Name: בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: למדו לבודד RNA מאוכלוסיות תאים ספציפיות במוח עכברים באמצעות מיקרודיסקציה לייזר בשילוב עם אימונולייבלינג מהיר. שיטה זו שומרת על שלמות ה-RNA ומאפשרת ניתוח ביטוי גנים מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC: 418391-2012). AC מקבלת מלגה מהמרכז למחקר במדעי המוח (CTRN). HDB ממומן על ידי מלגה מ-Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ו-ML הוא FRSQ Chercheur-Boursier.

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם למדריך הקנדי לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים Laval Université ההגנה. הכנת 1. לדוגמא הערה: בדוגמא זו, השתמשנו המוח של עכבר ביום הלידה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהרדמת היפותרמיה בקרח כתוש במשך 3 עד 4 דקות לגורים, ואז לנתח את המוח במהירות אפשרית במדיום L15 קר כקרח. לבצע שלב זה תוך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח העברה גזור בהטבעת עובש (cf. רשימה של אמצעי) ולמלא עם תקשורת רקמה קפוא הטבעה מקפידה לכוון את הדגימה במיקום הרצוי. להקפיא דגימות מייד בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. לבצע שלב זה תוך 30 שניות. ניתן לאחסן דגימות כמה חודשים מבלי להתפשר על איכות RNA: הערה. </li></ol> 2. חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תעודת המקוריות קרום פינוקשקופיות זכוכית טד (cf. רשימה של חומר) עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses. שטוף את השקופיות במי DEPC ולתת להם להתייבש. לחלופין, מגלשות לאפות הלילה ב 200 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הדגימות קפואות בcryostat ניקתה בעבר עם פתרון טיהור RNAse פני השטח. טמפרטורה שנקבעה cryostat הקאמרית ב -20 דגימות C ° ופרוסה בעובי 10 מיקרומטר. לאסוף חלקי רקמות בשקופיות הקרום מצופה ולתת להם להתייבש 10 דקות לפני הצביעה. לחלופין, חנות מחליקה ב -80 ° C עד צביעה. </li></ol> 3. הכנת פתרונות מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל הפתרונות רק לפני תחילת הניסוי, ולהשתמש במעכב RNAse בכל הפתרונות מכתים (פרט לפתרוני כביסה) כדי למנוע השפלה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון החיץ. השתמש באותו החיץ בכל הפתרונות (מורכב מפוספט שנאגרו מלוח RNAse חינם (PBS) בתוספת של BSA 1%,טריטון 0.2% ו -2% מעכב RNAse). עבור כל שקופית, להכין 400 μl של פתרון חיץ (200 μl לעיקרי ו -200 μl לנוגדנים משני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון מקבע: להשתמש באתנול 70% המשיך ב -20 ° C. שמור הליך קיבעון רקמות מינימאלי כדי למנוע ירידה דרסטית בתשואות הפקת RNA. הערה: לחלופין, להשתמש 95% אתנול פתרון בתוספת של 5% חומצה אצטית המשיך ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הנוגדן הראשוני על ידי דילול הנוגדן הראשוני בפתרון החיץ. לתיוג נוירונים דופאמין, להשתמש נוגדן מיקוד hydroxylase טירוזין (TH, שיעור הגבלת אנזים לייצור דופמין). השתמש בריכוז גבוה של נוגדנים, כדי לפצות על זמן דגירה מהיר. השתמש נוגדן TH בדילול של 01:25. הערה: בפרוטוקול immunofluorescence נורמלי, נוגדן זה נותן איתות חזקה כאשר מודגרות לילה בדילול של 1: 1,000. בפרוטוקול זה, הוא משמש 40X תרכיזי יותראד בשל זמן דגירה הקצר. בשל הריכוז הגבוה של נוגדן המשמש לשיטה זו, לבצע immunostaining סטנדרטי במקביל על מנת לבדוק כל גידול בתיוג שאינו ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון נוגדנים משני על ידי דילול הנוגדנים משני בפתרון החיץ. השתמש נוגדנים משני biotinylated בריכוז של 1: 100. הערה: בדוגמא זו, השתמשנו נוגדני biotinylated נגד ארנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון avidin ביוטין המורכב (ABC) לצורך זיהוי של נוגדנים משני biotinylated. הפוך פתרון ABC על ידי הוספת המתחם והמתחם B בריכוז של 1: 2% מעכב RNAse 100 מדוללים בDEPC PBS בתוספת. הכן את 30 דקות המורכבות avidin-ביוטין לפני הוספתו לשקופיות. </li></ol> 4. מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר שקופיות אחד או שתיים בזמן מ-80 ° C על ידי מצליף אותם באוויר במהירות (או להשתמש במפוח אוויר). חלקי Surround עם הידרופוביעט ומחסום לתת יבש למשך כמה שניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופיות בפתרון מקבע הקר ללא יותר מ 5 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לנער פעם אחת באוויר כדי להסיר את העודפים של פתרון מקבע אז, במהירות לטבול שקופיות בזמנים DEPC PBS 6-8 לשטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרור את השקופיות כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS. ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses) ולשים 200 μl של פתרון הנוגדן הראשוני על כל שקופית (ארנב נגד TH) במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות פעם אחת כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 200 μl של פתרון נוגדנים משני על כל שקופית במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות 3 פעמים בDEPC PBS לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את עודף DEPC PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 200 μl של solu ABCtion על כל שקופית במשך 4 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את DEPC עודף PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את DAB (diaminobenzidine 3,3) פתרון בדקות 4 של דגירה בפתרון ABC. השתמש בחומרים הכימיים המסופקים בערכה (קיט DAB Peroxidase מצע). לערבב 1 טיפה של חיץ סיפק, 1 טיפה של פתרון DAB ו1 טיפה של 30% H 2 O 2 ב2.5ml מים DEPC. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 196 μl של פתרון DAB ולהוסיף 4 μl (2%) של פתרון מעכב RNAse רק לפני הפצה בשקופיות. מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse משטח) ולשים 200 μl של פתרון DAB בשקופיות. הערה: פתרון DAB צריך להגיב within1 או 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה ולשים שקופיות לכמה שניות באתנול מוחלט. ייבש את השקופיות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר). &lt;br /&gt; הערה: שקופיות ניתן לאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי או מעובד לLCM. </li></ol> Microdissection לכידה 5. לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר שקופיות במהירות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר). ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך LCM. מניחים את השקף מתחת למיקרוסקופ עם צד המדגם מול כובע צינור האיסוף. בחר את ההגדלה הטובה ביותר למדגם. התאם את המיקוד כדי לראות את התאים של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אזור החיתוך ולהתחיל לחתוך עם הלייזר. איסוף תאים או פיסת הרקמה בכובע צינור איסוף מלא 50 μl של חיץ תמוגה (מערכת חילוץ RNA) גזורים. ודא שהצעד של LCM אינו עולה על 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ RNA הכולל מהתאים מבודדים באמצעות ערכת חילוץ RNA (cf. רשימת חומרים). עקוב הפרוטוקול של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים שנאספו במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס לlyse התאים. תנאי מוקדם עמודת טיהור RNA על ידי הוספת 250 μl של חיץ אוויר. עומס 50 μl של אתנול לתאי lysed. לטעון תאי lysed 100 μl על עמודת טיהור preconditioned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה העמודה ב16,000 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף את העמודה פעמיים עם מאגרי כביסה. Elute בהיקף המינימלי המומלץ (11 μl) של המים RNase חינם (לא טופל DEPC כפי שעלול להפריע לbioanalyser). שמור 2 μl לאיכות בדיקה. הערה: כל הפתרונות לאספקת מים מסופקים בערכה. </li></ol></li></ol> 6. cDNA סינתזה וכמוני RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך-לתמלל דגימות RNA מתאי דופאמין לייזר שנתפס לתוך ה- DNA משלים באמצעות transcriptase ההפוך ואוליגו (DT). עקוב הפרוטוקול של היצרן (cf. רשימה של חומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 μl של cDNA להגברת qRT-PCR עם פריימרים גן ספציפי. מחשבה PCR להגדירctions ב -20 μl נפח עם תערובת תגובת ההתחלה חמה אחד מרכיבים לPCR כמותי כפי שהומלץ על ידי היצרן. לבצע כל תגובה בשלושת עותקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בזוגות פריימר הבאים: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); ה-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); Aadc-F (5&#39;- CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / Aadc-R (5&#39;- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3 &quot;). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הגברה RT-PCR באמצעות פרמטרי הרכיבה מהירים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 45 מחזורים של 10 שניות 95 ° C, 10 שניות על 60 מעלות צלזיוס ו -10 שניות על 72 מעלות צלזיוס. לבצע ניתוח עקום התכה באמצעות הגדרת ברירת המחדל של המכשיר לdetermiהיווצרות מוצר הומוגני ne. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים באמצעות התוכנה מובנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את ערכי הביטוי של גני סמני DA Th וAadc עם הביטוי של שני גני התייחסות GAPDH וRpl13a להשיג רמות ביטוי היחסית כפי שתואר לעיל 14. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+molecular+diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+histology%22%5BJournal%5D)">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li>
<li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+techniques+%3A+JBT%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li>
<li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li>
<li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li>
<li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938(2013).</li>
<li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IF-LCM%3A+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+international%22%5BJournal%5D)">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li>
<li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons%3A+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li>
<li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Endogenous+Serine%2FThreonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor%2C+G-Substrate%2C+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li>
<li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%2C+Quantification+strategies+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22AZ+of+quantitative+PCR%22%5BJournal%5D)">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).</li>
<li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+MolecularDiagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li>
<li>Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tsitologiia%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li>
<li>Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+legal+medicine%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li>
<li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies%3A+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li>
<li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era%3A+targeting+the+genetic+basis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+clinical+and+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנקודה של שיטה זו הקריטית ביותר מורכבת בתיוג תאים של עניין תוך מניעת השפלה RNA. כRNAses פעיל בתמיסות מימיות, הפחתת זמני דגירה משפרת שימור RNA 11,15. כל הפתרונות המשמשים צריכים להיות מטופל בDEPC כדי להשבית RNAses. כל החומרים והמשטחים צריכים להיות מטופלים עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי למנוע זיהום RNAses. לבסוף, בתנאים אלה, התוספת של מעכב RNAse בכל הפתרונות יעילה בשמירה על RNA מלהיות מושפל. השימוש בתנאי מלח גבוהים מיושמים במהלך הדגירה נוגדן הוכח בעבר כיעיל בשמירה על RN...

