Name: הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם במבחנה Assay המרת חלבון הפריון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: חקור מחסומי מינים במחלות פריון באמצעות מבחן המרה במבחנה. שיטה זו מודדת יחס יעילות המרה ללא צורך בניסויים בבעלי חיים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'ון אולסן (מחלקת משאבי הטבע של ויסקונסין), טום קולי, דניאל או'בריאן וסטיב שמיט (מחלקת משאבי הטבע של מישיגן) וד"ר דניאל וולש (המרכז הלאומי לבריאות חיות הבר של USGS) על הסיוע ברכישת רקמות. אנו מודים גם למעבדת ההיגיינה של מדינת ויסקונסין על שירותי בדיקות האבחון, ולד"ר טוני רוק והצוות שלה (המרכז הלאומי לבריאות חיות הבר של USGS) על השימוש בציוד. כל שימוש בשמות מסחר, מוצרים או חברות הוא למטרות תיאוריות בלבד ואינו מרמז על תמיכה של ממשלת ארה"ב.

עבודה בבעלי חיים שנערכו במרכז בטבע הלאומי USGS הבריאות בוצעה בהתאם להנחיות משרד NIH של בעלי החיים במעבדת רווחה ותחת טיפול בבעלי חיים מוסדי ו# פרוטוקול EP080716 ועדת שימוש. רקמות מבעלי החיים שנקטפו-צייד היו מתנות ומיסקונסין או מישיגן מחלקות משאבי טבע. 1. פתרון הכנה הערה: הפתרונות המפורטים להלן נדרשות להכנת מצע assay CER בסעיף 2 להלן. הכן כל אחד מפתרונות אלה מפתרונות מניות ריכוז גבוהים יותר; ריכוזים מומלצים עבור פתרונות מניות יינתנו בסוגריים אחרי כל שם כימי המתאים מופיע ברשימה. הכן את כל הפתרונות הטריים על הכנת מצע ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למאגר תמוגה, להכין פתרון מאלה ב 10 מ&quot;מ טריס, pH 7.5 (1 M טריס, פתרון 7.5 pH המניה מומלץ): 100 מ&quot;מ שלכלוריד גנות (NaCl, פתרון מניות 1 M), חומצת ethylenediaminetetraacetic 10 מ&quot;מ (EDTA, 500 mM EDTA, pH פתרון מניות 8.0), 0.5% NP-40 (פתרון מניות 10%), deoxycholate 0.5% (DOC, פתרון מניות 10% ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיץ המרה, להכין פתרון של סולפט 0.05% dodecyl נתרן (SDS, 10% מניות פתרון) ו 0.5% Triton X-100 (פתרון 10% מניות) בתמיסת מלח 1 פוספט (PBS, 10, pH פתרון מניות 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרונות chaotropic, להכין שני 3 M פתרונות של hydrochloride guanidine (GdnHCl, 8 M מלאי) ב1x PBS (פתרון המניות 10x). התאם את ה- pH של אחד מהפתרונות ל -3.5 ± 0.05 באמצעות חומצה מרוכזת הידרוכלורית (HCl). בדוק שpH של התמיסה השנייה נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים באמצעות הידרוקסיד מרוכז HCl או נתרן (NaOH) במידת צורך. </li></ol> 2. הכן זוגות CER Assay מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמה בריאה, שאינו נגועה TSE-מוח ממינים של ריבית ולהכין 10% נפח משקל לכל(W / v) homogenate במאגר תמוגה באמצעות אחת מהשיטות הבאות: dounce, חרוז-טחנה, או הומוגניזציה מכתש ועלי. לחדד עוד וכתוצאה מכך homogenates על ידי חשיפתם להומוגניזציה מזרק ומחט, באמצעות מחטים של מד הגדלת עד מצע יכול להישאף וגורש בקלות באמצעות מחט מזרק G 27. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצעים שהוכנו ממכרסמים ויונקים קטנים אחרים, homogenize מוח כולו (ים); למצעים שהוכנו מיונקים גדולים יותר, להשתמש OBEX רקמה (גזע המוח) להכין homogenates. בעת בחירת כמות homogenate המוח, להכין לא יותר מ -50% מהקיבולת של צנטריפוגות משמשת למשקעי חלבון בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם האיכות של רקמת המוח רכשה מוטלת בספק, להעריך את רמות PRP C על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblot 17 הכנה מוקדמת למצע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלק homogenate המוח לשני כרכים שווים בצינורות חרוטי נפרדים שכותרתו פלסטיק. להוסיף GdnHCl (3 M פתרונות ב1 PBS) בשני pH 3.5 או 7.4 לכל צינור ביחס של 1: 1 נפח לhomogenate המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את ערכי ה- pH של שני פתרונות. התאם את ה- pH של pH 3.5 המצע לpH ± 0.05 באמצעות HCl המרוכז. להבטיח את ה- pH של המצע האחר נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים את ה- pH במידת צורך עם HCl או NaOH במידת הצורך. הימנע מהחטאת ערכי pH על ידי תוספת מושכלת של חומצה או בסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב פתרונות במיקסר הסוף-over-הסוף בטמפרטורת חדר (RT) במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז חלבון על ידי הוספת ארבעה כרכים של מתנול לפתרונות מצע בכל צינור חרוטי, מערבולת לערבב היטב, דגירה ב -20 ° C ל16-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות משקעים על ידי צנטריפוגה ב× גרם 13,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג בזהירות וזורקי supernatants ולאפשר מתנול להתאדות מהכדורים. השתמש בהחלה מכותנה שקצה כדי לסייע בקליטת מתנול נצמד לחלק הפנימי של הצינור. אל תאפשר כדורים ליותר מ-dry ופעם מתנול הוא כבר לא נראה לעין, להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי חלבון Resuspend במאגר המרה. השתמש בכמות של חיץ ההמרה שווה לכמות חומר התחלת homogenate המוח לוותר לתוך צינור אחד בשלב 2.2. הערה: זה קריטי, כי המאגר משמש להמרת resuspend כדורי חלבון משני pH 3.5 והכנות מצע שטופלו 7.4 הוא הפתרון המוגדר בשלב 1.2 לעיל (המכיל רמות נמוכות של חומרי ניקוי וpH פיסיולוגי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות בקצרה sonicate מצע בsonicator cuphorn (10 שניות ב ~ 30% כוח מרבי), aliquot לתוך 0.5-1.0 מיליליטר כרכים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge שכותרת. בצע immunoblot בקרת איכות (שלב 2.9) על aliquot של כל מצע. אחסן aliquots האחר ב -80 ° C עד מוכן לבצע assay CER (סעיף 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בקרת איכות על זוגות מצע CER לפני השימוש (איור 2). צעדים אלה להבטיח כי מצעי CER יהיו providתוצאות אופטימליות דואר בלימודי גיור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח