורה. לחץ על המתג ללשונית אור לבן ולאחר מכן הפעל את המודול וגרור את קו לייזר העירור לאורך הגל המתאים. לאחר בחירת הגלאי הרצוי והגדרת טווח הזיהוי, לחץ על הכפתור הרציף בסרגל הכלים השמאלי כדי להעלות את תיבת הדו-שיח של הסריקה הרציפה בתחתית סרגל הכלים השמאלי.

זה מאפשר למשתמש להוסיף מספר רצפים שלכל אחד מהם קרן עירור שונה לצבע אחר. לחץ בין פריימים ולאחר מכן הגדר את גלאי תדר העירור וטווח הזיהוי עבור כל צבע נוסף. לאחר אופטימיזציה של כל ההגדרות, לחץ על התחל כדי להתחיל בתהליך הרכישה.

התמונה המשולשת של סינפסת תאי NK על שכבת שומנים מישורית נתמכת זכוכית מראה כי נוגדן אנטי CD 16 המוצג באדום מצטבר על שכבת השומנים הדו-שכבתית המפעילה היווצרות אקטין F, והקיטוב והחדירה של פרפורין מוצגים בכחול דרך רשת f אקטין בפאנל המוקד. באמצעות גישה משולבת זו, ניתן לצפות בצורה נקייה באשכולות המיקרו של אנטי CD 16 המסומן פלואורסצנטי בתוך שכבת השומנים הדו-שכבתית הנתמכת בזכוכית, המשקפת ישירות את ההתקבצות של CD 16 בתא NK. בהשוואה לתמונה הקונפוקלית הקונבנציונלית, מבנה הטבעת של הצביר המרכזי CD 16 ניתן להבחין בקלות רבה יותר בתמונה היציבה עקב הקרינה הסביבתית המדולדלת.

יתר על כן, מבנה האולטרה של שלד הציטו אקטין נראה ברזולוציה משופרת משמעותית. בהתאם לתצפיות קודמות, הגרגירים הליטיים החיוביים של פרין נראים ממוקמים על פני אזורים בעלי צפיפות F אקטין נמוכה. בתמונה במקום, פרט מכריע אשר הולך לאיבוד בעיקר בתמונה הקונפוקלית לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בסביבות ארבע שעות אם היא נעשית כראוי תוך כדי המעבר עליה.

חשוב לזכור לשמור על הדגימה שלך לא מחומצנת באמצעות עקירה חוזרת ונשנית של החמצן עם ארגון, ובעת הרכבת התא על ידי הנחת החלקה מהירה של המכסה מעל הדגימה שלך וטבילתה בתמיסת המעטפת.