Name: Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: למד שתיקת גנים בזחלי יתושים באמצעות ננו-חלקיקי RNA מפריע מכיטוזן. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בנשאי מחלות ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון מתחנת הניסויים החקלאיים של קנזס והמרכז לגנומיקה של פרוקי רגליים K-State ל-KYZ תמך בפיתוח המקורי של השתקת גנים בתיווך צ'יטוזן/dsRNA ב-A. gambiae19. עבודת A. gambiae המתוארת כאן נתמכה בחלקה על ידי R01-AI095842 מ-NIH/NIAID ל-KM. פיתוח השתקת גנים בתיווך צ'יטוזן/siRNA ב-A. aegypti20,21 נתמך על ידי פרס NIH/NIAID R01-AI081795 ל-MDS. תוכן מחקר זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH.

1. מינים יתושים וגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על A. G3 gambiae וא &#39; זני aegypti ליברפול IB12 (המשמשים במחקרי הנציג להלן) או זנים אחרים של עניין על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 23,24. </li></ol> 2. dsRNA וsiRNA עיצוב והפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב לבניית תבניות dsRNA ארוכות ספציפיות לגן של עניין. השתמש בכלי E-RNAi 25. לייצר dsRNA לפי השיטה של בחירה או כפי שתואר לעיל 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, לסנתז dsRNA 19 מתאים לרצף של חלבון ירוק ניאון, β-galactosidase (β-gal) (GFP), או כמה גנים אחרים לא באו לידי ביטוי ביתושים. אם כך רצוי, dsRNA 19 מנוצלים כדי ליצור את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכולים לשמש כביקורת חיובית. חנות dsRNA מומס במי RNase ללא ב -80 °; C עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, siRNA גן ספציפי עיצוב על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 10. לטרוף את הרצף של siRNA מציאה לעצב siRNA שליטה השלילי שאינו מתאים לכל גן יתושים. לרכוש siRNAs המותאמת אישית, אשר זמינות באמצעות מספר ספקים בעלי מוניטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כך רצוי, siRNAs 20,21 המנוצל כדי להשיג את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכול לשמש כביקורת חיובית. חנות siRNA מומס במי RNAse חינם ב -80 ° C עד צורך. </li></ol></li></ol> 3. הכנת Chitosan / מפריעים RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתרן גופרתי שהוכן מראש, RT 100 מ&quot;מ (100 מ&quot;מ Na 2 SO 4 בH 2 O deionized) ו -0.1 M נתרן אצטט (0.1 מ &#39;NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M חומצה אצטית, pH 4.5 בH 2 O deionized) מאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר chitosan (≥75%deacetylated) ב 0.1 חיץ אצטט M נתרן לעשות 0.02% (w / v) פתרון עובד ולשמור על הפתרון בRT לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dsRNA או siRNA ב -50 μl deionized H 2 O ולהוסיף אותו למאגר נתרן גופרתי 100 מ&quot;מ לעשות פתרון 100 μl של 32 מיקרוגרם של dsRNA / siRNA לשל נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון chitosan לפתרון dsRNA / siRNA 100 μl ולאחר מכן לחמם את התערובת באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. הגדר את שליטה על ידי הוספה של נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ לפתרון chitosan 100 μl 100 μl ולפי אותו הנוהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרונות באופן מיידי למשך 30 שניות על ידי vortexing במהירות גבוהה ב RT כדי להקל על ההיווצרות של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT, לאחר שהזמן גלולה צריכה להיות גלויה. מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. אוויר יבש גלולה ל≈10 דקות ב RT לפני השימוש בו כדי להכין אוכל יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Measure הריכוז של dsRNA / siRNA בsupernatant באמצעות supernatant מהשליטה (ראה 3.5) כריק כדי לחשב את הסכום הכולל של dsRNA / siRNA שנותר בsupernatant. השתמש בהבדל בין כמויות התחלה של dsRNA / siRNA וסכומים שנותרו בsupernatants כדי לחשב את אחוז dsRNA / siRNA הממולכד בחלקיקים. יעילות טעינה זה היא בדרך כלל מעל 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך, אם יש צורך יותר חלקיקים. השתמש בחלקיקים היבשים באופן מיידי. ההשפעה של קירור של חלקיקים לפני השימוש לא נבדקה. </li></ol> 4. הכנת מזון המכיל Chitosan יתוש / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר של פתרון agarose 2% (w / v) במים ללא יונים, להמס את agarose, ולשמור על פתרון agarose נמס באמבט 55 מעלות צלסיוס מים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב פתיתי מזון לדגים (47% חלבון גולמי, דקות. שומן גולמי 10%, מקסימום. סיבים גולמיים 3%) ושמרים יבשים ביחס של 2: 1 (w / w). טוחנים את התערובת לחלקיקים קטנים עם מכתש ועלי (סביר דרך מס &#39;50 מסננת בדיקה סטנדרטית ארה&quot;ב). השתמש במזון הקרקע, שאמורה להיות חום בצבע, מייד או לאחסן אותו במכל אטום על 4 מעלות למשך מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.5 מיליליטר, לערבב 6 מ&quot;ג מזון קרקע עם חלקיקים המיובשים מסעיף 3.7 עם קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של פתרון agarose ג&#39;ל 2% מראש מומס לתערובת מזון-ננו-החלקיקים; מערבב מייד וביסודיות על ידי שימוש בקצה קיסם או pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בג&#39;ל המכיל מזון וחלקיקים כדי להאכיל את זחלי היתושים באופן מיידי. לחלופין, פעם ג&#39;ל הוא התגבש לגמרי בRT, לאחסן את הג&#39;ל על 4 ° C ולהשתמש ביום שלמחרת, או ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 5. האכלת זחלי יתוש עם מזון המכיל Chitosan / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים gambiae: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר siגלולה ngle ג&#39;ל מצינור 1.5 מיליליטר באמצעות קיסם ולחתוך אותו לפרוסות שווים 6 באמצעות סכין גילוח נקי או איסוף שן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 זחלי instar שלישיים לצלחת פטרי המכילה 500 מיליליטר של מים deionized 100 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי יתושים על ידי הוספת פרוסה אחת של גלולה ג&#39;ל (קצוצה דק לחתיכות קטנות יותר) לכל צלחת פטרי פעם ביום למשך ארבעה ימים. הקפדתי למלא האכלת זחלים על גלולה, שאמור להיות מופחת באופן