המוח מורכב ממגוון גדול של סוגים שונים נוירון יוצרים רשתות מורכבות של. נוירונים אלה מאורגנים בקבוצות ותת-קבוצות שונות בהתאם לדפוס מורפולוגיה, הקישוריות וביטוי הגנים שלהם 1. הפיתוח של microarrays, הרצף של הדור הבא, וqRT-PCR הציעו את האפשרות להשוות פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות נוירונים בהקשרים ביולוגיים שונים 1,2. ניתוחים רגישים אלה דורשים זיהוי ובידוד המדויקים של סוגי תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA 2-4. טכניקת פלורסנט הופעלה תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב לבודד את סוגי תאים ספציפיים המבוססים על סמנים על פני קרום תא ו / או מורפולוגיה. FACS דורש צעד ניתוק תא לפני המיון, שתוצאתה אובדן הרזולוציה מרחבית 5 מלא. תת-אוכלוסיות עצביות רבות נבדלות זו מזו על פי ההתפלגות האנטומי שלהם בהמוח אלקטרוני. microdissection ללכוד לייזר מיושם על חלקים במוח דקים מספק אפשרות מתאימה לבידוד ספציפי של תאים עם רזולוציה מרחבית גבוהה 6-8. מגבלה העיקרית של LCM הייתה הצורך לזהות תאים של עניין על פי קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי המהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים. הפיתוח של טכניקות חדשות לביצוע שיטות immunolabeling מהירות שהשתמרו שלמות RNA, בשילוב עם LCM, עכשיו מאפשר הבידוד של אוכלוסיות תאים להמשיך בניסויי פרופיל-גן. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים 1,9-13. הנה, אנחנו מדגימים נוהל מפורט להשגת RNA באיכות גבוהה מקבוצת משנה ספציפית של תאים במבנה רקמה מורכב על ידי שילוב של immunolabeling מהיר עם LCM. אנו מראים כיצד לבצע שלבים קריטיים מפתח להשגת התאוששות RNA מקסימאלי ולהימנע משפלת RNA כפי שהוא עשוי sigהפרופיל של התבטאות הגנים השפעת nificantly. להפגנה של פרוטוקול זה, נוירונים דופאמין מהמוח תיכון עכבר יום אחד-עשר היו ממוקדים. ניתן immunolabeled נוירונים דופאמין באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (TH), אנזים שער הגבלה לסינתזת דופמין. בעקבות immunostaining TH, בודד או קבוצות של נוירונים דופאמין אז יכול להיות מבודדות באמצעות LCM. תאי microdissected נאספים במאגר תמוגה, ו- RNA מופק באמצעות ערכת בידוד RNA. איכות וכמות של RNA שחולץ נמדדות באמצעות bioanalyzer 5. ניתוח נוסף של ביטוי גנים באמצעות: רצף RNA, microarray, או qRT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע 2,4,6. כדוגמא, שני שלבים qRT-PCR בא לידי הביטוי בתחומי דופאמין המבודד הלייזר שנתפס. כימות יחסי של רמות הביטוי של גני סמן נוירון שני דופאמין ממחיש את הסלקטיביות של פרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td>שקופיות מצופות ממברנה&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>11505158</td><td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 ומיקרו; m; 50 יחידות</td></tr><tr><td>פתרון טיהור RNAse פני השטח</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM9780</td><td>RNaseZap</td></tr><tr><td>Fixative</td><td></td><td></td><td>70% אתנול נשמר ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>אנטי-TH&nbsp;</td><td>פל-פריז</td><td>P40101</td><td>&nbsp; 1:25</td></tr><tr>מאגר <td></td><td></td><td>ללא RNAse</td><td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% טריטון</td></tr><tr><td>מעכב RNAse</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>מעכב רנזין פלוס Rnase 40 kU/ml (מלאי)</td></tr> <tr><td>מעבדות וקטור</td> <td>ביוטיניל נגד ארנב</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC ערכת</td><td>מעבדות וקטור</td> סטנדרטיות <td>PK-6100</td><td>8&micro; ליטר / מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת מצע DAB פרוקסידאז&nbsp;</td>ערכת בידוד RNA <td>SK-4100</td><td></td> <td>Vector</td></tr><tr><td></td><td>Laboratories טכנולוגיות חיים</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure ערכת בידוד RNA</td></tr><tr><td>H2O2 30%</td> <td>Sigma</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מערכת מיקרו-דיסקציה לייזר</td><td></td><td>מוחלטת</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Leica דגם AS-LMD <tr><td>DEPC</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22753-14</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Agilent</td><td></td><td>2100 עובש הטמעת ביואנלייזר</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td> עט מחסום הידרופובי <td>6x8 מ"מ</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>מדיה להטמעת רקמות קפואות</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>שבב ביואנלייזר</td><td>Aligent Technologies</td><td>5067-1513</td><td>RNA 6000 Pico LabChip בשימוש עם Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>תערובת תגובה להתחלה חמה עבור PCR כמותי</td><td></td><td>Roche 6402712001</td><td>התחלה מהירה חיוני DNA ירוק מאסטר</td></tr><tr><td>הפוך טרנסקריפטאז</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>11752-050</td><td>SuperScript III SuperMix סינתזה של גדיל ראשון עבור qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

