Name: קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: למד לקבוע טופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים באמצעות שימוש בכימרות GFP וטיפול בפרוטאז. שיטה זו מאפשרת לחקור את מיקומי הדומיינים של החלבון בציטוזול ובלומן האברונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למתקן הליבה להדמיית סידן ב-CMS על עזרתם והדרכתם בצילום וניתוח תמונה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (NIH) HL102208 ל-N.A.B. גישה זו הייתה חלוצה במקור על ידי הולגר לורנץ וג'ניפר ליפינקוט-שוורץ ב-NIH.

<ol><li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li>
<li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum%3A+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+biosynthesis%3A+why+topology+is+hard+to+predict%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li>
<li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li>
<li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins%3A+the+dense+alignment+surface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li>
<li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins%3A+search+for+topogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li>
<li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+%28SCAM%28TM%29%29%3A+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li>
<li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. a Laboratory Manual</a>. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+you+know+the+sex+of+your+cells%3F+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li>
<li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transmembrane+Ser%2FThr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li>
<li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+%28LMTK2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li>
<li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell%3A+caveolae+as+stable%2C+cargo-triggered%2C+vesicular+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li>
<li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li>
<li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li>
<li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li>
<li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li>
<li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

ההתמצאות וטופולוגיה הנכונות של חלבונים בממברנה היא חיוני לתפקוד התקין שלהם. למרות החשיבות של הבנת טופולוגיה חלבון קרום, יש חלבונים רבים שעבורם נתונים כאלה חסרים לחלוטין. FPP מספק דרך קלה ויעילה לקביעת טופולוגיה חלבון קרום, ואחד שיכול להתבצע על ידי רוב המעבדות. גישת FPP מעניקה יתרונות משמעותיים על פני שיטות קודמות לקביעת טופולוגיה חלבון. לדוגמא, אין צורך להיות פנל של נוגדנים מרובים המכוונים תחומים שוב שונים של החלבון של עניין 31. במקרים רבים פנל כזה של נוגדנים אינו זמין;...

