הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את מחסום המינים של אנימליות ספוגיות העוברות, המכונה TSC, עבור מין נתון, ללא צורך בחשיפת בעלי חיים חיים. זאת מושגים תחילה על ידי הכנת שני substrates לבדיקת המרה לשימוש בבדיקה in vitro. השלב השני הוא דגירה של substrates אלו עם סוכני ה-TSE שברצונכם לבחון.

לאחר עיכול באמצעות Protase K, הדגימות עוברות SDS page ו-immunoblotting. השלב הסופי הוא מדידת כמות חלבון ה-PreOn העמיד ל-proteinase K בכל תסביך באמצעות D cytometry והשוואת כמויות אלו על ידי חישוב יחס יעילות המרה או CER. בסופו של דבר, ה-CER מספק מדד למחסום המינים עבור ה-TSE שנבדק ביחס למין המארח ממנו הוכן התסביך.

יתרונותיה של בדיקה זו כוללים עלות נמוכה, מסגרת זמן ניסויית קצרה והחלפת בעלי חיים חיים בדגימות רקמה. אף ששיטה זו מתאימה מאוד למתן תובנות לגבי מחסומי מינים במקרה של מחלות פריון בבעלי חיים ברים, ניתן ליישמה בכל מין אחר שמעניין את החוקר. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים בהכנת התשתית (substrate), בבקרת איכות ובסטנדרטיזציה.

לאחר השגת רקמת מוח בריאה שאינה נגועה מהמין הרלוונטי, הכין הומוגנאט בריכוז 10% משקל לנפח בבפר לזיס (lysis buffer) באמצעות טחנת כדורים או מכתש ועלי. לאחר ההומוגניזציה, זקק את ההומוגנאטים על ידי מעבר דרך מזרק ומחט, תוך שימוש במחטים בעובי (gauge) הולך וקטן, עד שהתסביס ניתן לשאיבה ולהזרקה בקלות דרך מחט של מזרק במידה 27.

כעת, בדקו את ערכי ה-pH של תמיסות הסובסטרט והשתמשו בחומצה כלורית רכזית או בנתרן הידרוקסיד לפי הצורך כדי להבטיח שערך ה-pH של כל סובסטרט יישאר בטווח של פלוס או מינוס 0.05 מה-pH המטרה. סובבו את התמיסות במערבל end over end בטמפרטורת החדר למשך חמש שעות. לאחר מכן, השקיפו את החלבון על ידי הוספת ארבעה נפחים של מתנול לתמיסות הסובסטרט בכל vortex קוני כדי לערבב היטב, והדגירו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות.

לאחר הדגירה, שקיעו את הדגימות באמצעות סנטריפוגה ב-13,000 G למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו בזהירות והשליכו את העל-משקעים (supernatants) והמתינו להתאיידות המתנול מהמשקעים. השתמשו במקלונים עם טיפת צמר כדי לסייע בספיגת מתנול שנדבק לדפנות הפנימיות של המבחנה.

אין לאפשר לכריות המשקע להתייבש יתר על המידה. עברו לשלב הבא כאשר המטנול אינו נראה יותר; השתמשו בכמות של בופר המרה השווה לכמות חומר המוצא של הומוגנאט המוח כדי לסבסב מחדש את כריות החלבון. לאחר הסבסוב, בצעו סוניקציה קצרה לתמיסאות התשתית למשך 10 שניות.

בצע סוניקציה בכלי קיבול (cup horn) בעוצמה של כ-30% מהעוצמה המקסימלית. לאחר מכן, חלק את התמיסות לאליקוואטים של 0.5 עד 1 ml בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה מסומנות בנפח 1.5 ml, מאחר שחלבון פריון תאי בשני התסובים אמור להיות רגיש ל-proteinase K. טפל ב-10 עד 25 µL מכל תסוב באמצעות proteinase K בריכוז סופי של 100 µg/mL, ועשה עיכול לדגימות במהירות של 1000 RPM בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת בשייקר תרמי (thermo shaker). העמס את התסובים שעברו עיכול ב-proteinase K, יחד עם 10 עד 25 µL מכל תסוב שלא עבר עיכול.

בצעו ריצה על ג'ל SDS-PAGE, חסימה אימונולוגית (immuno block) עם נוגדן ספציפי לחלבון פריון כדי להעריך את חלבון הפריון של המארח, את העמידות ל-proteinase K ואת רמות החלבון שלא עבר עיכול. תמונה זו מציגה את תוצאות ה-immuno blot. שני הנתיבים הראשונים מכילים את התסמיכים שלא עברו עיכול, ושני הנתיבים מימין מכילים את התסמיך שעבר עיכול באמצעות proteinase K.

אם רמות החלבון בתשמיות ב-pH 7.4 וב-pH 3.5 נחוצות בטווח של כ-10% זו מזו ואינן עמידות ל-proteinase K, זוגות התשמיות מתאימים לשימוש במחקרי CER. יש לאחסן מנות אחרות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לביצוע בדיקת ה-CER. יש לטפל בסוכני TSE תוך נקיטת אמצעי בטיחות ביולוגית מתאימים ובהתאם להנחיות המוסדיות. לאחר השגת רקמת מוח מזוהמת ב-TSE מהמין הרלוונטי, יש להכין הומוגנאט של 10% משקל לנפח ב-1X PBS ב-pH 7.4, תוך שימוש בשיטת ההומוגניזציה ששימשה קודם לכן להכנת זוגות התשמיות.