כמויות דומות של PRP C בשני מצעים. להשוות רמות PRP ב10-25 μl של כל מצע על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17. אם רמות החלבון בpH 7.4 ו -3.5 מצעים נמצאים ב~ 10% של כל אחד אחר, זוגות המצע מתאימים לשימוש במחקרי CER. הערה: immunoblots PRP לא צריך להראות ראיות של השפלה PRP C הנרחבת. Immunoreactivity PRP צריך להיות בעיקר&gt; 20 kDa. להקות פחות ממסה מולקולרית זה יכול להיות מוצרים פגומים. דפוסי פסים צריכים להיות שווי ערך פחות או יותר בין זוגות מצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כC PRP בשני מצעים צריך להיות PK רגיש, טיפול 10-25 μl של כל מצע עם PK בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ולעכל דגימות ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר. להעריך כל אות PRP שנותר על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17.מצעים עם מיל PRP אינם מתאימים לשימוש במחקרי CER. </li></ol></li></ol> 3. להכין זרעי TSE סוכן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמת מוח נגוע TSE ממינים של ריבית ולהכין 10% (w / v) homogenate ב1x PBS pH 7.4 באמצעות השיטות מפורטות בשלב 2.1 לעיל. הערה: זרעים גם יכולים להיות מיוצרים מרקמות נגועים TSE אחרות מחוץ למערכת העצבים המרכזית, לעומת זאת, יעילות ההמרה של מצעי המוח מפיק זרעים נגזרים מרקמות היקפי נגועים TSE טרם הוערכה באופן ניסיוני בספרות שפורסמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot וכתוצאה מכך homogenate (ים) לתוך 100-300 כרכי μl בצינורות 0.5 מיליליטר microcentrifuge וחנות ב -80 ° C עד מוכן לבצע את assay CER. </li></ol> Assay 4. CER הערה: assay CER כרוך תוספת של כמות קטנה יחסית של PRP TSE (הניתנת ב&quot; הזרע &quot;) ממין אחדלעודף יחסי של PRP C (הניתן במוח נגוע &quot;המצע&quot;) ממין אחר שכבר מפוגל באופן חלקי בשני pH 3.5 או 7.4. בעקבות תקופת דגירה ממושכת רועדת, המרה מונעת תבנית של PRP C על ידי PRP TSE בכל תגובה מוערכת על ידי אות densitometric של PRP מיל שנותר לאחר עיכול PK וזיהוי immunoblot. השוואת רמות מיל PRP במצעים המפוגלים בעבר ב- pH 3.5 לעומת 7.4 מספקת מדד של מחסום המינים. סקירה ניסיונית של הליך assay זה מסופקת באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להפשיר זוגות מצע CER נגוע (assay דורש כמויות שווה של מצעים המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4) ופתרונות זרע TSE נגועים על ידי הצבת אותם על גבי מצע של קרח (כ זמן הפשרה 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהפשיר באופן מלא, ולאחר מכן לשאוב לגרש כל פתרון מצע דרך27 כמה פעמים מחט מזרק G מחדש homogenize זה. בקצרה sonicate כל פתרון זרע נגוע TSE במשך 10 שניות ב ~ 30% כוח מקסימאלי. שמור את כל הפתרונות על קרח בעת הכנת תגובות המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית 5 צינורות בודדים נמוכים מחייב, דק דופן PCR לסוכן TSE נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תגובות גיור בצינורות אלה על ידי הוספת 5 μl של 10% פתרון זרע TSE נגוע עד 95 μl של (א) מצע CER מוכן בpH 7.4 ו- (ב) מצע CER מוכן ב- pH 3.5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימת ניסוי, להכין תגובות מקבילות בזוגות מצע CER המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל יחסים של זרע סוכן TSE למצע מוח נגוע באמצעות קביעה אמפירית. Common זרעים: יחסי מצע המועסקים לשמור על סך נפח תגובה של 100 μl וכוללים 1:99 μl, 2:98 μl ו5:95 μl. עבור מרבית היישומים, זרע 5:95 μl: יחס מצע הנפח מתאים והוא מה שמוצג בההוא פרוטוקול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלוש דגימות בקרה לסוכן TSE נבדקות באופן הבא: (א) להוסיף 5 μl של 10% פתרון זרע TSE הנגוע לחיץ המרה 95 μl כביקורת למיל PRP קלט; להוסיף למאגר המרה 5 μl 95 מצע μl מוכן בpH (ב) 3.5 pH ו( ג) 7.4 כפקדים לגיור שאינו ספציפי, שאינה בתבניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת מדגם זה בצינור PCR הסגור שלה כדי לערבב זרע ומצע היטב. פעל עם דופק רגעי במיני-צנטריפוגה גבי ספסל במהירות נמוכה כדי להסיר כל נפח של תערובת התגובה לכודה במכסה צינור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טען בצינורות PCR בנפרד כותרת לתרם-אכר העליון ספסל מצויד לקבל צינורות PCR. Shake דגימות ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טלטול, להוסיף sarkosyl לריכוז סופי של 2% (w / v) וPK לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. דגימות Digest ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר. NOTE: תוספת של sarkosyl לדגימות עזרים שלאחר המרה בעיכול PK של PRP C. אותות חיוביים כוזבים בדגימות unseeded (שלב 4.5) בוטלו כמעט על ידי תוספת של sarkosyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מדגם SDS-PAGE, דגימות חום עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולפתור מיל PRP שנותר בכל דגימה על ידי SDS-PAGE 16 ואחרי 17 immunoblotting. הערה: לאחר תוספת של חיץ מדגם וחימום, דגימות עשויה להיות מעובד או ניתן לאחסן דגימות ב -20 ° C או -80 ° C לפני immunoblotting מייד. כל הנתונים שהוצגו כאן היו שנוצרו באמצעות מערכות ג&#39;ל והעברת Novex NuPAGE. דוגמאות בודדות מassay CER טופלו במאגר מדגם וצמצום סוכן על פי הוראות יצרן. דגימות היו מחוממות לאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -30 μl של כל דגימה היה עמוסה לג&#39;לי טרומי bis-טריס 12%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את יחס יעילות המרה (CER) כאמצעישל מחסום מינים. רמות מדד מיל PRP על ידי צפיפות 17 ולחלק את הצפיפות הכוללת של מדגם pH 7.4 ידי שמדגם 3.5 pH. להכפיל ב -100 לייצר אחוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים ממשכפל ניסיוני עצמאי כדי ליצור CER סטיית תקן ממוצע ± למינים עם סוכן TSE נתון. </li></ol>

