קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את הטופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים. זה מושג על ידי ביטוי של תפליט, חלבון בין חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לבין זנבות האמינו או הקרבוקסיל של הממברנה. חלבון מעניין בתאים למטרות בקרה, ניתן לבטא חלבונים פלואורסצנטיים מסיסים כגון RFP.

לאחר מכן, קרום הפלזמה נתון לחדירה סלקטיבית. באמצעות חפירת חומר הניקוי, חלבונים פלואורסצנטיים מסיסים ייצאו מהתא, ואילו חלבונים פלואורסצנטיים הקשורים לממברנה יישמרו בתוך התא. השלב האחרון הוא מריחת פרוטאז על תאי החלל וקביעת שימור או אובדן של אות פלואורסצנטי.

בסופו של דבר, שינויים בעוצמת הקרינה שנצפו באמצעות הדמיית מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשים להצגת הטופולוגיה והכיוון של חלבוני ממברנה אינטגרליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיפוי אפיטופים, הוא שההליך אינו דורש הרבה ציוד מיוחד או ריאגנטים שונים שעשויים להיות קשים להשגה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של חלבון ממברנה, כגון אילו תחומים של חלבון ממברנה אינטגרלי עשויים להיות ממוקמים בתוך הציטוזול לעומת אילו תחומים עשויים להיות ממוקמים בתוך לומן של אברונים כגון הרטיקולום האנדופלזמי זהב G או אנדוזומים.

התחל הליך זה עם יצירה ואימות של חלבון פלואורסצנטי KY כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן העבירו את החלבון הפלואורסצנטי KY לתאי כליה עובריים אנושיים או לתאי HEK 2 93 באמצעות כל שיטת טרנספקציה סטנדרטית ביעילות גבוהה ורעילות נמוכה, כולל טכנולוגיות מבוססות שומנים, ויראלים או אלקטרופורציה ליצירת ביטוי חולף או יציב, לאחר מכן מצופים תאים על החלקות כיסוי מצופות פוליליזין. שמור על התאים במשך חמש עד 48 שעות במצע תרבית רקמה מתאים ב-37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית רקמה המסוגלת לפחמן דו חמצני.

עקוב אחר התאים לביטוי חלבון ההיתוך GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי, והאות הפלואורסצנטי הפנימי של אות פלואורסצנטי GFP מגיע בדרך כלל למקסימום תוך 24 עד 72 שעות. בעקבות טרנספקציה. השתמש בתאים כאשר האות הפלואורסצנטי מגיע לרמה מקסימלית ניתן לנטר את ביטוי החלבון גם על ידי ניתוח כתמים חיסוניים באמצעות נוגדנים המכוונים כנגד החלבון המעניין או כנגד חלק ה-GFP.

כדי להתחיל להקים את מערכת הזלוף המוזנת בכוח הכבידה לטיפול בתאים. הכן מזרקים של 50 מיליליטר לתמיסות עם צינורות פוליאתילן המחוברים למאגרים עצמאיים ולסעפת עם יציאה אחת באמבטיה. מקם פיפטת יניקה כדי לשמור על נפח אמבטיה קבוע ולהשיג החלפת תמיסה על ידי מעבר ידני בין מאגרי זלוף לחדירת קרום פלזמה.

ראשית, הסר את מדיום תרבית התאים מהתאים. שוטפים את התאים שלוש פעמים למשך דקה כל אחד. במאגר KHM, הנח את החלקות הכיסוי על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואסוף את התמונה הראשונה, המייצגת את התמונה הבלתי חדירה לבקרה כדי לחלחל באופן סלקטיבי לקרום הפלזמה.

