הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד ללכוד בהצלחה תמונות ברזולוציה גבוהה (super resolution) של סינפסות אימונולוגיות של תאי NK (תאי קטלנים טבעיים) על שכבה ליפידית דו-שכבתית נתמכת. דבר זה מושג על ידי בניית שכבה ליפידית פלנרית נתמכת בזכוכית המכילה נוגדנים נגד הרצפטור CD 16 המפעיל של תאי NK בתוך שקפיות עם תא (chamber slides). תאי NK שבודדו מראש מתווספים לאחר מכן לשכבה הליפידית הפלנרית המוטמעים בה הנוגדנים, ולאחר מכן התאים נצבעים עבור f actin ופרפורין.

השלב הסופי הוא דימוי של סינפסות תאי ה-NK שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ STEAD, ובסופו של דבר דימוי של סינפסת ה-NK על שכבת ליפידים דו-שכבתית נתמכת. שימוש ב-STEAD מציג את סינפסת תאי ה-NK בפירוט מוגבר, מה שמאפשר ויזואליזציה של העל-מבנה של שלד התא מאקטין ושל גרנולות ליטיות חיוביות ל-perran הממוקמות מעל אזורים בעלי צפיפות נמוכה של F actin. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמחסום ליפידי מישורי נתמך בזכוכית יכול לדמות את ממברנת הפלסמה של תא מטרה, והחלבון על מחסום ליפידי מישורי זה.

הם יכולים לנוע לצדדים, דבר שיכול לדמות טוב יותר את ההיווצרות של סינפסה חיסונית רלוונטית מבחינה לוגית. מסמך זה עשוי לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, ולאפשר לחוקרים להדמיות את היווצרות הסינפסה באופן מבוקר ובפירוט, דבר שאינו בר-ביצוע באמצעות גישות מיקרוסקופיות ומסחריות. פוסט-דוקטורנט וסטודנט לתואר מתקדם ידגימו את ההליך להרכבת שכבה ליפידית מישורית נתמכת בזכוכית.

ראשית, הכינו 100 milliliters של תמיסת piranha על ידי ערבוב של מי חמצן 30% עם חומצה גופריתית ביחס של אחד לשלוש בתוך כלי כימי. הניחו שתי זכוכיות כיסוי מלבניות מספר 1.5 בתוך תמיסה זו למשך 20 עד 30 דקות לצורך ניקוין. הוציאו מבקרור אחת של ליפידים DOPC בריכוז 400 micromolar שהוכנו מראש, ומבקרור אחת של ליפידים biotin PE בריכוז 80 micromolar שהוכנו מראש.

העבירו אותם על קרח למיכל הארגון לאחר הסרת חמצן (deoxy oxygenating) ממשפופרת מיקרו-צנטריפוגה חדשה באמצעות ארגון. הוסיפו יחד את ה-DOPC וה-biotin PE ביחס של אחד ለአחד. הנפח הספציפי ישתנה בהתאם לצרכים הניסויים, אך צריך להיות לפחות 2 µL.

יש לאטום את מבחנה התערובת ואת מבחנות הריאגנטים הבודדות לפני החזרת הסולם למקרר. לאחר סיום הניקיון, יש לשטוף היטב את לוחות הכיסוי במים מזוקקים. יש להניח ללוחות הכיסוי להתייבש באוויר למשך מספר דקות, ולאחר מכן לשאוב 1.5 µL מתערובת הליפוזומים ולהניח אותה כטיפה אחת באחד מתאי הנתיבים של שקופית התאים.

השימוש בשתי טיפות לכל נתיב הוא מקובל אך אינו הכרחי. כעת, הניחו במהירות וביעילות את כיסוי הזכוכית היבש מעל הטיפות, וודאו כי המרחק בין הטיפות מספיק כדי שלא יתמזגו לאחר הנחת כיסוי הזכוכית. בנוסף, וודאו שהטיפות נותרות עגולות ומוגדרות היטב מבלי לגעת בדפנות התא.

לחץ בחוזקה בין כל נתיב ומסביב לו כדי להבטיח אטימה הרמטית למים של המכסה. סמן את מיקומי הטיפות באמצעות טוש סימון. לאחר מכן, העבר 100 µL של תמיסה מימית של 5% casing דרך התא כדי לחסום את השכבה הכפולה.

יש לוודא שלא נותרו בועות בתוך תא הזרימה. לאחר מכן, מזריקים 100 µL של streptavidin בריכוז של 333 ng/mL לכל נתיב. לאחר דגירה של 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, שוטפים על ידי העברת 3 mL של HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin דרך כל נתיב.

כדי להסיר את עודפי ה-streptavidin, הוסף 100 µL של anti-CD16 מסומן פלואורסצנטית ומסומן בביוטין בריכוז החלבון שנקבע מראש כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן הדגר בחושך למשך 20 עד 30 דקות. שטוף שוב על ידי העברת 3 mL של HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin דרך כל נתיב. לאחר מכן, העבר 100 µL של D-biotin בריכוז 25 nM דרך התא כדי לקשור כל עודף של streptavidin ובכך למנוע את הסיכוי לקישור לא ספציפי של streptavidin לתאים.