<ol><li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).</li>
<li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+strains+and+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li>
<li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li>
<li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li>
<li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li>
<li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li>
<li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722(2014).</li>
<li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32(2008).</li>
<li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li>
<li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms%3A+a+model+for+the+scrapie+species+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li>
<li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans%2C+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li>
<li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li>
<li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li>
<li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li>
<li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+%28Ovis+canadensis%29+to+transmissible+spongiform+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157(2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2014).</li>
<li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li>
<li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li>
<li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li>
<li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li>
<li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quaking-induced+conversion%3A+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li>
<li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753(2014).</li>
<li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li>
<li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li>
<li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623(2012).</li>
<li>Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לסיום מוצלח של פרוטוקול זה, יש לשים לב לרמות PRP C ברקמות מוח נגוע משמשות להכנת מצע (שלב 2.1.2) והזרע למצע יחס לתגובות המרה (שלב 4.4.2). מניסיוננו, ניתן לחלץ את המוח לשימוש כמצע CER לאחר נתיחה שלאחר מות תקופה משמעותית, כל עוד PRP C נמצא על ידי immunoblotting (איור 4). למעשה, כמה autolysis נצפה במוחם של חתולי הבר המשמשים למחקרי CER. אף על פי כן, דגירה של מצעים נגזרים מהמוחין האלה עדיין הביאה להיווצרות של מיל PRP. אנו משערים כי, בחלק...