ממברנות הפלזמה, כמו גם את הקרומים תאיים הרבים, שמשו כחיץ המפריד בין שני תאים מימיים. במקרה של קרום הפלזמה, ההפרדה היא בין החוץ ופנים של התא; לאברונים תוך-תאיים הוא בין הציטופלסמה ולומן אברון. לדוגמא, קרום reticulum endoplasmic (ER) מפריד בין סביבת חמצון בתוך לומן של ER מcytosolic צמצום הסביבה 1. חלבוני קרום מסונתזים על ריבוזומים הקשורים ER, ולהשיג טופולוגיה הסופית שלהם בתוך הקרום ER 2. רכישת אוריינטצית קרום המתאימה וטופולוגיה לחלבונים היא חיונית לתפקוד הנורמלי שלהם. טופולוגיה הנכונה מאפשרת תחומים רלוונטיים של חלבונים בממברנה כדי אינטראקציה עם השותפים המחייבים שלהם, הוא מאפשר לאחר translational שינויים קריטיים להתרחש, ובמקרה של חלבוני קרום פלזמה, מאפשר לתא לקיים אינטראקציה עם ולהגיב to סביבתה. כדי להעריך את תפקודו של חלבון קרום באופן מלא, ברור שהכרחי לדעת איך חלבון שמכוון ביחס לקרום שבתוכה הוא שוכן, כלומר, טופולוגיה הממברנה שלו. בנוסף לרכישת ידע מדעי בסיסי, הבנת הטופולוגיה של חלבון קרום ואילו היבטים של משטח חלבון נחשפים לסביבות שונות סימנה השלכות קליניות מאז חלבוני קרום מהווים את רוב המטרות תרופתיות 3. עד לאחרונה, גישות לקביעת טופולוגיה חלבון קרום דורשת השקעה רבה בזמן ובכסף, או שנדרש ריאגנטים שקשה להשיג. שני גישות ניסיוניות ובסיליקון ולהיות מועסקים על מנת לקבוע את הטופולוגיה של חלבוני הקרום המתגוררים בתוך קרום הפלזמה. מאז התחזיות הראשונות של תחומים קרום פורש המבוססים על ההערכה של הידרופוביות indiviחומצות אמינו כפולים 3, אלגוריתמים חזוי רבים זמינות כעת באינטרנט, ופשוט דורשות ידע של רצף החומצות האמיניות של החלבון. עם זאת, הנחות הן לעתים קרובות מרכזיות לתוכניות כגון דוגמנות, הנחות שיכולים להוביל למשימות לא נכונות של טופולוגיה 4,5. יתר על כן, בעוד שתחזיות מבוססות מחשב אלה יכולים בהיסוס להקצות אזורים פורש קרום, הם לא תמיד לקבוע אם אמינו או termini carboxy של חלבונים הם בציטופלסמה, לומן אברון או חיצוני תא. אפילו עם עליית כוח חישוב, והשימוש באלגוריתמי למידת מכונה 6, נתונים כאלה הוא עדיין מודל, וחייב להיות מאומת באמצעות נתונים שנרכשו באופן ניסיוני. קביעה ניסיונית ישירה של טופולוגיה קרום כבר התחייבה באמצעות פנלים של נוגדנים חד-שבטיים עם epitopes הידועה מופצת ברחבי החלבון, שבו הערכה של immunoreactivity נעשתה לפני ואחרי permeabilization התא. זהגישה דורשת מערך של נוגדנים, אשר לא יכול להיות זמינה לחלבון של עניין. אסטרטגיה חלופית היא להנדס תגי epitope כגון myc או hemagglutinin (HA) למקומות שונים ברחבי החלבון, ואחרי שוב על ידי קביעת immunoreactivity לפני ואחרי permeabilization הקרום. בנוסף לתגים חיסוניים, תגים האנזימטית (כולל phosphatase אלקליין, β -galactosidase, או -lactamase β) ושינויים כימיים כגון סריקת ציסטאין שכל הועסקו כדי לקבוע טופולוגיה חלבון קרום 7,8. שיטה נוספת המועסקות למיפוי טופולוגי של חלבוני קרום פלזמה מסתמכת על גישה מעט שונה לתגי epitope. בשיטה זו את רצף התג הוא רצף קונסנסוס glycosylation N הצמוד NXS / T. מאז glycosylation מתרחשת רק כאשר רצף זה נוכח בלומן של מסלול biosynthetic, הנוכחות של התג בluminal לעומתתא cytosolic הוא ציין בקלות כמו שינוי מסה על ג&#39;לי SDS-PAGE. גישה כזו הוחל ערוץ יון multispanning 9 CFTR. בעוד שכל הגישות הללו כבר נוצלו, ברור שכל