Name: חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: חקור את מנגנוני הפרשת הגרגרים בתאי פיטום באמצעות ניתוח גנומי פונקציונלי. השיטה משתמשת בגן מדווח פלואורסצנטי ובדימות קונפוקלי כדי לנטר אקסוציטוזה בזמן אמת ולנתח מורפולוגיה של גרגרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר א Ashery על המתנה של NPY-mRFP cDNA. אנו מודים בני הזוג. MJ Kofron, ל &#39;מיטלמן, מ&#39; שרבני, וי &#39;זילברשטיין לסיוע לא יסולא בפז עם מיקרוסקופ ותמונת ניתוחים. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר יוסף אורלי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע, שנוסד על ידי האקדמיה הלאומית הישראלית למדעים (1139-1112 לRS-E.).

1. הכנת Cell RBL תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 500 מיליליטר של המדיום של הנשר שונה של גלוקוז הנמוך Dulbecco (DMEM) עם 56 מיליליטר של סרום שור עוברי (זה עושה 10% FBS), ולאחר מכן להוסיף 5.5 מיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין (זה עושה דברה ~ 1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התקשורת באמצעות מסנני אבק בקבוק למעלה 500-1,000 מיליליטר עם גודל הנקבובית 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. תרבות של תאי RBL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי RBL באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס בשתי צלחות או צלוחיות. תאי RBL שגדלים בצלחות 10 סנטימטר צריכים להיות בתוספת 10 מיליליטר בינוני וליצור monolayer ומחוברות של ~ 10 7 תאים / צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שכבת התאים מתקרבת מפגש, replate התרבות בצפיפות נמוכה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק בעזרת פיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed (37מעלות צלזיוס) 0.25% טריפסין / EDTA המכסה את כל monolayer (הנפח תלוי בגודל של צלחת התרבות / בקבוק; 2 מיליליטר במשך 10 צלחת סנטימטרים). זה לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשטוף את monolayer התא עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), להסיר את PBS ולהוסיף (37 ° C) טריפסין prewarmed / EDTA. צעד זה מנתק את התאים מהירים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ האופטי כדי לבדוק אם הם מנותקים. אם התאים לא לנתק אחרי 10 דקות, לטפוח בעדינות על הצלחת / הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של המדיום צריך להיות לפחות פי 2 יותר גדולים מהנפח של פתרון טריפסין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 גרם ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בינוניים. לדלל את התאים על ידי 01:10 וזרע בצלחת התרבות חדשה. דגירה התאים במשך 48-72 שעות, עד שהם reacמפגש כ -90% h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך (סעיף 2.2.1-2.2.8) לתקופה של עד 3 חודשים (30 קטעים). </li></ol></li></ol> 3. הכנת Transfection מדיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 100 מ&quot;מ של K-צינורות pH 7, 1 פתרון מ&quot;מ של אצטט Ca 2 + ו -100 מ&quot;מ פתרון של אצטט Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון של pH K-צינורות 7 מ&quot;מ 100 ל -20 מ&quot;מ באמצעות תקשורת DMEM, להוסיף את פתרון 1 מ&quot;מ של אצטט Ca 2 + לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו -100 מ&quot;מ פתרון של אצטט Mg 2 + לריכוז סופי של 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל גלוטמט אשלגן ולהוסיף לפתרון לריכוז סופי של 128 מ&quot;מ, ומערבב היטב ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. שמור את הפתרונות שנותרו (כלומר., K-צינורות, Ca 2 + אצטט, Mg 2 + אצטט) ב -20 ° C. </li></ol> 4. Transfection של תאי RBL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק באמצעותפיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed טריפסין (37 מעלות צלזיוס) / EDTA צריך שמכסה את כל השכבה. מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות). בדקו אם התאים יש מנותקים באמצעות מיקרוסקופ האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של התקשורת צריך להיות לפחות 2-גדולים יותר מאשר הנפח של פתרון טריפסין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1.5 × 10 7 תאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 XG ב 25 ° C. מחק את supernatants ולהוסיף 280 μl של מדיום transfection. העבר את תערובת התגובה ל -4 קובט מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מיקרוגרם של פלסמיד NPY-mRFP וגם 30 מיקרוגרם של פלסמיד הריק שליטה או פלסמיד נבדק. הנפח הסופי של תערובת התגובה צריך להיות 300 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מניח על קרח במשך 10 דקות. נגב את קובט ממים וp שיירroceed לelectroporation ב 300 V ל9 msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות של exocytosis, replate התאים באופן מיידי ב -24 מנות בתרבית רקמה המכילות גם 300 בינוני μl. הוסף 8 μl של תערובת התגובה (4 × 10 5 תאים) זה טוב. להוסיף תאי transfected 4 שאינם × 10 5 לבארות נוספות לשליטה. הכן מספיק בארות ליש לפחות לשכפל בארות עבור כל טיפול לכל transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה זמן לשגות, replate התאים באופן מיידי במערכת coverglass הקאמרית ורוסיליקט 8-היטב המכילה 80 בינוני μl. להוסיף 1.5 μl של תערובת התגובה (7.5 × 10 4 תאים) לכל תא. (נסה להימנע משימוש בתאי בקצה coverglass, התאים במרכז coverglass קלים יותר לתמונה). הערה: חשוב לציין, שלא כל תאי תגובה להדק ולעתים מיקרוסקופיה הזמן לשגות היא בטלה כתוצאה מאובדן המיקוד וסחיפה של borosi קאמרי 8 היטבמערכת coverglass licate. לכן, להכין לפחות 8 תאים עבור כל טיפול לכל transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרגישות התאים להפעלה בתיווך FcεRI, להוסיף 1 מיקרוגרם / מיליליטר של DNP העכבר חד שבטי ספציפיים IgE לתקשורת (דגירה התאים עם IgE לפחות 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 18-24 שעות להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שהתאים להביע פלסמידים. אורכי גל העירור ופליטה של ​​הקרינה mRFP הם: 584 λEx, λEm 607 ננומטר. NPY-mRFP אמורה להופיע במבני לפוחי שהמתאימים לSGS. אם הגן השני של עניין הוא התמזגה לתג פלורסנט להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את שיתוף הביטוי של שני פלסמידים באותו התאים. לדוגמא, אם הגן נבדק התמזג GFP, אורכי גל העירור ופליטה של ​​הקרינה GFP הם: 488 λEx, λEm 507 ננומטר. חלבון GFP מתויג אמור להופיע באותו תאים המבטאים NPY-mRFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות exocytosis להמשיך to שלב 5 ולמיקרוסקופיה הזמן לשגות, המשך לשלב 6. </li></ol> 5. מדידת NPY-mRFP Exocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיץ Tyrode: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 54 מ&quot;מ KCl, 20 מ&quot;מ MgCl 2, 2.74 M NaCl ו -8 מ&quot;מ לאא 2 PO 4 בDDW. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. צעד זה נועד להכנת 20x חיץ Tyrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 20 מ&quot;מ Hepes pH 7, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, גלוקוז 5.6 מ&quot;מ ו1 עד 20 דילול של Tyrode 20x בDDW ומערבבים היטב. צעד זה נועד להכנת מאגר 1x Tyrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot מאגר 1x Tyrode ולאחסן ב -20 ° C. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מהצלחת גם 24 ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode. הכן תאי unstimulated ידי הוספת חיץ Tyrode 200 μl לשלוט בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 μl / טוב של 20X מרוכז הפעלה מגיב [(למשל 1,000 ng / DNP-BSA מיליליטר או DNP-HSA (Ag), 200 ionophore 2 + מיקרומטר Ca (למשל A23187), ושילוב של 20 מיקרומטר Ca 2 + ionophore ו1,000 ננומטר tetradecanoylphorbol-13-אצטט 12-O- (TPA)]. אם ריאגנטים מאוחסנים בDMSO, לדלל את ריאגנטים ל20x ריכוז במאגר Tyrode המכיל 1% DMSO. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatants של כל טוב בזהירות לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור. (Supernatants מכיל פפטיד chimeric NPY-mRFP ששוחרר מהתאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl חיץ Tyrode המכיל 0.5% Triton X-100 זה טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. (שלב זה חשוב להכנת lysates תא המכיל את שנותר מNPY-mRFP שלא שוחרר מהתאים). לאסוף lysates התא ולהעביר לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הקרינה של supernatants התא וlysates תא באמצעות fluorescקורא צלחת ence, באמצעות 590-, 20 ננומטר רוחב פס עירור מסנן ו635-, מסנן פליטת רוחב פס 35 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז NPY-mRFP שוחרר: הערה: מדד הקרינה קורא יחידות הקרינה שרירותית (עפו). ערכים עפו תלויים במכונה ואת הרגישות שלו ואת יעילות transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את autofluorescence של תאי RBL nontransfected ריקים. מחלקים את עפו של כל supernatant לקרינה הכוללת (עפו של supernatants + עפו של lysate המקביל) ולהכפיל ב -100. </li></ol></li></ol> 6. זמן לשגות מיקרוסקופית של Exocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 7.5 × 10 4 תאים / תא transfected במערכת coverglass קאמרי ורוסיליקט 8 היטב. לאחר 18-24 שעות, להסיר את מדיום התרבות מהתאים ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 72 μl של חיץ Tyrode לכל תא. לדלל את ריאגנטים הפעלה במאגר Tyrode ל10x ריכוז. </li> &lt;li&gt; השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal מצויד בחדר מחומם (37 מעלות צלזיוס) ו- CO 2 בקר (4.8%) ואובייקטיבי 40X או 63X. הפעל את מערכות מיקרוסקופ: מנורת כספית, מחשב, ולייזרים. ודא שהחדר המחומם הוא בטמפרטורה הנכונה לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר בחדר המחומם ולוודא כי התא מותקן בצורה נכונה ויציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את אור פלואורסצנטי לפי fluorophore הרלוונטי ולדמיין תאי transfected. כבה את הקרינה פעם בתא של עניין הוא בתחום על מנת למזער הלבנה וcytotoxicity. חשוב שהתחום זה יכיל כ 2-3 תאי transfected. תאי transfected צריכים להתפשט גם, אבל לא נוגעים זה בזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את כוח הלייזר (תלוי במיקרוסקופ) כדי למזער את הרעש וoversaturation כמו גם רעילות, ולהגדיר את הרווח לקזז לשנות את יחס האות לרעש. סריקה מהירה באו<html> der כדי למזער את משך חשיפת לייזר (ממוצע 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את גודל חריר למקסימום, זה מאפשר להקטין את כוח הלייזר ולשמור תמונות ממוקדות לתקופה ארוכה של זמן. אם תרצה, להגדיר את הפרמטרים למחסנית Z לשחזר את התמונה בשלוש ממדי סריקה, להתאים את גודל חריר ליחידה אוורירית 1 (AU) שנותן את האות הטוב ביותר יחס רעש ולרכוש רצופה של פרוסות אופטיות confocal דו-ממדיות ב -axes z עם פרוסות אופטיות ≤0.7 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את זמן ההפסקה בין כל רכישה 15-30 שניות ומשך הרכישה כוללת של 15 דקות ולהתחיל לרכוש תמונות. לאחר 5 דקות של רכישה להשהות את סדרת הזמן. הוסף 8 μl של ההדק 10x ולהמשיך הרכישה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונות, לבצע deconvolution באמצעות תוכנת deconvolution ולשחזר את הערימות לשלוש תמונות ממדיות ולסרט באמצעות תוכנת Imaris. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא נתונים מתמונות סדרת זמן deconvoluted שהתקבלו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal לתוכנת Imaris. תוכנה זו קוראת יותר מ -40 קבצי מיקרוסקופיה. אם התוכנה לא יכולה לקרוא את הקבצים; להמיר את הקבצים לקבצים ויבוא tif. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף נקודות זמן לסיום עריכה לחץ על Set נתונים פתוח -&gt; הוסף נקודות זמן ולייבא את הנתונים החדשים שנקבעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור פני השטח של ערוץ mRFP שימוש באפשרות אשף פני השטח. בחר אלגוריתם ברירת המחדל. בחר הערוץ של NPY-mRFP. סמן את אפשרות ההחלקה כדי להפחית את הרעש. כדי למנוע אובדן של פרטים קטנים להפחית את רמת פירוט אזור 0.05 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סף העצמה. משטח אפור חדש יוצג. עבור אל &quot;הגדרות&quot; ולעבור את הסגנון מ&quot; נקודת מרכז &quot;עד&quot; Surface &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסיית נתון במאפיינים של אובייקט שנבחר, בחר בכרטיסייה מפורטת וsuc הערך הספציפיh כעוצמת הקרינה, נפח וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקור את הנתונים ולוודא שהערכים תואמים לתמונות. לדוגמא, שתיים או יותר גרגרים סמוכים עשויים להימדד כגרגיר אחד גדול. לכימות גודל הגרגר הממוצע לחלק את גודל הגרגרים הממוזגים למספר האמיתי של גרגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את ערכות נתונים הרצויות לקבצי Excel ולנתח את הנתונים. </li></ol> f