&quot;ספגות מוח מדבק (TSEs, מחלות פריון) הוא קבוצה של מחלות ניווניות קטלניות עם תקופות דגירה ממושכות המשפיעות על מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם. סוכן etiological המשוער של TSEs מורכב מהאיזומר misfolded של חלבון פריון מארח (PRP), כי הוא מסוגל התפשטות עצמית על ידי המרה מונעת תבנית של הטופס הסלולרי הרגיל של PRP (PRP C) ל, הקשורים למחלות זיהומיות טופס (PRP TSE) המצטבר ברקמות מערכת עצבים מרכזיות של המארח הנגוע 1. פריונים יונקים זיהומיות בדרך כלל להעביר ממארח ​​למארח באופן מינים ספציפיים, דבר שהוביל לרעיון של &quot;מחסום מיני TSE&quot; הגבלת אירועי שידור interspecies 2. הגורמים הביולוגיים של מחסום מיני פריון אינם מובנה היטב. דמיון רצף חומצות האמיניות בין PRP TSE זיהומיות והמארח ג PRP Cמאוד משפיע אם הגיור מתקיים 3-5, אבל נשאר מספיק כדי להסביר את כל אירועי שידור הפריון נצפו in vivo 6,7. לפיכך, אפיון חסמי מיני TSE הסתמך במידה רבה על מחקרים בבעלי החיים אתגר: חשיפת בעלי חיים תמימים ממין נתון לפריונים מאחרים ומדידת זמן דגירה וכתוצאה מכך להתפרצות מחלה ושיעור התקפת כאינדיקטורים של יעילות העברת. עכברים להביע PRP C ממיני Heterologous משמשים גם לסוג זה של מחקר 8. העלויות כרוכות בייצור מהונדס עכבר וbioassays פריון הממושך, כמו גם שיקולים אתיים של שימוש בבעלי חיים, הם מכשולים בדרך לחקירה ניסויית של מחסומי מיני TSE. הערכה של מכשול המין האנושי לTSEs מסתמכת על עכברים שהונדסו אדם PRP C. עכברים אלה דורשים תקופות דגירה ארוכות להיכנע לTSEs או שינויים כדי לא אנושייםהוא מולקולת PRP C בבני אדם למחלה מהירה תחילת 9. תקופות דגירה לTSEs לא אנושי בעכברים אלה עשויות להאריך את תוחלת החיים מעבר לעכבר הרגיל עושה פרשנות של תוצאות שליליות מאתגרות. פרימטים שאינם בני אדם יש גם שימשו כשליחים ללימוד מחסומי מין אנושיים, אך מחקרים אלה הם טומנים בחובה אותם האתגרים כמו סוגים אחרים של ניסויים בבעלי חיים וקופים שאינם בני אדם עשוי שלא בדיוק לשחזר מחלה כפי שהוא ממשיך במארח האנושי. bioassays בעלי החיים יישאר בשיטה &quot;תקן זהב&quot; למדידת הרגישות של מינים לTSE, אבל המכשולים, העלויות והאתיקה של מחקרים בבעלי החיים חיים אלה אילצו את חקירת חלופות. מספר מבחני במבחנה, המבוססים על הערכת ההמרה של מארח PRP C לproteinase K (PK) מדינת -resistant (מיל PRP) כאשר שנזרעו על ידי PRP TSE, פותחו ושימוש כדי לחקור sp TSEמחסומי ecies 10-12. דוגמאות למבחנים במבחנה כוללות מבחני תא ללא המרה, חלבון misfolding הגברה מחזורית (PMCA), ויחס יעילות המרת assay (CER) 10-14. למרות שאף אחד ממבחנים אלה לקחת בחשבון גורמים היקפיים המעורבים במחסומי מינים לאחר הדבקה טבעית, כולם יכולים להיות שימושיים כדי לזהות מארחים פוטנציאליים רגישים לTSEs. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור assay CER, שבו שני מצעי PRP C מפוגלים נגזרים מhomogenates המוח הנורמלית משמשים בתגובות המרת פריון העליונה ספסל (איור 1) 13. PRP C במצע המפוגל ב- pH 7.4 ניתן להמיר רק למיל PRP ידי PRP TSE זורעים לתוך התגובה בהיעדר מחסום מינים 14. בניגוד לכך, denaturation של PRP C במצע האחר ב- pH 3.5 מאפשר לה להיות מומר לדגירה הבאה מיל PRPעם PRP TSE מכל מינים ומשמש כביקורת לגיור. יחס ההמרה של PRP C למיל PRP בpH 7.4 ביחס מצע לזה של מצע 3.5 pH מספק מדד של מחסום המינים. מצאנו כי assay CER מנבא ידוע מחסומי מינים של עכברי מעבדה לTSEs השונים והשתמש assay במאמצים כדי לחזות את מחסום המינים של מינים רבים של יונקים, כוללים איל בר, למחלה כרונית לבזבז (CWD) וTSEs האחר 14, 15. חוקרים מעוניינים בכלי המאפשר סינון מהיר של מחסומים או הערכה של המרת PRP C מיל -כדי-PRP מיני TSE ימצא מתודולוגיה זו שימושית.