בשלב הבא, ספרו את תאי ה-NK האנושיים ותלהם מחדש בריכוז של 500,000 למילליטר ב-HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin. שטפו את ה-D biotin מהתא באמצעות שלושה מיליליטרים נוספים של HEPES buffered saline עם 1% human serum albumin לכל נתיב. לאחר שהתאים תולו מחדש בריכוז הרצוי, הוסיפו 100 µL לכל נתיב.

הנח את התא באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 עד 60 דקות. לאחר תקופת אינקובציה זו, קבע את התאים באמצעות 4% paraform aldehyde בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות. שטוף על ידי העברת 3 mL של phosphate buffered saline דרך כל נתיב כדי להסיר את ה-paraform aldehyde.

לאחר מכן, הוסיפו 400 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לפני הדגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בשלב הבא, צבעו את ה-f actin וה-perforin על ידי הוספת 2 µL של Phin מדלל המסומן פלואורסצנטית ושל נוגדן מונוקלונלי anti-perforin המסומן פלואורסצנטית; הדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפני השטיפה, באמצעות העברת 3 mL של תמיסת PBS (phosphate buffered saline) דרך התא. התא מוכן לתחילת הדמיה.

הפעל את כל מודולי החומרה הדרושים של מיקרוסקופ ה-stead. הפעל את תוכנת ניתוח התמונות והפעל הן את מודול הסריקה הרזוננטית והן את מודולי ה-stead. לאחר ביצוע בחירות אלו, המתן כமூשלושה עד חמישה דקות עד שהתוכנה תעלה.

לחצו על לשונית התצורה (configuration) בחלק העליון של המסך ובחרו בהגדרות הלייזר (laser config). לאחר מכן, הדליקו את האור הלבן ואת לייזרי ה-592 nanometer הקבועים. בחרו בעדשה עם הגדלה של 100x ויישרו את קרן לייזר העירור עם לייזר הדיפלציה (depletion) ב-592 nanometer.

בחרו את מודול תצורת הלייזר, כבו את לייזר הדלטוריה (depletion) של 592 וסמנו כפעיל את לייזר הדלטוריה של 660 ננומטר. הניחו את הזכוכית על הבמה מעל העדשה. התמקדו בתאים הקשורים לאזור השכבה הכפולה (bilayer) המסומנת, באמצעות מנורת האור הלבן והעיניות.

כעת חזרו ללשונית הרכישה (acquisition) שנמצאת מימין ללשונית התצורה (configuration). לחצו על לשונית המעבר לאור לבן (switch to white light), הפעילו את המודול וגררו את קו לייזר העירור לאורך הגל המתאים. לאחר בחירת הגלאי הרצוי והגדרת טווח הגילוי, לחצו על כפתור הסריקה הרצופה (sequential) בסרגל הכלים של הרכישה בצד שמאל, כדי להעלות את דיאלוג הסריקה הרצופה בחלק התחתון של סרגל הכלים השמאלי.

פעולה זו מאפשרת למשתמש להוסיף רצפים מרובים, כאשר לכל רצף קרן עירור שונה עבור צבע שונה. לחצו בין הפריימים ולאחר מכן הגדירו את גלאי תדר העירור ואת טווח הגילוי עבור כל צבע נוסף. לאחר אופטימיזציה של כל ההגדרות, לחצו על start כדי להתחיל בתהליך הרכישה.

תמונת ה-STEAD בצבעים משולשים של סינפסת תאי NK על שכבת ליפידים מישוריים נתמכת בזכוכית מראה כי נוגדן anti-CD 16 המוצג באדום מצטבר על שכבת הליפידים ומעורר יצירה של F-actin, וכן את הקיטוב והחדירה של perforin המוצג בכחול דרך רשת ה-F-actin במיקוד המרכזי. באמצעות גישה משולבת זו, ניתן להבחין בבירור במקבצי מיקרו של anti-CD 16 המסומנים פלואורסצנטית בתוך שכבת הליפידים הנתמכת בזכוכית, אשר משקפים ישירות את ההצטברות של CD 16 על תא ה-NK. בהשוואה לתמונת קונפוקלית קונבנציונלית, מבנה הטבעת של מקבץ ה-CD 16 המרכזי מובחן בקלות רבה יותר בתמונת ה-STEAD הודות להפחתת הפלואורסצנציה הסביבתית.

יתרה מכך, המבנה העל-מיקרוסקופי של שלד האקטין נראה ברזולוציה משופרת באופן משמעותי. בהתאם לתצפיות קודמות, הגרנולות הליטיות החיוביות ל-perin נראות ממוקמות מעל אזורים בעלי צפיפות F actin נמוכה. בתמונת ה-stead, פרט מכריע זה אובד ברובו בתמונת הקונפוקאל. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן להשלימה תוך כארבע שעות במידה ומבוצעת כראוי במהלך העבודה.

חשוב לזכור לשמור על הדגימה ללא חמצן על ידי דחיקה חוזרת של החמצן באמצעות ארגון, ובזמן הרכבת התא על ידי הנחה מהירה של זכוכית כיסוי על הדגימה וטבילתה בתמיסת המעטפת.