<ol><li>Abonia, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mast+cells+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+in+allergy+and+infection%3A+versatile+effector+and+regulatory+cells+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity.</a> Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).</li>
<li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+controversial+role+of+mast+cells+in+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The controversial role of mast cells in tumor growth.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells%2C+angiogenesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cells, angiogenesis and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).</li>
<li>Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+immunoregulation%2Fimmunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cells and immunoregulation/immunomodulation.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).</li>
<li>Vries, V. C., Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators+in+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators in tolerance.</a> Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).</li>
<li>Kirshenbaum, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+human+mast+cells+arise+from+a+progenitor+cell+population+that+is+CD34%28%2B%29%2C+c-kit%28%2B%29%2C+and+expresses+aminopeptidase+N+%28CD13%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13).</a> Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).</li>
<li>Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mast cells.</a> Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).</li>
<li>Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+biology%3A+introduction+and+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cell biology: introduction and overview.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).</li>
<li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+mast+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of mast cell activation.</a> J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).</li>
<li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+mast+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of mast cell activation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214(2006).</li>
<li>Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agents+that+release+histamine+from+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Agents that release histamine from mast cells.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).</li>
<li>Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-dependent+down-regulation+of+antigen-specific+immune+responses+by+mosquito+bites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites.</a> J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).</li>
<li>Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+evades+the+extracellular+antimicrobial+activity+of+mast+cells+by+promoting+its+own+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake.</a> J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).</li>
<li>Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Toll-like+receptor+4+and+mast+cell-dependent+innate+immunity+responses%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses.</a> IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).</li>
<li>Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunoglobulin+E-Toll-like+receptor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunoglobulin E-Toll-like receptor network.</a> Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+adenosine+receptors+function%3A+a+focus+on+the+a3+adenosine+receptor+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation.</a> Front Immunol. 3, 134(2012).</li>
<li>Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+mast+cell+mediators+and+the+pathogenesis+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation.</a> Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).</li>
<li>Caughey, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+proteases+as+protective+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).</li>
<li>Lundequist, A., Pejler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+preformed+mast+cell+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological implications of preformed mast cell mediators.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).</li>
<li>Metz, M., Maurer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells--key+effector+cells+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells--key effector cells in immune responses.</a> Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).</li>
<li>Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+a+source+of+multifunctional+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Mast cells as a source of multifunctional cytokines.</a> Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).</li>
<li>Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+regulation+of+mast+cell+exocytosis+by+networks+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases.</a> J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).</li>
<li>Stenmark, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rab5+GTPase+activity+stimulates+membrane+fusion+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis.</a> EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).</li>
<li>Azouz, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+is+a+novel+regulator+of+mast+cell+secretory+granules%3A+impact+on+size%2C+cargo%2C+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis.</a> J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים כספיים.

אנו מתארים אסטרטגיה חדשנית המשלבת כימות של exocytosis המנחים וארבעה (x, y, z, t) quantifications ממד על ידי הדמיה תלת-ממדית-פקע זמן של SGS בתאים חיים באמצעות גן מדווח לexocytosis. טכניקה זו מאפשרת הקרנה של משפחות של חלבונים להשפעתם על תפקוד MC כגון SGS הניטור מתחילות כבר ביציאתם מGolgi דרך התבגרותם, רכישה של מיומנות exocytosis וdegranulation. השילוב של מדידות של exocytosis יחד עם אפיוני morphometric והקינטית של SGS מספק תובנות המנגנונים שבאמצעותם החלבונים נבדקו לתווך פונקציות MC. ...