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGE ג'לים</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"מ חרוזי תחמוצת זירקוניום</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>זנים אחרים של חרוזים יעילים גם</td></tr> הם <tr><td>נוגדנים</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>בחר נוגדנים ראשוניים ומשניים מתאימים לזיהוי אימונובלוט של PrPres ממינים מעניינים</td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td> <td>חרוזיםNext Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>369434</td><td>מהירות גבוהה עם בקרת טמפרטורה</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מוליך עם קצה כותנה</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn סוניקטור</td><td>מערכות חום-אולטרסאונד</td><td>W-380</td><td>מערכות חום-אולטרסאוניקס, בע"מ הוא כעת Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometry תוכנת</td><td>תוכנה UVP</td><td>Vision Works LS Image Acquisition and Analysis תוכנה</td><td>תוכניות אחרות, כגון NIH ImageJ, יעבדו גם</td></tr><tr><td>הומוגנייזר Dounce</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>End-over-end</td><td>mixer Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetra חומצה אצטית</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>כימיקל מסוכן: גירוי</td></tr> <tr><td>בעינייםגואנידין הידרוכלוריד, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>כימיקל מסוכן: רעילות חריפה, גירוי בעור, גירוי בעיניים</td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>כימיקל מסוכן: חומצה חזקה</td></tr><tr><td>מאגר דגימת ליתיום דודציל סולפט, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>כימיקלים מסוכנים: עור & גירוי בדרכי הנשימה, נזק חמור לעיניים, מתנול מוצק דליק</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A454-4</td><td>כימיקל מסוכן: רעילות חריפה, נוזל דליק</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L-5125</td><td>כימיקל מסוכן: רעילות חריפה, גירוי בעור, נזק לעיניים</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>כימיקל מסוכן: גירוי בעור, נזק לעיניים</td></tr><tr><td>מערכת ג'ל SDS-PAGE</td><td>מערכת אלקטרופורזה NuPAGE Life</td><td>Technologies</td><td>מערכות SDS-PAGE אחרות יעבדו גם</td></tr><tr><td>צינורות PCR (כריכה נמוכה)</td> <td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td> <td>לעליקיםפישר סיינטיפיק</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת פוליוויניל דיפלואוריד</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>כימיקל מסוכן: גירוי בעור ובעיניים, רגישות נשימתית, רעילות איברים</td></tr><tr><td>חומר מפחית לדגימות SDS-PAGE, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>D6750</td><td>כימיקל מסוכן: רעילות חריפה</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>כימיקל מסוכן: רעילות חריפה, גירוי בעור, נזק לעיניים, מוצק דליק</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>כימיקל מסוכן;</td></tr><tr><td>מזרק</td> בסיס חזק <td>BD Biosciences</td><td>שונים</td><td>השתמש בגודל מזרק המתאים לנפחי המצע להומוגניזציה</td></tr><tr><td>מחטי מזרק</td><td>BD Biosciences</td><td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (שייקר צינור PCR)</td> <td>האנגג'ואו כל מכשירי שנג</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>כימיקל מסוכן: עור, עיניים, גירוי בדרכי הנשימה</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>כימיקל מסוכן: רעילות חריפה, גירוי</td></tr> <tr>בעיניים<td>וורטקסר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; assay המרת חלבון הפריון

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

מחקרים להבנת העברה בין מינים של אנצפלופתיות ספוגיות מועברות (TSEs, מחלות פריון) הם מאתגרים בכך שהם מסתמכים בדרך כלל על מחקרי אתגר ארוכים ויקרים בבעלי חיים. מספר בדיקות מבחנה פותחו כדי לסייע במדידת מחסומים של מיני פריונים, ובכך להפחית את השימוש בבעלי חיים ולספק תוצאות מהירות יותר מאשר בדיקות ביולוגיות של בעלי חיים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לבדיקת המרת פריון מהירה במבחנה הנקראת מבחן יחס יעילות המרה (CER). בבדיקה זו, חלבון פריון תאי (PrPC) ממוח מארח לא נגוע עובר דנטורציה הן ב-pH 7.4 והן ב-3.5 כדי לייצר שני סובסטרטים. כאשר סובסטרט pH 7.4 מודגר עם חומר TSE, כמות ה-PrPC שהופכת למצב עמיד לפרוטאינאז K (PK) מווסתת על ידי מחסום המין של המארח המקורי לסוכן TSE. לעומת זאת, PrPC במצע pH 3.5 מקופל בצורה שגויה על ידי כל חומר TSE. על ידי השוואת כמות חלבון הפריון העמיד ל-PK בשני המצעים, ניתן לבצע הערכה של מחסום המין של המארח. אנו מראים כי בדיקת ה-CER חוזה נכון את המחסומים הידועים של מיני פריונים של עכברי מעבדה, וכדוגמה, מראים כמה תוצאות ראשוניות המצביעות על כך שבובקטים (Lynx rufus) עשויים להיות רגישים לגורם מחלת בזבוז כרוני של צבי לבן זנב (Odocoileus virginianus).