הוסף ספרה toin במאגר KHM לתאים, החדיר את התאים עם מאגר פלוס ספרה toin בקצב של חמישה מיליליטר לדקה למשך 10 עד 60 שניות. אישור כי קרום הפלזמה חלחל כראוי מתבצע בקלות על ידי ביטוי של מולקולת GFP או RFP מסיסה, אשר תתפזר בקלות החוצה מהתא בעקבות הממברנה. לאחר מכן, חדירה מאשרת כי כימר חלבון ה-GFP המעניין הוא ממברנה משולבת על ידי אישור שימור תאים של האות הפלואורסצנטי לאחר דיגון וחדירה של קרום הפלזמה.

לאחר מכן, בטא חלבון פלואורסצנטי ספציפי לאיברים כגון חלבון מיטוכונדריאלי כפי שמוזכר בפרוטוקול הטקסט. קבע את תנאי הביטוי האופטימליים כמו קודם. ודא שהחפירה והריכוז מתאימים לסוג התא המופעל על ידי הבטחה שהמורפולוגיה של תעלות האיברים התוך-תאיות נשארת קבועה לאורך חשיפה ממושכת.

לחפור בעצם. לאחר שטיפת התאים במאגר KHM, הוסף פרוטאז ישירות לתאים. עיין בתאים בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה, תוך שימוש במערכת זלוף המוזנת בכוח הכבידה כדי לרחוץ את התכשיר ברציפות

לאחר מכן, קבע אם האות הפלואורסצנטי נמשך או מתכלה. אסוף תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תחת ערכות המסננים המתאימות באמצעות פונקציית לכידת תמונות הווידאו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הנשלט על ידי מחשב. כימות עוצמות האות הפלואורסצנטי כפונקציה של מצב הדגירה.

השג את עוצמת הפיקסלים הממוצעת באזור עניין המקיף תא בודד. אובדן של יותר מ-90% מעוצמת האות הראשונית במשך 30 עד 60 שניות עולה בקנה אחד עם פירוק פרוטאוליטי של חלבון GFP ky. היעלמות מוחלטת של אות פלואורסצנטי מסיס אמורה להתרחש תוך 10 עד 60 שניות מיישום הספרה.

אישור לכך שהחלבון המעניין קשור לאברונים תוך-תאיים מושג על ידי ציון שימור האות הפלואורסצנטי לאחר דיגון וחדירה. זנב הקרבוקסיל של קינאז LTK המעוגן בממברנה LTK 2 התמזג ל-GFP והתבטא באופן חולף ltk פלואורסצנטי. שני אותות GFP אבדו במהירות בעקבות הוספת פרוטאינאז K המציין את מיקום הקצה הקרבוקסיל של ltk שניים נמצא בתוך הציטוזול.

Cavi ו-GFP הוא חלבון ממברנת פלזמה עם חלק GFP המחובר לתחום הציטוזולי. כמו ב-LTK 2, האות מ-cavi ו-GFP אינו רגיש לספרות, אך רגיש לתוספת הבאה של פרוטאז DS מיטו אדום מקודד חלבון פלואורסצנטי אדום המותך לרצף המיקוד המיטוכונדריאלי מציטוכרום C אוקסידאז לאחר חדירת דיגון, כמו גם תוספת של פרוטאינאז K. הקרינה הקשורה למיטו אדום DS נשארת יציבה. זה עולה בקנה אחד עם הפלואור ארבע במיטוכונדריה שם הוא אינו חשוף לציטוזול.

כאשר החלק הפלואורסצנטי המחובר לחלבון ממברנה פונה לחלק החיצוני של התא, כמו בחלבון פריון מעוגן GPI המחובר לחלבון פלואורסצנטי צהוב. טיפול בפרוטאינאז אמור להרוות במהירות את האות הפלואורסצנטי ללא צורך מוקדם בחדירת חפירה כצפוי. לאחר טיפול בפרוטאינאז, האות הפלואורסצנטי החוץ-תאי נעלם במהירות עבור תאים המבטאים מבנה זה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה עד שעתיים אם היא נעשית כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה טובה יותר כיצד לקבוע את הטופולוגיה של חלבון הממברנה המעניין שלך.