תאי פיטום (MC) הם תאים חיסוניים שידועות כי הם הטובים ביותר על מעורבותם בתגובות אלרגיות ודלקתיות כגון דלקת פרקים, אסטמה, דלקת ושט אאוזינופילית, דלקת עור כרונית והלם אנפילקטי 1,2 כמו גם פתולוגיות אחרות, כוללים מחלת לב כלילית 3.5 ו סרטן 3,4. בנוסף, מנחים ממלאים תפקידים חשובים בחסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות, גם בהגנת מארחת נגד חיידקים וטפילים ועל ידי דיכוי של מערכת חיסונית, למשל גרימת סובלנות שתל 5,6. מנחי מקורן מח העצם, מתפתח מתאי CD34 pluripotent + / CD117 + 7. אבות MC מח עצם מחויב משתחררים לזרם הדם ונודדים לרקמות היקפי לוקליזציה בעיקר בתוך רקמות חיבור ומשטחי אפיתל 8. הבשלה והתמיינות מסוף מושגות סופו של דבר תחת השפעת of ציטוקינים בתוך 8,9 הסביבה שמסביב. יכולים להיות מופעלים על ידי מנחים אלרגן (אנטיגן, Ag), מפגש שהסתיים בדור של E אימונוגלובולינים (IgE) הקלד נוגדנים. כריכה של IgE כזה לקולטנים FcεRI של MC, ואחריו cross-linking של תא קשור IgE על חשיפה מחדש לאותו Ag, תוצאות בצבירת FcεRI וייזום מפל איתות שמגיע לשיאו בdegranulation תא [שנסקרו ב10,11] . מנחים גם הופעלו, באופן בלתי תלוי IgE, על ידי נוירו 5,12, רעלי 13, חיידקים ואנטיגנים נגיפיים 14,15, מספר פפטידים בעלי מטען חשמלי חיוביים המכונים ביחד secretagogues הבסיסי, תאים וציטוקינים 5,13,12,16 חיסוניים , 17. מנחים גם מופעלים על ידי רב של המתווכים שלהם שוחררו, אשר עוד להגביר את התגובה הדלקתית. מנחים הם ארוזים עם גרגירי הפרשה (SGS) המכילים חיסונימתווכי רגולציה, כוללים אמינים vasoactive, כגון היסטמין וסרוטונין (במכרסמים), proteoglycans, פרוטאזות, כגון chymase וtryptase, גורם גדילה של אנדותל כלי דם וכמה ציטוקינים וכמוקינים 8,9. מתווכים אלה הם &quot;מוכנים ללכת&quot; ופעם אחת MCs מופעל על ידי גירוי מתאים, מתווכים אלה משתחררים מהתאים על ידי exocytosis המוסדר (degranulation) בעניין של שניות עד דקות 18,19. אירוע ראשוני זה ואחריו סינתזת דה נובו ושחרורו של מגוון רחב של חומרים ביולוגיים חזקים, כוללים מטבוליטים הארכידונית חומצה, ציטוקינים מרובים וכמוקינים 20,21,22. שחרור של מוצרים מסונתזים חדש מתרחש באופן עצמאי של שחרור SG. באופן קולקטיבי, מתווכים אלה ליזום מוקדמים ושלב מאוחר דלקתי ואלרגי תגובות. לכן, הבנת המנגנונים המהווים הפעלת MC וdegranulation שניהם של שד תיאורטי וקליניortance. הקושי לתמרן גנטי MCs הראשוני והתרבותי שהקשה על הניסיונות להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס degranulation MC, שנשאר גרוע נפתר. מנחים כדי להתגבר על בעיה זו פיתחנו מבוסס assay כתב ידי, לוקמיה basophilic עכברוש קו תא פיטום ברירית transfecting-שיתוף (RBL) -2H3 (המכונים במסמך זה כלRBL) או מח עצם נגזרים (BMMCs) 30 עם גן של עניין ו Neuropeptide Y (NPY) התמזג RFP monomeric (mRFP), ככתב SG. NPY הוצג בעבר לשחזר את התנהגותם של סמני SG אנדוגני במערכות אחרות. יתר על כן, מכיוון שקרינת mRFP הוא pH רגיש, ביטוי של NPY-mRFP מאפשר הדמיה של SGS חומציים כמו גם הערכה כמותית של exocytosis באמצעות 96-גם צלחות וקורא צלחת הקרינה. הראינו כי NPY-mRFP מועבר לSGS חומצי של תאי RBL וBMMCs והוא שוחרר מהתאיםבאופן מוסדר לצד מטען SG אנדוגני (כלומר, β-hexosaminidase וסרוטונין) 30, 32. פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה המבוססת על הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת גני הקרנה של עניין לפנוטיפי שלהם והשפעה תפקודית על מאפייני SG וdegranulation בתאי RBL 32. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר מעקב בזמן אמת של MC SGS וכימות של האזור שלהם או גודל נפח, מספרם, קינטיקה של הרכבה, תנועתם לאורך שלד תא התא וההיתוך האולטימטיבי שלהם עם קרום הפלזמה בתנאים שונים. לדוגמא, רגישות התאים עם DNP-הספציפי IgE ומפעיל את התאים עם Ag רב-ערכי (אלבומין בסרום מצומדות DNP) תחת הפרעות שונות (כלומר, מציאה של גנים של עניין, על ביטוי של גני WT או מוטציה, או מניפולציות תרופתיות) ו השוואה לשלוט תאים.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>GE בריאות מדעי החיים</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות</td><td></td><td></td>חיים</tr><tr><td>קרום אצטט תאית, גודל נקבוביות 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>מנות תרבית שטופלו בתרבית רקמות קורנינג</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>R001100</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>צינורות מלח דיפוטסיום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סידן אצטט הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום אצטט טטרה-הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חומצה L-גלוטמית מלח אשלגן מונוהידראט (אשלגן גלוטמט)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4 מ"מ אלקטרופורציה קובטות</td><td>פרויקטים של תאים</td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>GENE PULSER עם בקר דופק & CAPACITANCE</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambered Coverglass</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות, תחתית שטוחה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 צלחות באר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 או CLS390</td><td></td></tr><tr><td>96 באר קורא פלואורסצנטי צלחת- אינסופי 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן ionophore A23187</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7522</td><td>הימנע מחשיפה ישירה לאור</td></tr><tr><td>12-O-tetradecanoyl-13-אצטט (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-DNP חד-שבטי IgE</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>הימנע מחשיפה ישירה לאור</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלורסנט קונפוקלי:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 הפוך</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת אימאריס</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסופט אקסל או פריזמה או תוכנות</td><td></td><td></td><td></td>אנליזות אחרות</tr><tr><td>מגיב אחר:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי&nbsp;</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>BDH מעבדות</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>מונוסודיום פוספט&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td></td><td>סטריליים</td></tr></tbody></table>

