Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור AA מבודד לעומת נמל מבטחים אחד, תאי גזע פלוריפוטנטיים ממוקדים הניתנים להשראה או שיבוטי IPSC המבטאים GFP. זה מושג על ידי אספקה ראשונה של AAVs אחד טלונים ו-A VS אחד של פלסמידים תורמים C-A-G-E-G-F-P ביעילות לתוך IPCs על ידי חיבה נוקלאו. בשלב השני, התאים הממוקדים A לעומת אחד נבחרים על ידי pur mycin על תאי הזנה עובריים של עכברים.

לאחר מכן, ה-GFP הבודד המבטא שיבוטים ממוקדים A A VS אחד נאסף לצלחת מצופה מטריג'ל 96 בארות. בשלב האחרון, שיבוטי A A VS ONE G-F-P-I-P-S-C מורחבים עם שמונה טכניקות תרבית IPSC בינוניות וסטנדרטיות. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית וציטומטריית זרימה משמשים כדי להראות את הביטוי האחיד והחזק של GFP בשיבוטי IPSC אנושיים ממוקדים AA VS אחד.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי איסוף המושבה כוללים מיקרו-דיסקציה של שיבוטים ממוקדים באמצעות כלי איסוף מושבות מיוחדים תחת מיקרוסקופ, דבר שקשה ללמוד במהלך הוראה זה לצד זה. התחל בשטיפת תרביות IPSC פעם אחת כל אחת עם PBS. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה עדין של תאים 37 מעלות צלזיוס לכל באר ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות כאשר יותר מ-50% מהתאים התנתקו מכלי התרבית.

השתמש בפיפטה P 1000 כדי לשבש מכנית את כל גושי התאים שנותרו או תאים מחוברים. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של E שמונה בינוני לכל באר והשתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לפרק עוד יותר את התרביות לתרחיפים של תאים בודדים. כעת אסוף את התאים שנקטפו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וסובב אותם כלפי מטה.

השעו מחדש את הגלולה בכמות מינימלית של E שמונה בינוני לספירה. לאחר מכן, לאחר אישור הכדאיות של התרביות על ידי הדרה כחולה טריאן, כמו גם הדיסוציאציה המספקת שלהם, העבירו 3 מיליון תאים לכל אחד משני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר בעוד שתאי הצנטריפוגה הגדירו את מערכת האלקטרופורציה לתוכנית הספציפית לסוג התא עבור קו תאי הגזע העובריים האנושיים H 9. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוגרם של תורם הרקומבינציה ההומולוגית בלבד לכדור אחד עבור דגימת הבקרה ו-10 מיקרוגרם של פלסמיד תורם רקומבינציה הומולוגית, יחד עם חמישה מיקרוגרם מכל פלסמיד טאלון עבור דגימת הניסוי.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת טרנספקציה של שלושה תאים ראשוניים בטמפרטורת החדר לכל אחד מכדורי הבקרה והניסוי והשעיה מחדש של התאים. העבירו את הדגימות לקובטות בודדות ולאחר מכן אכלו את הדגימות מיד לאחר הטרנספקציה. הוסף 500 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר E שמונה מדיום לכל Q וטרינר ולאחר מכן העביר את דגימות ה- IPSC המועברות בטיפה לתוך צלחות בודדות של 10 סנטימטר המכילות DR ארבעה פיברובלסטים עובריים של עכבר לפני בחירת המושבות, למד היטב במשותף צלחת 96 באר עם 50 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת קרום מרתף ולאחר מכן אחסן את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת בבוקר.

כאשר הצלחת הגיעה לטמפרטורת החדר, שאפו את התמיסה העודפת וטענו כל באר ב-100 מיקרוליטר של E שמונה בינוני בתוספת 10 מיקרו-מולרי Y 2 7 6 3 2. לאחר מכן, הכניסו מיקרוסקופ הפוך לארון בטיחות ביולוגי ועקרו אותו בתרסיס קל של 70% אתנול. לאחר מכן הניחו פיפטת מרעה מזכוכית מעל מבער בונסן כדי ליצור כלי קטיף מושבה עם וו זעיר בקצה לאחר עיקור עם 70% אתנול.

הנח את הקרס במכסה המנוע לייבוש ולאחר מכן הנח את תרבית ה-IPSE על במת המיקרוסקופ כדי לבחור את השיבוטים. אתר מושבה מתאימה בהגדלה נמוכה והשתמש בכלי איסוף המושבה כדי לעקוב אחריה ולרבע אותה. לאחר מכן מגרדים בעדינות את המושבה המרובעת מכלי התרבות והשתמשו בפיפטה P 200 המוגדרת לכ-30 מיקרוליטר כדי לאסוף את ה-IPCs הצפים בחופשיות ומצפים את התאים ישירות על מטריצת קרום המרתף.

בזמן הקציר, ה-IPCs צריכים להתחבר תוך שעתיים עד ארבע שעות מהציפוי. לבסוף דגרו את המושבות שנקטפו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ורענן את התאים עם E 8 בינוני מלא למחרת בבוקר. חשוב להעביר רק תאי גז מסוג I באיכות גבוהה לאורך כל הניסוי.

תרביות ה-IPSC צריכות להכיל בעיקר מושבות נפרדות הנושאות אבן מרוצפת כמו מורפולוגיה כמו התאים הנראים כאן והתאים הממוינים לא צריכים יותר מ-10% מהתרבית, ניתן להעריך ולייעל את יכולת הטרנספקט של ה-IPCs באמצעות וקטור PAX GFP הקטן שכן טרנספקציה עם PAX GFP מייצגת בדרך כלל את היעילות המקסימלית הניתנת להשגה בשל גודלו הקטן. הביטוי החולף של אינטל A VS אחד C-A-G-E-G-F-P ו-IPCs שעברו טרנספקציה מגיע לשיא ב-48 עד 72 שעות לאחר הטרנספקציה, שניתן לאשר עם חלק קטן של תאים שעברו טרנספטציה על ידי ציטומטריית זרימה. יעילות הטרנספקציה יכולה להשתנות מאוד.

אפילו בניסויים עם שבר חיובי של GFP הוא רק 10%שיבוטים בודדים המציגים פלואורסצנטיות אחידה צריכים להיות גדולים מספיק לבחירת מושבה לאחר בחירת מיצין טהורה. יתר על כן, פעם אחת ב-96, פורמט טוב שיבוטי ה-IPSC הממוקדים המורחבים צריכים להציג ביטוי יציב ואחיד של GFP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר PSCs I ביעילות על ידי חיבה גרעינית וכיצד לבודד AV נמל מבטחים אחד.

שיבוטי IPSE ממוקדים באמצעות כלי איסוף מושבות.