בידוד rna מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר הבידוד של תאים ספציפיים מסעיפי רקמות דקים עם רזולוציה מרחבית גבוהה. LCM האפקטיבי דורש זיהוי מדויק של תת-אוכלוסיות תאים מרקמות הטרוגנית. זיהוי של תאים בעלי העניין לLCM מבוסס בדרך כלל על קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי. השילוב של LCM וimmunolabeling המהיר מציע אמצעים חלופיים ויעילים כדי להמחיש סוגי תאים מסוימים ולבודד אותם מרקמה הסובבת. RNA באיכות גבוהה אז יכול להיות שחולץ מאוכלוסיית תא טהורה ועיבוד נוסף ליישומים במורד הזרם, כולל RNA-רצף, microarray או qRT-PCR. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש כיצד לבצע immunolabeling המהיר של אוכלוסיית תא, תוך שמירה על שלמות RNA, ואיך לבודד תאים הספציפיים אלה באמצעות LCM. במסמך זה, אנו ממחישיםד הליך רב-שלבים זה על ידי immunolabeling ולכידת תאי דופאמין ברקמת מוח מעכברים ליום אחד-עשר. אנו מדגישים את שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של רקמות ותאים של עניין. חוקרים מתחומים שונים צפויים ליהנות מההפגנה של גישה זו.