שימוש מוצלח של assay CER תלוי במידה רבה על האיכות של זוגות המצע המשמשים בתגובות המרה. מסיבה זו, בעקבות הליכים להכין זוגות מצע CER, immunoblot בקרת איכות צריכה להתבצע (איור 2). עבור שני מצעים, assay 10-25 μl על ידי immunoblotting. PRP C צריך להיות בקלות לזיהוי בכל מצע ורמות PRP C חייבת להיות בערך באותו בין שתיים. Immunoreactivity יהיה בעיקר נראה מעל 20 kDa, אבל להקות קטנות יותר יכולות להיות גם ברורות. מניסיוננו, הנוכחות של להקות קטנות יותר היא...

מדידת המחסום להעברה בין מינים של מחלות פריונים היא מאתגרת וכוללת בדרך כלל אתגרים של בעלי חיים או בדיקות ביוכימיות. כאן, אנו מציגים מבחן המרת חלבון פריון במבחנה עם יכולת לחזות מחסומי מינים.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המרת חלבון הפריון

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את מחסום המינים של אנימליות ספוגיות העוברות, המכונה TSC, עבור מין נתון, ללא צורך בחשיפת בעלי חיים חיים. זאת מושגים תחילה על ידי הכנת שני substrates לבדיקת המרה לשימוש בבדיקה in vitro. השלב השני הוא דגירה של substrates אלו עם סוכני ה-TSE שברצונכם לבחון.לאחר עיכול באמצעות Protase K, הדגימות עוברות SDS page ו-immunoblotting. השלב הסופי הוא מדידת כמות חלבון ה-PreOn העמיד ל-proteinase K בכל תסביך באמצעות D cytometry והשוואת כמויות אלו על ידי חישוב יחס יעילות המרה או CER. בסופו של דבר, ה-CER מספק מדד למחסום המינים עבור ה-TSE שנבדק ביחס למין המארח ממנו הוכן התסביך.יתרונותיה של בדיקה זו כוללים עלות נמוכה, מסגרת זמן ניסויית קצרה והחלפת בעלי חיים חיים בדגימות רקמה. אף ששיטה זו מתאימה מאוד למתן תובנות לגבי מחסומי מינים במקרה של מחלות פריון בבעלי חיים ברים, ניתן ליישמה בכל מין אחר שמעניין את החוקר. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים בהכנת התשתית (substrate), בבקרת איכות ובסטנדרטיזציה.לאחר השגת רקמת מוח בריאה שאינה נגועה מהמין הרלוונטי, הכין הומוגנאט בריכוז 10% משקל לנפח בבפר לזיס (lysis buffer) באמצעות טחנת כדורים או מכתש ועלי. לאחר ההומוגניזציה, זקק את ההומוגנאטים על ידי מעבר דרך מזרק ומחט, תוך שימוש במחטים בעובי (gauge) הולך וקטן, עד שהתסביס ניתן לשאיבה ולהזרקה בקלות דרך מחט של מזרק במידה 27.כעת, בדקו את ערכי ה-pH של תמיסות הסובסטרט והשתמשו בחומצה כלורית רכזית או בנתרן הידרוקסיד לפי הצורך כדי להבטיח שערך ה-pH של כל סובסטרט יישאר בטווח של פלוס או מינוס 0.05 מה-pH המטרה. סובבו את התמיסות במערבל end over end בטמפרטורת החדר למשך חמש שעות. לאחר מכן, השקיפו את החלבון על ידי הוספת ארבעה נפחים של מתנול לתמיסות הסובסטרט בכל vortex קוני כדי לערבב היטב, והדגירו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות.לאחר הדגירה, שקיעו את הדגימות באמצעות סנטריפוגה ב-13,000 G למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו בזהירות והשליכו את העל-משקעים (supernatants) והמתינו להתאיידות המתנול מהמשקעים. השתמשו במקלונים עם טיפת צמר כדי לסייע בספיגת מתנול שנדבק לדפנות הפנימיות של המבחנה.אין לאפשר לכריות המשקע להתייבש יתר על המידה. עברו לשלב הבא כאשר המטנול אינו נראה יותר; השתמשו בכמות של בופר המרה השווה לכמות חומר המוצא של הומוגנאט המוח כדי לסבסב מחדש את כריות החלבון. לאחר הסבסוב, בצעו סוניקציה קצרה לתמיסאות התשתית למשך 10 שניות.בצע סוניקציה בכלי קיבול (cup horn) בעוצמה של כ-30% מהעוצמה המקסימלית. לאחר מכן, חלק את התמיסות לאליקוואטים של 0.5 עד 1 ml בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה מסומנות בנפח 1.5 ml, מאחר שחלבון פריון תאי בשני התסובים אמור להיות רגיש ל-proteinase K. טפל ב-10 עד 25 µL מכל תסוב באמצעות proteinase K בריכוז סופי של 100 µg/mL, ועשה עיכול לדגימות במהירות של 1000 RPM בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת בשייקר תרמי (thermo shaker). העמס את התסובים שעברו עיכול ב-proteinase K, יחד עם 10 עד 25 µL מכל תסוב שלא עבר עיכול.בצעו ריצה על ג'ל SDS-PAGE, חסימה אימונולוגית (immuno block) עם נוגדן ספציפי לחלבון פריון כדי להעריך את חלבון הפריון של המארח, את העמידות ל-proteinase K ואת רמות החלבון שלא עבר עיכול. תמונה זו מציגה את תוצאות ה-immuno blot. שני הנתיבים הראשונים מכילים את התסמיכים שלא עברו עיכול, ושני הנתיבים מימין מכילים את התסמיך שעבר עיכול באמצעות proteinase K.