משמעותי בגודל או נעדרת לחלוטין על ידי ביום שלמחרת. לאחר הזמן, יתושים יתפתחו זחלי instar רביעי מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט כל שינוי פנוטיפי גלוי במהלך הניסוי. בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בתום התקופה של ארבעה ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים aegypti: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גלולה ג&#39;ל ל6 פרוסות שווים באמצעות סכין גילוח נקי או קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 שעות 24 מסונכרנות גיל לאחר fi ביצת בקיעהזחלי instar הראשונים לצלחת פטרי ב≈40 מיליליטר מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי פרוסה אחת לכל צלחת פטרי במשך 4 שעות / יום, ולאחר מכן להעביר זחלים חזרה לתזונה הרגילה זחל של 2: פתיתי מזון 1 קרקע דגים ושמרים יבשים לשארית היום. חזור על הליך יומי לאורך ארבעת instars הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בנקודות הזמן התפתחותי הרצויות. </li></ol></li></ol> 6. אישור של ג&#39;ין מציאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות תמליל יחסית על ידי qRT-PCR בא aegypti וא &#39; זחלי gambiae. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ולנתח מבחני qRT-PCR עם שלושה משכפל ביולוגי על לפחות 10 שליטה במאגר לעומת זחלים ניסיוניים כפי שתואר 11,19,20, או על פי נוהל מעבדה סטנדרטי. תוצאות נציגים כלולות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של חלק סוג רקמה מסוים / גוף (כלומר., מוח או אנטנה), perform qRT-PCR, כמתואר ב6.1.1 לנתיחה הבאה כדי לשחזר את הרקמות של עניין (למשל, לראות Mysore et al. 21). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה על ידי הכלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז antisense שכותרת digoxygenin ולחוש על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר 26 riboprobes שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הכלאה באתר לפרוטוקול Haugen et al. 27 לאישור של מציאה כפי שתואר לעיל 11,20 ודנו בסעיף תוצאות הנציג להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה ידי אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נוגדנים כנגד מוצר החלבון של הגן הממוקד זמינים, לבצע אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר בעבר 28, המאפשר זיהוי של אנשים עם הרמות הגבוהים ביותר של מציאה לניתוח פנוטיפ 20 כפי שהודגם בrepresentative סעיף תוצאות בהמשך. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Malaria. , World Health Organization. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/topics/malaria/en">http://www.who.int/topics/malaria/en</a> (2014).</li>
<li>Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> (2014).</li>
<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li>
<li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li>
<li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects%3A+an+overview+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li>
<li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730(2011).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694(2011).</li>
<li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9(2013).</li>
<li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69(2013).</li>
<li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehydration+driven+RNAi%3A+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+entomology%22%5BJournal%5D)">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+physiology%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li>
<li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Entomol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fdouble-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+%28Anopheles+gambiae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li>
<li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+neglected+tropical+diseases%22%5BJournal%5D)">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215(2013).</li>
<li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9(2014).</li>
<li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids%3A+a+gutful+of+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+drug+targeting%22%5BJournal%5D)">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li>
<li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li>
<li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClemons%2C+A+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi%3A+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li>
<li>Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+NH+%22A+laboratory+guide+to+RNA%3A+Isolation%2C+Analysis%2C+and+Synthesis%22">A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis</a>. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugen%2C+M+%22Whole-mount+in+situ+hybridization+for+analysis+of+gene+expression+during+Aedes+aegypti+development%22">Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development</a>. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).</li>
<li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li>
<li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li>
<li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li>
<li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li>
<li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li>
<li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Chitosan / מתודולוגיה ננו-חלקיקי RNA התערבות המתוארות במסמך זה נעשתה שימוש כדי למקד ביעילות גנים במהלך התפתחות זחל בא gambiae (איורים 2, 3) וא &#39; aegypti (איורים 4, 5, 6, לוחות 1, 2). ניתן להכין חלקיקי Chitosan גם עם dsRNA הארוך או siRNA, אשר שניהם שימשו בהצלחה ביתושים כפי שמעידה תוצאות הנציג המתוארות במסמך זה. סינתזה של dsRNA היא זולה יותר מאשר רכישת siRNA, אבל הוא יותר עבודה אינטנסיבית. אם chitosan / siRNA משמש, ניתן לאשר פנ...