הליך immunolabeling מהיר זו מאפשר הדמיה של תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA. איור 1 מדגים את השלבים של הכנת רקמה לפני מיצוי RNA. לאחר cryosectioning, נוירונים דופאמין מסומנים באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (נוירונים שכותרתו מופיעים בחום). בהתאם לשאלה הניסיונית, יכולים להיות מבודד תאים בודדים או באזור גדול יותר של עניין באמצעות LCM (1D איור - E). חשוב להעריך את איכות RNA חילוץ, כRNA המושפל יהיה השפעה ניכרת על איכ...

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד לבצע סימון אימונולוגי מהיר של אוכלוסיית תאי מוח של עכבר שבודדו באמצעות מיקרו-דיסקציה של לכידה בלייזר (LCM), תוך שמירה על שלמות ה-RNA של הדגימות. דבר זה מושג תחילה על ידי הקפאה מהירה של רקמת המוח שבוצעה לה מיקרו-דיסקציה. לאחר מכן, המוח נחתך לפרוסות דקות על גבי תויות זכוכית למיקרוסקופ נטולות RNA ועובר תהליך של צביעה אימונולוגית מהירה.לבסוף, אוכלוסיית התאים הרצויה מבודלת באמצעות LCM. בסופו של דבר, הצביעה המהירה ולאחריה מיקרו-דיסקציה בלייזר מאפשרות זיהוי של שינויים בביטוי של הגן הרלוונטי בדגימת התאים הניסויית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), הוא שבטכניקה שלנו נשמרת הרזולוציה המרחבית, מה שמאפשר בידוד של תאי ES ספציפיים מהרקמה הסובבת.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשימוש בתא סמית' (smith cell) יתקשו בתהליך זה, כיוון שפרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים הדורשים עבודה מהירה כדי לשמור על שלמות ה-RNA בדגימות. כדי להכין את הדגימות לחיתוך, יש לבצע דיסקציה של המוחות מעכברים ביום הראשון לאחר הלידה בתוך תוך שתי דקות מההריגה, בתוך תווך L 15 קר מאוד. לאחר מכן, יש להניח את המוחות בתוך תבניות להטמעה בכיוון המתאים לחיתוך ולמלא את התבניות בחומר להטמעת רקמה קפואה.לאחר מכן, הקפיאו מיד את הדגימות בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס בתוך 30 שניות מההקפאה המהירה. כעת, בצעו דה-קונטמינציה של RNA מהפני השטח של שקופיות זכוכית מצופות ממברנה כדי להסיר כמויות שרידיות של RNA. שטפו אותן במים שעובדו ב-DEPC והניחו להן להתייבש באוויר עד שהשקופיות ייובשו.הגדירו את טמפרטורת תא הקריוסטט ל-20- מעלות צלזיוס והעבירו את הדגימה הקפואה לקריוסטט. עבור כל דגימה, הצמידו את הבלוק הקפוא לתפסן הדגימות וחתכו את הדגימות בעובי של 10 מיקרון, תוך איסוף החתכים על עלויות מצופות ממברנה. לאחר ייבוש החתכים למשך 10 דקות לפחות, השתמשו בעט למחסום הידרופובי כדי להקיף את הרקמות.לאחר כ-10 שניות, הניחו את השקופיות בתמיסת קיבוע קרה שהוכנה טרייה למשך לא יותר מחמש דקות בטמפרטורה של 20- °C. כעת העבירו את השקופיות למגש נקי שטופל מראש בתמיסה לדה-קונטמינציה של RNA מהמשטח. ראשית, נערו את השקופיות פעם אחת כדי להסיר שאריות תמיסת קיבוע ושטפו אותן באמצעות שישה עד שמונה טבילות מהירות ב-D-E-P-C-P-B-S על ידי ניעור השקופיות.כדי להסיר את עודפי ה-D-E-P-C-P-B-S, יש להוסיף 200 µL של תמיסת הנוגדן הראשוני לכל נתח. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לשטוף את השקופיות באמצעות שלושה טבילות מהירות ב-D-E-P-C-P-B-S ולנער אותן פעם אחת להסרת עודפי תמיסת השטיפה. לאחר מכן, יש לדגור את הדגימות ב-200 µL של תמיסת הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך שש דקות.שטפו את השקופיות ב-D-E-P-C-P-B-S כפי שהודגם acab, והדגיפו אותן בתמיסת BC שהוכנה טרייה למשך ארבע דקות לאחר שטיפה מהירה נוספת ב-D-E-P-C-P-B-S. ערבבו 196 µL של DAB שהוכן טרייה עם 4 µL של מעכב RNA. ממש לפני הוספת התמיסה לחתך, המתינו דקה עד שתיים לפיתוח ה-DAB, ולאחר מכן בצעו שטיפה ב-A-D-E-P-C-P-B-S. לאחר מכן, ייבשו את החתכים על ידי הדגפה של מספר שניות באתנול מוחלט, וניעו את השקופיות כדי לייבשן לפני המעבר ל-LCM.בשלב הבא, העבירו 50 µL של תמיסת ליזיס (lysis buffer) מתוך ערכה להפקת RNA אל מכסה של מבחנת איסוף. לאחר מכן, הניחו זכוכית נושאת תחת המיקרוסקופ כאשר הצד עם הדגימה פונה כלפי המכסה. בחרו בהגדלה המתאימה ביותר עבור הדגימה וכוונו את המיקוד כדי לראות את התאים הרלוונטיים.לאחר מכן הגדירו את שטח החיתוך והתחילו בחיתוך באמצעות הלייזר. אספו את החומר שנחתך אל מכסה שפופרת האיסוף והדגירו את התאים שנאספו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 42 °C. במהלך זמן זה, בצעו עיבוד מוקדם (precondition) לעמודת טיהור RNA מתוך ערכת מיצוי ה-RNA באמצעות 250 µL של תמיסת עיבוד (conditioning buffer).לאחר מכן, טענו 50 µL של אתנול אל התאים המלוססים שבעמודה וסובבו את העמודה בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-16,000 Gs ובטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו שני שטיפות עם באפר שטיפה. לבסוף, אלוטו את ה-RNA בנפח המינימלי המומלץ של 11 µL של מים נקיים מ-RNA, תוך הפרשת 2 µL לבדיקת איכות ה-RNA. הליך סימון אימונונולוגי מהיר זה מאפשר ויזואליזציה של התאים הרלוונטיים תוך שמירה על שלמות ה-RNA הניסויי.בהתאם לניסוי, ניתן להשתמש ב-LCM כפי שהודגם כעת כדי לבודד תאים בודדים או אזורי עניין גדולים יותר. ל-RNA שעבר דגרדציה יש השפעה ניכרת על איכות הניתוח הבא בתהליך. לכן, כל דגימה מעובדת בהמשך על פלטפורמת bioanalyzer מבוססת microfluid X כדי לאפשר כימות ואימות של שלמות ה-RNA המבודד, כפי שהודגם כעת.לדוגמה, מוצגות כאן תוצאות ביו-אנליזה (bioanalyzer) טיפוסיות של דגימות RNA באיכות טובה ובדגימות מנוונות. אכן, הג'ל הדיגיטלי והאלקטרופורגרמות מדגימים את החשיבות של שימוש במעכב RNase בכל תמיסה כדי להגן על ה-RNA. בעקבות הליך זה, ניתן להמשיך בעיבוד של RNA באיכות גבוהה עבור יישומים המשכיים, כולל ריצוף RNA, MICROARRAY או Q-R-D-P-C-R. לדוגמה, בגרפים אלו, נקבע כי ההעשרה הממוצעת עבור ביטוי הגנים TH ו-A A DC בדגימה שעברה מיקרו-דיסקציה ביחס לחתכי מוח אמצעי הייתה גבוהה פי 170.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות רבה ובסביבה נקייה מ-RNAs. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודלים אוכלוסיית תאים ספציפית מכל רקמה.