מה שהם דורשים השקעות רבות בביולוגיה מולקולרית כדי ליצור רצף ומבני הסעפת. כדי לקבוע מידע טופולוגי לגבי חלבונים הטרנסממברני ממוקמים בתוך אברונים תוך-תאיים הוכיח להיות מאתגרים יותר. היישום של טכנולוגיות מבוססות הקרינה עם זאת, הפך את הנחישות של טופולוגיה קרום הרבה יותר פשוט. הטכניקה של שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) מסתמכת על האינטראקציה בין שני שברים שאינם ניאון של חלבון פלואורסצנטי, שחזור מאפייני הניאון של החלבון ש-10. למרות שתחילה תאר לקביעת אינטראקציות בין חלבונים in vivo 10, גישה זו גם נוצלהכדי לקבוע טופולוגיה חלבון קרום בתאי צמח 11. עם זאת גישה זו היא גם זמן אינטנסיבי כפי שהוא דורש לא רק הדור של חלבוני היתוך עם החלבון של עניין, אלא גם מגוון של חלבוני היתוך ממוקדים ללום cytosol או אברון, ודורש ידע שבתאי קרומי החלבון של העניין מתגורר ב . גישה חלופית פשוטה יותר לקביעת טופולוגיה חלבון הקרום תוארה 12. Assay, הקרינה פרוטאז ההגנה (FPP) דורשת את הדור של חלבון היתוך בין GFP והגן של עניין. הגישה מבוססת על הנגישות היחסית של פרוטאזות שאינה ספציפית למחצית GFP; תלוי אם GFP מוגן מproteolysis על ידי המתגורר בלומן של אברונים תוך-תאיים או חשוף לproteolysis מעצם נוכחותו בcytosol. לכן, אם מחצית GFP על החלבון של עניין בפני ציטופלסמה, היא תהיה חשופה לפעילות פרוטאז ואותות הקרינה לאיבוד. לעומת זאת, אם מחצית GFP על החלבון של עניין בפני סביבה &#39;מוגנת&#39; מפרוטאז (כגון לום Golgi) ולאחר מכן את אות הקרינה תתמיד. כדי לאפשר פרוטאזות להיכנס לתא, אך לא להיכנס לתאי קרום תאיים digitonin תרופת הכולסטרול מחייב משמש. כולסטרול הוא סטרולים הדומיננטיים בבעלי חוליות, והוא מועשר באופן ספציפי בקרום הפלזמה ביחס לתאים תאיים. רעלן glycoside, digitonin, מופק אצבעונית הארגמנית צמח. יש digitonin זיקה לממברנות עשירות בכולסטרול, שבו היא מובילה לקרום בררני permeabiliztion 14,16 (איור 1). בנוסף מאפשר יציאה של רכיבי cytosolic קטנים, permeabilization digitonin גם מאפשר הכניסה של מולקולות חיצוניות, כגון K proteinase או טריפסין. פרוטוקול FPP מנצל את fact שקרום הפלזמה מכיל עד 80% מכולסטרול סלולארי 17, ואילו אברונים אחרים, כגון ER, Golgi, endosomes, מיטוכונדריה, שיש להם תוכן כולסטרול נמוך מאוד, נותרה על כנן 14. ההתאגדות סלקטיבית של כולסטרול לתוך קרום הפלזמה נצפתה בתאים רבים אוקריוטים, המתירה את השימוש בpermeabilization קרום הפלזמה digitonin תלוי במינים האיקריוטים מגוונים כגון S. cerevisiae ל14,18 אנושיים. Assay FPP מספק דרך פשוטה, מהירה וחזקה למדי של קביעה (א) אם חלבון הוא קרום מחויב / קשורים או diffusible בחופשיות בcytosol ו- (ב) שהתחום של חלבון קרום פונה ללום cytosol או אברון. צריך חלבון קרום אוריינטציות מרובות, האות תנבע מהצורה הדומיננטית וצורות קטין לא תזוהה. אמנם יש יכול להיות קצת חששו כי התוספת של מחצית GFP לחלבון על ריבית עשויה להשפיע על תפקודה ו/ או לוקליזציה subcellular, זה בעצם יותר תיאורטי מאשר בפועל. ואכן מחקרים רבים הראו באופן ברור כי תג ה- GFP לא לשנות את המאפיינים של החלבון 19,20.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>פוליליזין</td><td>סיגמא</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (fpp)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