יתושי וקטור האכלת דם של genera Anopheline וAedine לשדר גורמי המחלות אחראים לכמה מהמכות הגרועות ביותר של המין האנושי. 3.4 מליארד אנשים מוערכים הם בסיכון להידבקות במלריה, שהוא אחראי למוות למעלה מחצי מ&#39;מדי שנה ברחבי העולם. תוצאות מלריה מזיהום על ידי sp Plasmodium. טפילים, אשר מועברים לאנשים דרך העקיצות של יתושים נגועים מסוג אנופלס, כוללים הווקטור העיקרי האפריקאי אנופלס gambiae <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">(http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti הוא וקטור היתושים העיקרי לוירוס דנגה, מה שגורם לקדחת דנגה, מחלה המלווה בחום ספציפי שהיא המחלה הנפוצה arboviral והמשמעותית ביותר בעולם. וירוס דנגה הוא כיום איום ל&gt; 2.5 מליארד בני אדם באזורים הטרופיים, עם inciden שנתיce של כ -50 מיליון מקרים וכתוצאה מכך ~ 24,000 מקרי מוות בשנה <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">(http://www.cdc.gov/dengue/,</a> 2014) 2. למרות ההשפעה הגלובלית ההרסנית של מחלות שמקורן יתושים על בריאות אדם, אמצעי יעיל למניעה וטיפול במחלות אלה חסרים. הדברת יתושים היא כיום השיטה הטובה ביותר למניעת מחלה. הפוטנציאל לשליטה במחלות שמקורן בפרוקים-רגליים על ידי המניפולציה הגנטית של חרקים וקטור הוכר במשך ארבעה עשורים 3. זנים מהונדסים של א &#39; aegypti שתוכנן להיות בפנוטיפ לעוף נשי ספציפי repressible עשה בתקופה האחרונה את הפוטנציאל לשימוש באסטרטגיות בקרת וקטור מהונדסים מציאות 4-6. התקדמות אלה אתגרה חוקרים לזהות מטרות גנטיות חדשניות לבקרת וקטור ואמצעים נוספים של המניפולציה תפקוד גן ביתושי וקטור. שינוי של d ביטוי גניםפיתוח uring, כפי שהיה במקרה ביתושי נקבה-לעוף 4, עשוי לקדם את ההבהרה של אסטרטגיות בקרת וקטור רומן. עם זאת, במידה רבה בשל אתגרים טכניים, הפונקציות של מעט מאוד גנים מתאפיינות בפיתוח של א &#39; gambiae, א aegypti, או מיני יתושים אחרים. מאז גילויו בג 7 elegans, התערבות RNA (RNAi), שנשמרת בבעלי חיים, צמחים, ומיקרואורגניזמים, כבר בשימוש נרחב למחקרים גנטיים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, כולל חרקים 8,9. מסלול RNAi הוא ביוזמת דייסר, שדבק dsRNA הארוך לתוך siRNAs ארוך נוקלאוטיד 20-25 קצר המתפקדים כRNA להתערב רצף ספציפי. גני שתיקה siRNAs כי הם משלימים ברצף על ידי קידום מחזור תמליל, מחשוף, ושיבוש התרגום 9. מולקולות ארוכות dsRNA (בדרך כלל 300-600 נקודות בסיס) או siRNAs מיקוד המותאם אישית particulaרצף r ניתן להשתמש במעבדת המחקר להשתקה כל גן של עניין. על ידי ניהול כאשר מפריע מועבר RNA, חוקרים יכולים לקבוע את הזמן שבו גן השתקה יוזמת. יתרון זה הוא שימושי כפי שהוא יכול להשתמש בו כדי להתגבר על אתגרים כגון קטלני או עקרות התפתחותית, אשר יכול לעכב את הייצור ותחזוקה של זני נושאות מוטציות תורשתיות, תהליך יקר ועתירת עבודה שאינו זמין עדיין בכל מיני החרקים. למרות התואר של השתקת גנים על ידי RNAi יכול להשתנות מגן לגן, רקמה לרקמה, ובעלי חי בעלי חיים, RNAi הוא בשימוש נרחב לניתוח פונקציונלי של גנים ביתושים וחרקים אחרים 8,9. שלוש אסטרטגיות