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לexocytosis

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

תאי פיטום (MC) הם תאי הפרשה של המערכת החיסונית שלהשיג פונקציות הפיזיולוגיות ופתולוגיים שלהם על ידי שחרור מתווכים אלרגיים, דלקת וimmunoregulatory מראש יצר ומסונתזים חדש. המתווכים &#39;MCs משפיעים על רקמות ואיברים מרובים שהגיעו לשיא בתגובות אלרגיות וחיסוניות. הסינתזה, האחסון והשחרור של מתווכי MC קבוע בתקנות. המתווכים מראש יצר עמוסים בגרגירי cytoplasmic הפרשה (SG) שלהתמזג עם קרום הפלזמה ולשחרר את התוכן שלהם על ידי exocytosis המוסדר. אנו מציגים פרוטוקול, המבוסס על שיתוף הביטוי של גן של עניין עם גן כתב כי הוא ממוקד לSGS והוא שוחרר באופן מוסדר לצד מתווכי SG אנדוגני. הפרוטוקול מאפשר רזולוציה גבוהה ארבעה confocal ממדי ניתוחים של SGS MC וניטור ציר זמנם מbiogenesis לexocytosis מופעל. לפיכך, שימוש בפרוטוקול זה לסינון גנים של היתרest להשפעה פנוטיפי והפונקציונלית שלהם מאפשר פענוח המנגנונים המולקולריים השולטים בbiogenesis וexocytosis של SGS MC וזיהוי הרגולטורים מעורבים. וכך, תובנות נוספות המנגנונים התאיים שמהווים פונקצית MCs בבריאות ובמחלה צריכה להינתן.

בגלל יעילות transfection הנמוכה של MCS, מניפולציות גנטיות צפויים לעזוב השפעה על קריאות של הפרשה ממוצעת שנמדדו על ידי מתווכי SGS אנדוגני. אף על פי כן, על ידי הקמת שיתוף ביטוי מלא של גן הכתב NPY-mRFP ופלסמיד שיתוף transfected באותו התאים, ניטור של תוצאות NPY-mRFP בניטור באופן בלעדי אוכלוסיית התאים המבטאת את הגן של עניין. לכן, היתרון של assay זה בהשוואה לשיטות קונבנציונליות הוא היכולת לנטר באופן סלקטיבי תאי מניפולציות גנטיים (איור 1). <p class="jove_content" styl...