אם רמות החלבון בתשמיות ב-pH 7.4 וב-pH 3.5 נחוצות בטווח של כ-10% זו מזו ואינן עמידות ל-proteinase K, זוגות התשמיות מתאימים לשימוש במחקרי CER. יש לאחסן מנות אחרות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לביצוע בדיקת ה-CER. יש לטפל בסוכני TSE תוך נקיטת אמצעי בטיחות ביולוגית מתאימים ובהתאם להנחיות המוסדיות. לאחר השגת רקמת מוח מזוהמת ב-TSE מהמין הרלוונטי, יש להכין הומוגנאט של 10% משקל לנפח ב-1X PBS ב-pH 7.4, תוך שימוש בשיטת ההומוגניזציה ששימשה קודם לכן להכנת זוגות התשמיות.העבירו את ההומוגנאטים שהתקבלו לנפחים של 100 עד 300 µL בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 mL ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C עד לביצוע בדיקת ה-CER. כדי להתחיל, הפשיתו באיטיות כמויות שוות של תמיסות זריעה (seed solutions) של substrat CER שאינו נגוע ב-pH 3.5 ו-7.4, ושל תמיסות זריעה נגועות ב-Prions וב-TSE, על ידי הנחתן על קרח למשך כשעה. לאחר ההפשרה, שמרו את התמיסות על קרח ובצעו הומוגניזציה חוזרת על ידי שאיבה והזרקה של כל תמיסת substrate דרך מחט של מזרק בכילוג 27.לאחר מכן, בצעו סוניקציה קצרה לכל תמיסה מזוהמת ב-TSE למשך 10 שניות, בהספק של כ-30% מההספק המקסימלי. לאחר מכן, הכינו תגובות המרה במבחנות PCR בעלות דופן דקה ובקישור נמוך עם סימון, על ידי הpipette של 95 µl של סובסטרט CER. הכינו ב duplicate (כפול) לשתי מהמבחנות סובסטרט CER שהוכן ב-pH 7.4, ו-95 µl של סובסטרט CER שהוכן ב-pH 3.5 ב-duplicate לשתי מבחנות נוספות.לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של תמיסת זרעים מזוהמים ב-10%TSE למבחנה אחת מכל אחת מהתתי-מצעים ב-pH 7.4 ו-3.5. במקביל, הוסיפו 5 µL של באפר המרה למבחנה השנייה של כל אחת מהתתי-מצעים ב-pH 7.4 ו-3.5, כדי לשמש כביקורת להמרה לא ספציפית שאינה מתווכת תבנית. כמו כן, הכינו ביקורת לחלבון פריון עמיד ל-proteinase K כחלבון קלט.עבור כל סוכן TSE הנבדק, הוסף 5 µL של תמיסת זריעה מזוהמת ב-TSE בריכוז 10% ל-95 µL של תמיסת המרה (conversion buffer) כביקורת. ערבב קצרות באמצעות וורטקס (vortex) כל דגימה בתוך מבחורת ה-PCR הסגורה, כדי להומיס את התססית (substrate). לאחר מכן, בצע סבב קצר במ centri-fuge שולחני קטן במהירות נמוכה כדי להסיר כל שארית של תערובת התגובה שנדבקה למכסה מבחורת ה-PCR.העבירו את המבחנות למכשיר thermo shaker שולחני המותאם למבחנות PCR וערבבו את הדגימות ב-1000 RPM בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. למחרת, הוסיפו sarco cell לריכוז סופי של 2% w/v ו-proteinase K לריכוז סופי של 100 µg/mL. עסקו את הדגימות ב-1000 RPM בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה ב-Thermo shaker. הוסיפו תמיסת דגימה ל-SDS page, חממו את הדגימות ל-95 °C למשך 10 דקות, והפרידו את חלבון ה-PreOn שנותר, העמיד ל-pronase K, בכל דגימה באמצעות SDS page, ולאחר מכן בצעו immuno blotting כפי שנעשה קודם לכן. לבסוף, חשבו את יחס יעילות ההמרה כמדד למחסום בין המינים (species barrier).בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב לעכבר, תסבך עבור בדיקת CER שהוכן ב-pH 7.4 או 3.5 הודגרה עם scrapy של עכבר המותאם ל-RML, scrapy קלאסי של כבש ביתי, מחלת הבזבוז הכרונית של צבי זנב-לבן, או זן 2 63 K של scrapy המותאם להמסטר. בבדיקת CER, דגימות הביקורת המסומנות כ-none הכילו כמות שווה של חומר זיהומי, ולא נותחו דגימות תסבך של עכבר לבדיקת נוכחות של חלבון פריון העמיד לפרוטאינז K באמצעות immuno blot עם הנוגדן המונוקלונלי SAF 83.ערכי tric גולמיים עבור כל דגימה מוצגים מתחת לכל נתיב של פרוטאינאזה. רמות חלבון פריון העמיד ל-K השתנו בין תתי-הקרקעות של העכברים, אשר הותמרו ב-pH 7.4 והוחדרו עם סוכני TSE השונים. בעוד שחלבון פריון העמיד לפרונאז K נמצא בכל תתי-הקרקעות שהותמרו ב-pH 3.5 והוחדרו עם סוכן TSE, גרף עמודות זה מציג את היחסיים הממוצעים פלוס או מינוס סטיית תקן בין תתי-הקרקעות של עכברים ב-pH 7.4 ו-3.5 עבור כל גורם זיהומי, בהתבסס על לפחות שלוש הרצות בדיקה עצמאיות.אותיות קטנות מציינות תתי-קבוצות הומוגניות מבחינה סטטיסטית, כפי שנקבע על פי ערך p קטן מ-0.05 באמצעות ניתוח שונות (analysis of variance), באמצעות שיטת Tukey-Kramer להבדלי מובהקות מינימליים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בפחות מ-48 שעות אם היא מבוצעת כהלכה. ניתן להשתמש בבדיקת ה-CER כהערכה ראשונית לקיומה של מחסום-מינים של TSE, שעשוי להצדיק או לשלול את הצורך במחקרים נוספים בבעלי חיים חיים.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הכנת תשתיות (substrates), ביצוע תגובות המרה וחישוב יחסי יעילות המרה להערכת מחסומי מינים.

