בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לבצע תיוג חיסוני מהיר של אוכלוסיית תאי מוח של עכבר המבודדים על ידי לכידת לייזר, מיקרו דיסקציה או LCM תוך שמירה על שלמות ה-RNA של הדגימות. זה מושג על ידי הקפאה מהירה של רקמת המוח המנותחת. לאחר מכן חותכים את המוח לחלקים דקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית נטולות RNA ומטופלים בצביעה חיסונית מהירה.

לבסוף, אוכלוסיית התאים המעניינת מבודדת באמצעות LCM. בסופו של דבר, הצביעה המהירה ואחריה מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר מאפשרת זיהוי שינויים בביטוי הגן המעניין בדגימת התא הניסיוני. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים, הוא שבעזרת הטכניקה שלנו, הרזולוציה המרחבית נשמרת ומאפשרת פתרון של התא הספציפי של ES מהרקמה שמסביב.

בדרך כלל, אנשים חדשים בתא סמית זה יסתובבו מכיוון שהליך זה כולל מספר שלבים קריטיים הדורשים עבודה מהירה כדי לשמור על שלמות ה-RNA בדגימות. כדי להכין את הדגימות לחתך, נתחו את המוחות של עכברים מהיום הראשון לאחר הלידה במדיום L 15 קר כקרח תוך שתי דקות מההקרבה. לאחר מכן, הניחו את המוחות בתבניות הטמעה בכיוון המתאים לחיתוך ומלאו את התבניות ברקמה קפואה, והטמיעו מדיה.

לאחר מכן הקפיאו מיד את הדגימות בחנקן נוזלי ואחסנו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס תוך 30 שניות מהקפאת הצמד. כעת, טפל בשקופיות זכוכית מצופות ממברנה עם טיהור RNA פני השטח כדי להסיר כמויות עקבות של RNA. שטפו אותם במי DEPC ותנו להם להתייבש באוויר כשהמגלשות יבשות.

הגדר את טמפרטורת תא הקריוסטט למינוס 20 מעלות צלזיוס והעביר את הדגימה הקפואה לקריוסטט. עבור כל דגימה, הרכיבו את הבלוק הקפוא על הדגימה clamp ופרסו את הדגימות בעובי של 10 מיקרון, ואספו את החלקים על השקופיות המצופות בקרום. לאחר שנתנו לחלקים להתייבש במשך 10 דקות לפחות, השתמשו בעט מחסום הידרופובי כדי להקיף את הרקמות.

לאחר כ -10 שניות, הניחו את השקופיות בתמיסת קיבוע קרה שהוכנה טרייה למשך לא יותר מחמש דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. כעת העבירו את השקופיות למגש נקי שטופל מראש בתמיסת טיהור RNA פני השטח. ראשית, נער את השקופיות פעם אחת כדי להסיר את כל הקיבוע העודף ושטוף אותן עם שש עד שמונה טבילות מהירות ב-D-E-P-C-P-B-S החלק את השקופיות.

כדי להסיר את עודפי ה-D-E-P-C-P-B-S, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים העיקרית לכל חלק. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את השקופיות בשלוש טבילות מהירות ב-D-E-P-C-P-B-S והחליקו אותן פעם אחת כדי להסיר את תמיסת הכביסה העודפת. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-200 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים המשנית בטמפרטורת החדר לאחר שש דקות.

שטפו את השקופיות ב-D-E-P-C-P-B-S כפי שהודגם זה עתה ודגרו אותן בתמיסת BC שהוכנה טרי למשך ארבע דקות לאחר עוד שטיפה מהירה D-E-P-C-P-B-S מערבבים 196 מיקרוליטר של DAB טרי שהוכן עם ארבעה מיקרוליטר של מעכב RNA. רגע לפני הוספת התמיסה לקטע, אפשר ל-DAB להתפתח למשך דקה עד שתיים, ולאחר מכן שטיפה A-D-E-P-C-P-B-S. לאחר מכן ייבשו את החלקים עם דגירה של כמה שניות באתנול מוחלט וייבשו את המגלשות כדי להמשיך ל-LCM.

לאחר מכן, ב-50 מיקרוליטר של מאגר ליזה מערכת מיצוי RNA לתוך מכסה צינור האיסוף. לאחר מכן הנח שקופית אחת מתחת למיקרוסקופ כשצד הדגימה פונה למכסה. בחר את ההגדלה הטובה ביותר עבור הדגימה והתאם את המיקוד כדי לראות את התאים המעניינים.

לאחר מכן הגדר את אזור החיתוך והתחל לחתוך עם הלייזר. איסוף החומר המנותח בצינור האיסוף מכסה את התאים שנאספו למשך 30 דקות ב-42 מעלות צלזיוס. במהלך תקופה זו, יש להכין מראש עמודת טיהור RNA מערכת מיצוי RNA עם 250 מיקרוליטר של מאגר מיזוג.

לאחר מכן טען 50 מיקרוליטר אתנול לתאים הליזים על העמוד וצנטריפוגה את העמוד למשך שתי דקות ב-16,000 Gs וטמפרטורת החדר ולאחר מכן שתי שטיפות עם מאגר כביסה. לבסוף, יש להוציא את ה-RNA בנפח המינימלי המומלץ של 11 מיקרוליטר מים נטולי RNA תוך שמירה על שני מיקרוליטר בצד כדי לבדוק את איכות ה-RNA. הליך תיוג חיסוני מהיר זה מאפשר הדמיה של תאים מעניינים תוך שמירה על שלמות ה-RNA הניסיוני.

בהתאם לניסוי, ניתן להשתמש ב-LCM כפי שהודגם זה עתה כדי לבודד תאים בודדים או אזורי עניין גדולים יותר. ל-RNA מושפל יש השפעה ניכרת על איכות הניתוח במורד הזרם. כל דגימה מעובדת אפוא על ביו-אנלייזר פלטפורמה מבוסס מיקרופלואיד X כדי לאפשר כימות ואימות של שלמות ה-RNA המבודד כפי שהודגם זה עתה.

לדוגמה, כאן, תוצאות ביו-אנלייזר טיפוסיות באיכות ירודה וטובה כאחד. דגימות RNA מוצגות. ואכן, ג'ל דיגיטלי ואלקטרופרוגרמות מדגימים את החשיבות של שימוש במעכב ראס בכל תמיסה כדי להגן על ה-RNA בעקבות הליך זה, ניתן לעבד RNA באיכות גבוהה עוד יותר עבור יישומים במורד הזרם, כולל ריצוף RNA MICROARRAY או Q-R-D-P-C-R, למשל, בגרפים אלה, ההעשרה הממוצעת לביטוי הגנים TH ו-A A DC בדגימת המיקרו המנותחת ביחס לחלקי המוח האמצעיים נקבעה כיותר מפי 170.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור עבודה מהר מאוד ועם חומר נטול RNA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוכלוסייה ספציפית של תאים מכל רקמה.