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור את המנגנונים המווסתים את התפתחות הגרנולות ההפרשתיות והציטוזיס של תאי מאסט. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה משותפת של תאי מאסט עם גן דגל לאקסוציטוזה, וכן עם גן העניין. השלב השני הוא להעריך את השפעת הגן הנבדק על האקסוציטוזה באמצעות גריית התאים וניטור האות הפלואורסצנטי של גן הדגל במהלך האקסוציטוזה.בשלב הבא, השפעת הגן הנבדק על יצירתם ופיתוחם של גרנולות הפרשה בתאי מאסט מוערכת באמצעות דימות קונפוקלי של הגן הדגגל (reporter gene) הממוקם בגרנולות ההפרשה. השלב הסופי הוא ביצוע אנליזה מורפומטרית של גרנולות ההפרשה. בסופו של דבר, סימון פלואורסצנטי של גרנולות הפרשה בתאי מאסט באמצעות גן דגגל משמש להצגת שינויים בתאי המאסט, בפיתוח גרנולות ההפרשה ובאקסוציטוזה שלהן.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדידת שחרורם של מתווכים אנדוגניים, beta haase או היסטמין, הוא שהיא מבוססת על ביטוי משותף (co-expression) של הגן הנחקר כסוג של מוטנט או S-H-R-N-A יחד עם רפורטר לאקסוציטוזה. הביטוי המשותף מאפשר ניטור של הפרשה אך ורק מהתאים שעברו מניפולציה גנטית, ובכך הוא פותר את בעיית יחס הרעש הגבוה לאות שנוצרת בעת מדידת שחרורם של מתווכים אנדוגניים בשל יכולת הטרנספקציה הנמוכה של תאי מאסט, דבר המקשה על פרשנות התוצאות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי מאסט, כגון זיהוי המנגנונים המולקולריים השולטים בתהליך יצירת הגרנולות ההפרשתיות, כולל ברירה של מטענים, אריזת הגרנולות והכשירות שלהן לאקסוציטוזה.שיטה זו מסייעת גם בזיהוי המנגנונים המולקולריים השולטים בתהליך של אקסוציטוזה מבוקרת של תאים בהמוניו, וזאת באמצעות הערכת המעורבות של קינאזים, פוספטאזים ומשפחות חלבונים אחרות בתהליך זה. כדי להתחיל, הכין תאי לוקמיה בסיפילתיים של חולדה ומצע גידול כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב לביצוע טרנספקציה. ראשית, הסר את מצע התרבית מהצלחת באמצעות פיפט פסטור סטרילית המחוברת לשואב ואקום.שטפו את שכבת התאים החד-שכבתית (monolayer) בעזרת טריפסין שחומם מראש, בנפח DTA המכסה את כל השכבה. הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לא יותר מ-10 דקות. לאחר מכן, בדקו באמצעות מיקרוסקופ אופטי אם התאים התנתקו.לאחר ההפרדה, יש להוסיף מצע לצלחת התרבית כדי להשעות את התאים בנפח של לפחות פי שניים מנפח תמיסת ה-trypsin. לאחר ספירת התאים באמצעות hemo cytometer, יש להשקיע 15 מיליון תאים על ידי סבוב בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב-200 G וב-25 degrees Celsius. יש להסיר את ה-SNAT ולהוסיף 280 microliters של מצע טרנספקציה.לאחר מכן, העבירו את תערובת התגובה לתוך וייט (vete) של ארבעה מילימטרים. הוסיפו 20 µg של פלסמיד המכיל neuropeptide Y-M-R-F-P, הידוע גם בשמו המקוצר N-P-Y-M-R-F-P, וכן 30 µg של פלסמיד בקרה ריק או של פלסמיד נבדק. הנפח הסופי של תערובת התגובה צריך להיות 300 µL.לאחר הנחה על קרח למשך 10 דקות, נגב את ה-vet משאריות מים. לאחר מכן, בצע אלקטרופורציה במתח של 300 וולט למשך תשעה מילישניות. לצורך מדידות של אקסוציטוזה, נפח מחדש את התאים באופן מיידי בתוך צלחות תרבית רקמה בעלות 24 בארות המכילות 300 microliters של מצע גידול.הוסף שמונה µL מתערובת התגובה לכל באער. לאחר מכן, הוסף תאים שלא עברו טרנספקציה לבאערים נוספים לצורך הביקורת. הכן מספר באערים מספיק כדי שיהיו באערים כפולים לכל טיפול. עבור כל טרנספקציה המיועדת למיקרוסקופיה בשיטת time-lapse, זרע את התאים מיד במערכת של תא בעל שמונה באערים עם זכוכית כיסוי מסוג BO המכילה 80 µL מתווך.הוסף 1.5 µL מתערובת התגובה לכל תא כדי להרגיש את התאים להפעלה המתווכת על ידי FC epsilon R one. הוסף למדיית הגידול 1 µg/mL של נוגדן IgE מונוקלונלי ספציפי ל-DNP מעכבר. דגרה את התאים עם ה-IgE למשך שעתיים לפחות.לאחר 18 עד 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר שהתאים מבטאים את הפלסמידים. ל-MRFP אורך גל עירור של 584 ננומטר ואורך גל פליטה של 607 ננומטר. N-P-Y-M-R-F-P אמור להופיע במבנים וסיקולריים התואמים לגרנולות ההפרשה.כדי למדוד אקסוציטוזה של N-P-Y-M-R-F-P, הסר את מצע התרבית מהפלטה בעלת 24 הבארים ושטוף שלוש פעמים עם בופר tyro. הכן תאים לא מעוררים על ידי הוספת 200 microliters של בופר tyro לבארי הביקורת.לאחר מכן, הוסף את ריאגנטים ההפעלה, tyro buffer מדולל, לפני דגירה ב-37 °C למשך 30 דקות. העבר בזהירות את ה-S supernatants מכל באער ללוחית 96 באערים. הנח את הלוחית על קרח והגנה עליה מפני אור.העלים (supernatants) מהשלב S מכילים את הפפטיד הכימרי N-P-Y-M-R-F-P ששוחרר מהתאים. לאחר מכן, הוסף 200 µL של tyro buffer המכיל 0.5% Triton X 100 לכל באר והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. שלב זה חשוב להכנת ליזאטים של תאים המכילים את שארית ה-N-P-Y-M-R-F-P שלא שוחררה מהתאים.אסוף את ליזאטי התאים והעבר אותם לצלחת 96 בארות לפני ההנחה על קרח. בהיעדר אור, מדוד את הפלואורסצנציה של סופרנאטנטי התאים ושל ליזאטי התאים באמצעות קורא צלחות פלואורסצנטי עם מסנן עירור של 590 nanometer ברוחב פס של 20 nanometer ומסנן פליטה של 635 nanometer ברוחב פס של 35 nanometer. זרע 1.5 µL של תאים שעברו טרנספקציה במערכת זכוכית כיסוי BO סיליקט בעלת שמונה תאים.