הטופולוגיה והכיוון הנכונים של חלבוני ממברנה אינטגרליים חיוניים לתפקודם התקין, אך מידע כזה לא הוכח עבור חלבוני ממברנה רבים. מוצגת טכניקה פשוטה הנקראת הגנת פרוטאז פלואורסצנטי (FPP), המאפשרת קביעת טופולוגיית חלבון הממברנה בתאים חיים. לטכניקה זו יתרונות רבים על פני שיטות אחרות לקביעת טופולוגיית חלבון, בכך שהיא אינה דורשת זמינות של נוגדנים מרובים כנגד תחומים שונים של חלבון הממברנה, אינה דורשת כמויות גדולות של חלבון וניתנת לביצוע על תאים חיים. שיטת FPP משתמשת בפעולות המוגבלות מרחבית של פרוטאזות על פירוק חלבוני ממברנה מתויגים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כדי לקבוע את טופולוגיית הממברנה והכיוון שלהם. גישה פשוטה זו ישימה למגוון רחב של סוגי תאים, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את כיוון חלבון הממברנה באברונים תת-תאיים שונים כגון המיטוכונדריה, גולגי, רשתית אנדופלזמית ורכיבים של המערכת האנדוזומלית/מחזורית. חלבוני ממברנה, המתויגים על N-termini או C-termini עם היתוך GFP, באים לידי ביטוי בתא מעניין, הנתון לחדירות סלקטיבית באמצעות חומר הניקוי דיגיטונין. לדיגיטונין יכולת לחלחל את קרום הפלזמה, תוך השארת אברונים תוך תאיים שלמים. חלקי GFP החשופים לציטוזול יכולים להתפרק באופן סלקטיבי באמצעות מריחת פרוטאז, ואילו חלקיקי GFP הקיימים בלומן של אברונים מוגנים מפני הפרוטאז ונשארים שלמים. בדיקת FPP היא פשוטה, וניתן להשיג תוצאות במהירות.