assessing-transmissible-spongiform-encephalopathy-species-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו מתארים assay הרומן לניטור ספיגת הפריון וסחר על ידי תאים חיסוניים מיד לאחר חיסון intraperitoneal ידי מטהרים fluorescently תיוג מוטות הפריון מצטבר חומר במוח נגועים אז ניטור ספיגת שלהם תנועה מאתר ההזרקה ואפיון התאים לתווך את האירועים הללו.

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

ההגברה מחזורית misfolding חלבון (PMCA) היא assay במבחנה לחקר גיור פריון ומחסומי מתח ומינים. זה גם יכול לשמש כבדיקת גילוי פריונים.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

לדגור עם אנזים פרוטאוליטי כדי לעכל את הפריונים הרגילים, ולהשאיר את האגרגטים העמידים שלמים.

זיהוי צברי חלבון פריון מקופלים שלא כהלכה ברקמת מוח עכבר באמצעות כתם מערבי

יש אוכלי נבלות פוטנציאל translocate פריונים ספגו מוח העברה זיהומיות בצואה שלהם לאזורים ללא מחלה. שלנו שיטות פירוט משמשות כדי לקבוע אם פריונים מרוסקים מותאמים עכבר יישארו זיהומיות לאחר מעבר למרות שמערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus), הצריכה נפוצה של בעלי חיים מתים.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

תיוג חיסוני של חלבון פריון חריג באמצעות פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיים דורש דגימה ספציפית ומתודולוגיות להכנת נוגדנים נגד PrP. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים העיקריים בהסרת אפיטופים כדי להבטיח תיוג חיסוני תקין של PrP ולמזער כתמי רקע לא ספציפיים. כמו כן, גישה זו לוקחת בחשבון אמצעי בטיחות ביולוגית בעת ביצוע מחקרים אימונוהיסטוכימיים עם רקמות נגועות פריון.

זיהוי של חלבון פריון חריג על ידי אימונוהיסטוכימיה

חסרה שיטה להערכת אזורים נפוצים במעבדות לזיהום פריונים וטיהור יעיל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק יסודות מרכזיים ליישום בדיקת בטיחות פריון מעבדה שניתן לשנות בקלות כדי לענות על הצרכים האישיים של מעבדות ספציפיות.

בדיקת החלקה של מעבדת בטיחות פריון

אנו מתארים מודל עכברים של הפרעת פוסט טראומטית (PTSD) החושפת את השינויים המתמשכים בתפקוד נוירואנדוקריניים ותגובה המאוחרת לטווח ארוך, המוגזמת פחד, אופייניים לחולי PTSD. מודל החיה ושיטות שתוארו כאן הם שימושיים עבור correlating סמנים ביולוגיים בגרעיני מוח, שהם מכאניים אך לא ניתן למדוד בחולים, עם סמנים ביולוגיים בתאי דם לבן בפריפריה, שיכול.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

חקור מחסומי מינים במחלות פריון באמצעות מבחן המרה במבחנה. שיטה זו מודדת יחס יעילות המרה ללא צורך בניסויים בבעלי חיים חיים.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם

גלה סרטונים נוספים