דגרו את התאים במשך 18 עד 24 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. הסירו את מצע התרבית מהתאים ושטפו שלוש פעמים עם tyroid buffer. לאחר מכן, הוסיפו 72 µL של tyroid buffer לכל תא.השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקאלי המצויד בתא חימום, בבקר פחמן דו-חמצני ובעדשה אובייקטיבית של 40 x או 63 x. הפעל את מערכות המיקרוסקופ, כולל נורת הכספית, המחשב והלייזרים. ודא שתא החימום נמצא בטמפרטורה הנכונה.לפני תחילת הניסוי, מקמו את מערכת כיסוי הזכוכית מסוג סיליקט בעלת שמונה תאי בור בתוך התא המחומם, וודאו שהתא הותקן כראוי ושהוא יציב. הדליקו את תאורת הפלואורסצנציה בהתאם להנחיות הרלוונטיות, ואתר את התאים שעברו טרנספקציה; כבו את הפלואורסצנציה ברגע שתא רלוונטי נמצא בשדה הראייה. כדי למזער הלבנה (bleaching) וציטוטוקסיות, שדה זה צריך להכיל כשני עד שלושה תאים שעברו טרנספקציה, כך שהם יהיו מפוזרים היטב אך לא ייגעו זה בזה.במקרה זה, התאים עוברים טרנספקציה משותפת עם הגן המדווח, N-P-Y-M-R-F-P, ועם מוטציה של RAB5 פעילה באופן קונסטיטוטי המסומנת ב-GFP. יש להתאים את הספק הלייזר כדי למזער רעשים, רוויית יתר וכן רעילות, ולהגדיר את ההגבר (gain) וההיסט (offset) כדי לשנות את יחס האות לרעש. יש לסרוק במהירות כדי למזער את משך החשיפה ללייזר.בשלב הבא, הגדירו את הפרמטרים ב-Zack לשחזור התמונה בתלת-ממד. כוונו את גודל חור הסיכה (pinhole) ליחידת שטח אחת כדי להשיג את יחס אות לרעש הטוב ביותר, ובצעו סריקות רצופות של פרוסות אופטיות קונפוקליות דו-ממדיות בציר Z, כאשר עובי הפרוסות האופטיות יהיה ≤ 0.7 µm. כעת הגדירו את מרווח הזמן בין רכישה לרכישה ל-30 שניות ואת משך הרכישה הכולל ל-15 דקות, והתחילו ברכישת התמונות לאחר חמש דקות של רכישה.השהו את סדרת הזמנים, הוסיפו שמונה µL של ה-10 x trigger והמשיכו ברכישת הנתונים מיד. לבסוף, שמרו את התמונות. בצעו דקונבולוציה באמצעות תוכנה לדקונבולוציה ושחזרו את הערימות לתמונות תלת-ממדיות ולסרטון לצורך ביצוע ניתוח תמונות.ייבאו את הנתונים מהתמונות של סדרות הזמן שעברו דה-קונבולוציה (deconvolution), שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית, לתוכנה לניתוח תמונות מדעיות כגון MRS. תוכנה זו קוראת יותר מ-40 סוגי קבצי מיקרוסקופיה. כדי להוסיף נקודות זמן לסוף סט נתונים פתוח, בחרו ב-edit add time points וייבאו את סט הנתונים החדש.כוון את הניגודיות וגוון הצבע כדי להשיג תצוגת תמונה אופטימלית. הקבצים שהורדו יוצרים את המשטח של ערוץ ה-MRFP. השתמש באפשרות של אשף המשטחים (surface wizard).בחרו באלגוריתם ברירת המחדל ובערוץ N-P-Y-M-R-F-P וסמנו את אפשרות ההחלקה להפחתת רעשים. כדי למנוע אובדן של פרטים קטנים, הפחיתו את רמת פירוט השטח לערך שבין 0.05 ל-0.1 microns. לאחר מכן, הגדירו את סף העוצמה.משטח אפור חדש מוצג. לאחר מכן, עבור להגדרות ושנה את הסגנון מנקודת מרכז (center point) למשטח (surface). עבור ללשונית הסטטיסטיקה במאפייני האובייקט שנבחר.לאחר מכן, בחרו בלשונית הפירוט (detailed) ובערך הספציפי, כגון פלואורסצנציה, עוצמה או נפח. סקרו את הנתונים ואשרו כי הערכים תואמים לתמונות. לדוגמה, שני גרנולות סמוכות או יותר עשויות להימדד כגרנולה אחת גדולה יותר בעת כימות הגודל הממוצע של הגרנולות.חלקו את גודל גרנולות המרכ' (merch granules) במספר הגרנולות בפועל. כשלב סופי, ייצאו את מערכי הנתונים הרצויים לקובצי excel ונתחו את הנתונים. מוצגות כאן תמונות time-lapse מייצגות של גרנולות הפרשה ענקיות בתאי מאסט, שנוצרו על ידי ביטוי של RAB5 פעיל באופן קונסטיטוטיבי, וכן את קינטיקת האקסוציטוזה והרזולוציה של גרנולת הפרשה בודדת.לאחר הגירוי. במהלך אקסוציטוזה של תאי מאסט, הגרנולות הפרשתיות נעות לעבר ממבקרת התא ומתמזגות איתה. הגרנולות מצופות ב-RAB five פעיל באופן קבוע, המוצג בירוק.מטען ההפרשה, שהוא N-P-Y-M-R-F-P בניסוי זה ומסומן בצבע מגנטה, משוחרר לאחר מכן מהתאים אל המרחב החוך-תאי. הגרנולות שחוברו על ידי המוטנט הפעיל באופן קבוע של RAB five, המוצגות בירוק, משחררות את המטען שלהן N-P-Y-M-R-F-P, שבניסוי זה מסומן בצבע מגנטה, מהתאים אל המרחב החוך-תאי.שחרור N-P-Y-M-R-F-P במהלך אקסוציטוזה גורם לעלייה דרמטית בעוצמת הפלואורסצנציה של N-P-Y-M-R-F-P ולהתכווצות הגרנולות ההפרשתיות המכילות N-P-Y-M-R-F-P, ולאחר מכן להיעלמותן. מוצגות עוצמות הפלואורסצנציה של הגרנולות ההפרשתיות לאחר גירוי התאים באמצעות אינופור של סידן, כאשר הגרנולות ההפרשתיות עוברות אקסוציטוזה בנקודות זמן שונות. בעוד שגרנולה הפרשתית אחת לא התמזגה עם ממב createNative פלזמה ועוצמת הפלואורסצנציה שלה נותרה קבועה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הניטור של גרנולות הפרשה בתאי mast במהלך התפתחותן והאקסוציטוזה שלהן, באמצעות רפורטר גנטי פלואורסצנטי המועבר לגרנולות ההפרשה ומשוחרר על ידי תאים שעברוהסטימולציה. יחד עם המתווכים האנדוגניים, ניתן לזהות את המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות גרנולות ההפרשה של תאי mast והאקסוציטוזה שלהן באמצעות פרוצדורה זו, על ידי טרנספקציה משותפת ובחינת התאים עם גן רפורטר וגן בדיקה. ניתן להעריך את תפקידו של גן הבדיקה על התפתחות גרנולות ההפרשה בתאי mast על ידי ביצוע אנליזה מורפומטרית של גרנולות ההפרשה בתאים שעברו טרנספקציה משותפת עם הגן הנחקר, בהשוואה לתאי ביקורת.בנוסף, ניתן לזהות את תפקידו של הגן שנבדק באקסוציטוזה מבוקרת על ידי ניטור שחרורו של גן הדגגל.