פלזמה ממברנה permeabilization permeabilization קרום פלזמה יעיל נקבע על ידי השימוש בחלבונים מסיסים ניאון (למשל, GFP, DsRed) (שלב 4). חלבונים אלה, כאשר באו לידי ביטוי בתאים, חופשיים מפוזר בcytosol, והולכים לאיבוד כאשר קרום פלזמת permeabilized באמצעות digitonin (איור 2). היעלמות מוחלטת של אות ניאון צריכה להתרחש בתוך 10-60 שניות של יישום digitonin. אישור לכך שהחלבון של עניין קשור בא...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הכיוון והטופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים. פרוטוקול פשוט זה מסתמך על רגישות סלקטיבית לפרוטאז של כימרות בין החלבון המעניין ל-GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את הטופולוגיה של חלבוני קרום אינטגרליים. מטרה זו מושגת על ידי ביטוי של חלבון המטרה בתאים, כאשר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מקושר לקצוות האמינו או הקרבוקסיל של חלבון הקרום. למטרות בקרה, ניתן לבטא חלבונים פלואורסצנטיים מסיסים, כגון RFP.בשלב הבא, קרום התא יעבור חדירות סלקטיבית. באמצעות הדטרגנט dig, חלבונים פלואורסצנטיים מסיסים יצאו מהתא, בעוד שחלבונים פלואורסצנטיים קשורי-קרום יישמרו בתוך התא. השלב האחרון הוא יישום של פרוטאזה על התאים החדירים וקביעה אם האות הפלואורסצנטי נשמר או אבד.בסופו של דבר, שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה הנצפים באמצעות דימות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשים להדגמת הטופולוגיה והאוריינטציה של חלבונים ממברנתיים אינטגרליים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיפוי an epitope, הוא שההליך אינו דורש ציוד ייעודי רב או ריאגנטים שונים שעלולים להיות קשיים להשגה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של חלבונים ממברנתיים, כגון אילו דומיינים של חלבון ממברנתי אינטגרלי עשויים להיות ממוקמים בתוך הציטוזול לעומת אילו דומיינים עשויים להיות ממוקמים בתוך הלומן של אברונים כגון הרשת האנדופלזמית או אנדוזומים.התחילו הליך זה ביצירה ובתיקוף של חלבון הפלואורסצנציה KY כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, בצעו טרנספקציה של חלבון הפלואורסצנציה KY לתאי כליה עובריים אנושיים או לתאי HEK 2 93 באמצעות כל שיטת טרנספקציה סטנדרטית בעלת יעילות גבוהה ורעילות נמוכה, כולל טכנולוגיות מבוססות ליפידים, נגיפים או אלקטרופורציה, כדי ליצור ביטוי זמני או יציב; לאחר מכן, זרעו את התאים על לביבות זכוכית (cover slips) מצופות פוליליזין. תחזקו את התאים למשך 5 עד 48 שעות במצע תרבית רקמות מתאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור לתרבית רקמות המסוגל לספק פחמן דו-חמצני.עקבו אחר התאים כדי לבחון את הביטוי של חלבון היתוך ה-GFP באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיגנטית; אות הפלואורסצנציה העצמי של GFP מגיע בדרך כלל לשיאו בתוך 24 עד 72 שעות לאחר הטרנספקציה. השתמשו בתאים כאשר אות הפלואורסצנציה מגיע לרמתו המקסימלית. ניתן לעקוב אחר ביטוי החלבון גם באמצעות אנליזת אימונו-בלוט (immuno blot) באמצעות נוגדנים המופנים אל החלבון הנחקר או אל רכיב ה-GFP.כדי להתחיל, הגדירו את מערכת הפרפוזיה מבוססת כבידה לטיפול בתאים. הכינו מזרקים בנפח 50 milliliter עבור התמיסות, עם צינורות פוליאתילן המחוברים למכלי קיבול נפרדים ולסבון (manifold) עם מוצא יחיד לאמבטיה. מקמו פפיטרית שאיבה כדי לשמור על נפח אמבטיה קבוע ולהשיג החלפת תמיסות על ידי מעבר ידני בין מכלי הקיבול של הפרפוזיה לצורך חדירות של ממברון הפלסמה.ראשית, הסר את מצע תרבית התאים מהתאים. שטוף את התאים שלוש פעמים, למשך דקה אחת בכל פעם. בבופר KHM, הנח את הכיסויי זכוכית (cover slips) על במה של מיקרוסקופ פלואורסצנציה ודגום את התמונה הראשונה, המהווה את תמונת הבקרה הבלתי-חדירה, לצורך חדירה סלקטיבית של ממברנה הפלזמה.הוסיפו digitonin לבאפר KHM על התאים, ובצעו פרפוזיה לתאים עם הבאפר בתוספת digitonin בקצב של 5 ml/min למשך 10 עד 60 שניות. ניתן לאשר בקלות שהממברנה הפלסמטית חדירה מספיק באמצעות ביטוי של מולקולת GFP או RFP מסיס, אשר תdiffuse בקלות אל מחוץ לתא בעקבות חדירות הממברנה. לאחר מכן, אשר את השילוב של חלבון ה-GFP המבוקש בממברנה על ידי אישור שימור התסבון הפלואורסצנטי בתא לאחר הטיפול ב-digitonin וחדירות הממברנה הפלסמטית.בשלב הבא, בצעו ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ספציפי לאבניל, כגון חלבון מיטוכונדריאלי, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. קבעו את תנאי הביטוי האופטימליים כפי שנעשה קודם לכן. ודאו כי הדיג והריכוז מתאימים לסוג התאים שבהם נעשה שימוש, על ידי וידוא שהמורפולוגיה של אבנילי האבנים התאי נותרת קבועה לאורך חשיפה ממושכת.להמשך הפרוצדורה. לאחר שטיפת התאים בבפר KHM, יש להוסיף פרוטאז ישירות על התאים. יש לבצע פרפוזיה לתאים בקצב זרימה של 5 mL לדקה, באמצעות מערכת פרפוזיה מונחית כבידה כדי להשקות את הדגימה באופן רציף.בשלב הבא, קבעו האם האות הפלואורסצנטי נשמר או דועך. אספו תמונות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תחת מערכי המסננים המתאימים באמצעות פונקציית לכידת תמונות הווידאו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הנשלט על ידי מחשב. כמתו את עוצמות האות הפלואורסצנטי כפונקציה של תנאי הדגירה.חשבו את עוצמת הפיקסלים הממוצעת בתוך אזור עניין (region of interest) העוטף תא בודד. אובדן של יותר מ-90% מעוצמת האות הראשונית במהלך 30 עד 60 שניות עקבי עם דגרדציה פרוטאוליטית של חלבון ה-GFP. היעלמות מוחלטת של אות פלואורסצנטי מסיס צריכה להתרחש בתוך 10 עד 60 שניות לאחר יישום ה-digitonin.אישור לכך שהחלבון הנחקר קשור לאברונים תוך-תאיים מושג על ידי צפייה בשימור של האות הפלואורסצנטי לאחר דיגסטיביות והחדרה. הזנב הקרבוקסילי של kinase LTK two מעוגן לממברנה הותאם ל-GFP והובע באופן זמני כ-fluorescent ltk. Two. אות GFP אבד במהירות לאחר הוספת proteinase K, מה שמעיד על כך שהמיקום של הקצה הקרבוקסילי של ltk two נמצא בתוך הצイトזול.Cavi and GFP הוא חלבון ממברנה פלזמית עם חלק של GFP המחובר לדומיין הציטוזולי. בדומה ל-LTK two, האות מ-cavi and GFP אינו רגיש לדיגיטונין, אך רגיש להוספה עוקבת של פרוטאז. DS red mito מקודד לחלבון פלורסצנטי אדום המחובר לרצף התargeting המיטוכונדריאלי של cytochrome C oxidase לאחר חדירת דיגיטונין, וכן להוספה של proteinase K. הפלורסצנציה הקשורה ל-DS red mito נשארת יציבה. דבר זה עקבי עם העובדה ש-Fluor four נמצא במיטוכונדריה, שם הוא אינו חשוף לציטוזול.כאשר הרכיב הפלואורסצנטי המחובר לחלבון ממברנה פונה כלפי חוץ התא, כפי שקורה בחלבון פריון מעוגן GPI המחובר לחלבון פלואורסצנטי צהוב. טיפול ב-Proteinase אמור לכבות במהירות את האות הפלואורסצנטי ללא צורך מוקדם בחדירה של dig imp, כפי שצפוי. בעקבות הטיפול ב-Proteinase, האות הפלואורסצנטי החוץ-תאי נעלם במהירות בתאים המבטאים מבנה זה.לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בשעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה מעמיקה יותר לגבי האופן שבו ניתן לקבוע את הטופולוגיה של חלבון הממברנה המדובר.