העבירו את ההומוגנאטים שהתקבלו לנפחים של 100 עד 300 µL בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 mL ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C עד לביצוע בדיקת ה-CER. כדי להתחיל, הפשיתו באיטיות כמויות שוות של תמיסות זריעה (seed solutions) של substrat CER שאינו נגוע ב-pH 3.5 ו-7.4, ושל תמיסות זריעה נגועות ב-Prions וב-TSE, על ידי הנחתן על קרח למשך כשעה. לאחר ההפשרה, שמרו את התמיסות על קרח ובצעו הומוגניזציה חוזרת על ידי שאיבה והזרקה של כל תמיסת substrate דרך מחט של מזרק בכילוג 27.

לאחר מכן, בצעו סוניקציה קצרה לכל תמיסה מזוהמת ב-TSE למשך 10 שניות, בהספק של כ-30% מההספק המקסימלי. לאחר מכן, הכינו תגובות המרה במבחנות PCR בעלות דופן דקה ובקישור נמוך עם סימון, על ידי הpipette של 95 µl של סובסטרט CER. הכינו ב duplicate (כפול) לשתי מהמבחנות סובסטרט CER שהוכן ב-pH 7.4, ו-95 µl של סובסטרט CER שהוכן ב-pH 3.5 ב-duplicate לשתי מבחנות נוספות.

לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של תמיסת זרעים מזוהמים ב-10%TSE למבחנה אחת מכל אחת מהתתי-מצעים ב-pH 7.4 ו-3.5. במקביל, הוסיפו 5 µL של באפר המרה למבחנה השנייה של כל אחת מהתתי-מצעים ב-pH 7.4 ו-3.5, כדי לשמש כביקורת להמרה לא ספציפית שאינה מתווכת תבנית. כמו כן, הכינו ביקורת לחלבון פריון עמיד ל-proteinase K כחלבון קלט.

עבור כל סוכן TSE הנבדק, הוסף 5 µL של תמיסת זריעה מזוהמת ב-TSE בריכוז 10% ל-95 µL של תמיסת המרה (conversion buffer) כביקורת. ערבב קצרות באמצעות וורטקס (vortex) כל דגימה בתוך מבחורת ה-PCR הסגורה, כדי להומיס את התססית (substrate). לאחר מכן, בצע סבב קצר במ centri-fuge שולחני קטן במהירות נמוכה כדי להסיר כל שארית של תערובת התגובה שנדבקה למכסה מבחורת ה-PCR.

העבירו את המבחנות למכשיר thermo shaker שולחני המותאם למבחנות PCR וערבבו את הדגימות ב-1000 RPM בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. למחרת, הוסיפו sarco cell לריכוז סופי של 2% w/v ו-proteinase K לריכוז סופי של 100 µg/mL. עסקו את הדגימות ב-1000 RPM בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה ב-Thermo shaker. הוסיפו תמיסת דגימה ל-SDS page, חממו את הדגימות ל-95 °C למשך 10 דקות, והפרידו את חלבון ה-PreOn שנותר, העמיד ל-pronase K, בכל דגימה באמצעות SDS page, ולאחר מכן בצעו immuno blotting כפי שנעשה קודם לכן. לבסוף, חשבו את יחס יעילות ההמרה כמדד למחסום בין המינים (species barrier).

בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב לעכבר, תסבך עבור בדיקת CER שהוכן ב-pH 7.4 או 3.5 הודגרה עם scrapy של עכבר המותאם ל-RML, scrapy קלאסי של כבש ביתי, מחלת הבזבוז הכרונית של צבי זנב-לבן, או זן 2 63 K של scrapy המותאם להמסטר. בבדיקת CER, דגימות הביקורת המסומנות כ-none הכילו כמות שווה של חומר זיהומי, ולא נותחו דגימות תסבך של עכבר לבדיקת נוכחות של חלבון פריון העמיד לפרוטאינז K באמצעות immuno blot עם הנוגדן המונוקלונלי SAF 83.

ערכי tric גולמיים עבור כל דגימה מוצגים מתחת לכל נתיב של פרוטאינאזה. רמות חלבון פריון העמיד ל-K השתנו בין תתי-הקרקעות של העכברים, אשר הותמרו ב-pH 7.4 והוחדרו עם סוכני TSE השונים. בעוד שחלבון פריון העמיד לפרונאז K נמצא בכל תתי-הקרקעות שהותמרו ב-pH 3.5 והוחדרו עם סוכן TSE, גרף עמודות זה מציג את היחסיים הממוצעים פלוס או מינוס סטיית תקן בין תתי-הקרקעות של עכברים ב-pH 7.4 ו-3.5 עבור כל גורם זיהומי, בהתבסס על לפחות שלוש הרצות בדיקה עצמאיות.

אותיות קטנות מציינות תתי-קבוצות הומוגניות מבחינה סטטיסטית, כפי שנקבע על פי ערך p קטן מ-0.05 באמצעות ניתוח שונות (analysis of variance), באמצעות שיטת Tukey-Kramer להבדלי מובהקות מינימליים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בפחות מ-48 שעות אם היא מבוצעת כהלכה. ניתן להשתמש בבדיקת ה-CER כהערכה ראשונית לקיומה של מחסום-מינים של TSE, שעשוי להצדיק או לשלול את הצורך במחקרים נוספים בבעלי חיים חיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הכנת תשתיות (substrates), ביצוע תגובות המרה וחישוב יחסי יעילות המרה להערכת מחסומי מינים.