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית כדי לקבוע את פעילות הגרגיר של תאי פיטום. האנזים המשוחרר על ידי תאי הפיטום מבצע הידרוליזה של המצע ומייצר תוצר צבעוני. פעילות הפירוק של תאי הפיטום נמדדה כאחוז השחרור של אנזימים מחוץ לתא מנורמל עם תכולת האנזימים הכוללת בתא.

בדיקת פירוק תאי פיטום כדי לחקור את ההשפעה של כימיקל מטרה

סרטון זה מדגים שיטת שטיפת הצפק לבידוד תאי פיטום בוגרים מסוג רקמת חיבור מחלל הצפק של עכברים בוגרים. עם בידוד תערובת של תאי חיסון ראשוניים מחלל הצפק, מתבצעת התרבות סלקטיבית של תאי פיטום בתנאי תרבית מתאימים.

טכניקה לבידוד תאי פיטום ראשוניים מחלל הצפק המורין

סרטון זה מדגים אקסוציטוזה של תאי פיטום הנגרמת על ידי מגיב מפעיל הכולל יונופור סידן, היוזם שחרור של גרגירים מפרישים המכילים את חלבון הכתב הפלואורסצנטי NPY-mRFP. לאחר מכן, אנו מעריכים כמותית את האקסוציטוזה על ידי מדידת NPY-mRFP ששוחרר באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים.

מדידת אקסוציטוזה של תאי פיטום באמצעות שחרור חלבון פלואורסצנטי אדום מונומרי Y

סרטון זה מדגים טכניקה לדמיין אקסוציטוזה בתאי פיטום. התאים מודגרים עם FITC-dextran - כתב פלואורסצנטי - אשר נקלט על ידי תאים בתוך גרגירים מפרישים (SGs), שם ה- pH החומצי מרווה את הפלואורסצנטיות שלו. עם גירוי של אקסוציטוזה גרגירית, ה- pH הגבוה יותר של המדיום משרה פלואורסצנטיות כתב בתוך SGs מאוחים, אשר מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

טכניקת מבחנה לדמיין אקסוציטוזה של גרגרי הפרשה בתאי פיטום

degranulation תא פיטום, השחרור של מתווכים אלרגיים, הוא חשוב באלרגיה, אסתמה, והגנה טפילה. כאן אנו מדגימים טכניקות 1 להערכת השפעות של תרופות וtoxicants על degranulation, מתודולוגיה מנוצל לאחרונה להפגין השפעה המעכבת החזקה של סוכן אנטיבקטריאלי triclosan 2.

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד ולטפח מאתר תאי פיטום הצפק. אנו גם מתארים שני פרוטוקולים עבור שלהם אפיון פונקציונלי: הדמיה פלורסנט תאיים חינם Ca2 + ריכוז ואת וזמינותו degranulation בהתבסס על ערכי צבע מוחלטים כימות β-ההקסוזאמינידאז שוחרר.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

כאן אנחנו פירוט שיטת הדמיה תא בשידור חי של אקסוציטוזה מוסדר. שיטה זו משתמשת FITC-לתוספי, אשר צוברת ב הקשורות ליזוזום organelles, בתור כתב. שיטה פשוטה זו מאפשרת גם הבחנה בין מצבים שונים של אקסוציטוזה מווסתת בתאים קשה לתמרן גנטית.

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

הדמיה חיה של אקסוציטוזיס ליזומלי על תאים מיקרו-פטרניים מאפשרת כימות מרחבית של תהליך זה. נורמליזציה מורפולוגית באמצעות מיקרו-פטרנים היא כלי יוצא מן הכלל לחשיפת כללים כלליים לגבי ההפצה המרחבית של תהליכים סלולריים.

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

תאי T מבטאים רצפטור אנטיגן chimeric CD19 ספציפי (CAR) הם חדורים כטיפול investigational של ממאירויות B-cell בניסויים בריפוי הגנטי הראשונים ב-האנושיים שלנו. אנו מתארים שינוי גנטי של תאי T...

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

חקור את מנגנוני הפרשת הגרגרים בתאי פיטום באמצעות ניתוח גנומי פונקציונלי. השיטה משתמשת בגן מדווח פלואורסצנטי ובדימות קונפוקלי כדי לנטר אקסוציטוזה בזמן אמת ולנתח מורפולוגיה של גרגרים.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

גלה סרטונים נוספים