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של זיהוי גודל פלואורסצנטי כדי לסנן יציבות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-התיך חלבון ממברנה ב- Escherichia coli לאחר מסיסות חומרי ניקוי. חלבונים המציגים שיא סימטרי בפרופיל אי הכללת הגודל עם מעט או ללא GFP חופשי מצביעים על חלבונים מטוהרים עם מינימום פירוק וצבירה, אשר לאחר מכן ניתן לבחור אותם לניתוח מבנה-פונקציה.

כרומטוגרפיה של זיהוי פלואורסצנטיות של אי הכללת גודל: טכניקה לזיהוי שלמות חלבוני הממברנה הפלואורסצנטית בעת מסיסות חומרי ניקוי

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לביצוע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי (FSEC) על חלבוני ממברנה כדי להעריך את איכותם לניתוח פונקציונלי ומבני במורד הזרם. מוצגות תוצאות FSEC מייצגות שנאספו עבור מספר קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) בתנאים מסיסים בדטרגנטים וללא חומרי ניקוי.

הערכה מהירה של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

למד לקבוע טופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים באמצעות שימוש בכימרות GFP וטיפול בפרוטאז. שיטה זו מאפשרת לחקור את מיקומי הדומיינים של החלבון בציטוזול ובלומן האברונים.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

גלה סרטונים נוספים