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

סרטון זה מתאר את הטכניקה לקבלת תא בודד מאוכלוסיית תאים הטרוגנית באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר. התא המבודד היחיד יכול לשמש למחקרים גנומיים נוספים או לחקר הסרטן.

דגימת תא בודד באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר: טכניקה לקצירת תאי מטרה מאוכלוסיית תאים הטרוגנית

אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את הביטוי של מגוון רחב של גנים ברמה המשובטת. RT-qPCR מתחיל מתא בודד מייצר תוצאות אמינות ביותר עם רגישות חזקה במשך מאות דגימות וגנים.

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

פרוטוקול זה מסביר כיצד לאסוף נוירונים בודדים, microglia, ו אסטרוציטים מן הגרעין המרכזי של האמיגדלה עם דיוק גבוהה וספציפיות אנטומיים באמצעות לכידת לייזר מיקרוניתוח לכידה. בנוסף, אנו מסבירים את השימוש שלנו במיקרופלואידיג RT-qPCR כדי למדוד תת-קבוצה של התאים הללו.

שילוב לכידת לייזר ובדיקות מיקרופלוטואידים לניתוח פרופילים של תאים בודדים: גישת ביולוגיה של מערכות לתלותיות באופטואיד

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

לכידת לייזר microdissection של רקמות פיברוזיס submucous הפה מאפשר מיצוי מדויק של תאים מאזורים היסטולוגיים של עניין לניתוח של נתונים multi-omics עם מידע מורפולוגי ומרחבי.

בידוד תאים עם מידע מורפולוגי ומרחבי מדגימות פיברוזיס תת-רירית דרך הפה באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוMS לספקטרומטריית מסה MALDI-2 חד-תאית מונחית פלואורסצנטית, המאפשרת פרופיל מולקולרי משופר של תאי עצב ראשוניים של חולדות.

ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה פלואורסצנטית עם ספקטרומטריית מסה פוסטיוניזציה המושרה בלייזר של תאים עצביים בודדים של חולדה

למדו לבודד RNA מאוכלוסיות תאים ספציפיות במוח עכברים באמצעות מיקרודיסקציה לייזר בשילוב עם אימונולייבלינג מהיר. שיטה זו שומרת על שלמות ה-RNA ומאפשרת ניתוח ביטוי גנים מדויק.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

גלה סרטונים נוספים