משלוח RNA להתערב כבר בשימוש ביתושים: microinjection, יישום שריה / אקטואלי, ובליעה. להיסטוריה והשוואה של השימוש בשלוש הטכניקות הללו בחרקים מפורטים, עיין באל יו et 8. Wדואר השתמש בהצלחה microinjection 10 כאמצעי לאספקת siRNAs למקד גני התפתחותיים בא עוברי aegypti, זחלים, גלמים ו11-14. עם זאת, אסטרטגית משלוח עתירת עבודה זו דורשת גם התקנת microinjection ומיומנת יד. יתר על כן, microinjection מלחיץ את האורגניזם, גורם מבלבל, במיוחד כאשר פנוטיפים התנהגותיים יוערכו. לבסוף, משלוח microinjection לא ניתן להרחיב לתחום עבור בקרת וקטור. כחלופה, שריה האורגניזם להתערב פתרון RNA הפכה גם אמצעי פופולרי של גרימת השתקת גנים, כפי שהוא נוח ודורש ציוד או עבודה קטן. שריה יש בעיקר יושמה בשורת תאי חרקים לומד 8, אך במחקר שנערך לאחרונה, מציאה הושגה בא זחלי aegypti שקועים בפתרון של 15 dsRNA, שבעלי החיים הופיעו לבליעה. עם זאת, למחקרים שכלל ניתוח של experimenta מרובהקבוצות l או פנוטיפים, שריה היא די יקרה. לופז-מרטינז et al. 16 תיארו להחזרת נוזלים מונעים RNAi, גישה חדשנית להתערבות משלוח RNA שכרוכה התייבשות בתמיסת מלח והחזרת נוזלים עם טיפה אחת של מים המכילים RNA להתערב. גישה זו אין לחתוך את העלויות כרוכות בטבילת בעלי חיים שלמה, אבל הוא יקר יותר מאשר microinjection ועשויה להיות מוגבלת בבקשתו למינים שיכולים לסבול לחצים האוסמוטי גבוהים. יתר על כן, קשה לדמיין איך טבילה או מתודולוגיה טבילה / התייבשות התייבשות יכולה להיות מותאמת לבקרת וקטור בתחום. מסיבות אלה, ללימודי פוסט-עובריים, לידה בהתערבות RNA עם אוכל לבלוע היא אסטרטגיה חלופית בת קיימא. למרות שאסטרטגיות מבוססות בליעה לא עובדות בכל מיני החרקים, אולי בעיקר melanogaster דרוזופילה, משלוח אוראלי של התערבות RNA מעורבב עם מזון קידם si הגןlencing במגוון רחב של חרקים 8,17 א כולל, מבוגרים aegypti 18. שתארנו RNAi בתיווך ננו-חלקיקי chitosan בא זחלי gambiae 19 ויישם גישה זו של הפחתה של ביטוי גנים בא בהצלחה זחלי aegypti 20,21. כאן, מתודולוגיה להליך RNAi זה, הכולל כולא בהתערבות RNA על ידי chitosan הפולימר, היא מפורטת. Chitosan / חלקיקי RNA להתערב נוצרים על ידי הרכבה עצמית של polycations עם התערבות RNA באמצעות הכוחות אלקטרוסטטיים בין מטענים החיוביים של קבוצות אמינו בchitosan ומטענים שליליים המבוצעים על ידי קבוצות פוספט בעמוד השדרה של התערבות RNA 19. ההליך המתואר תואם עם שתי מולקולות ארוכות dsRNA (להלן כפי dsRNA) או גדילים כפולים siRNA (להלן כפי siRNA). סינתזה, chitosan / חלקיקי RNA להתערב הבאים מעורבבים עם מזון זחל ונמסרו לזחלים באמצעות בליעה דרך הפה. מתודולוגיה זו היא זולה יחסית, דורשת ציוד ועבודה 19 קטנים, ומאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של פנוטיפים מרובים, כוללים ניתוח של התנהגויות 20,21. מתודולוגיה זו, אשר יכולה להיות מותאמת ללימודי השתקת גנים בחרקים אחרים, כוללים וקטורי מחלה אחרים ומזיקים בחקלאות חרקים, העלול לשמש להשתקת גנים במגוון רחב של בעלי חיים אחרים. יתר על כן, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה 22, עלול להיות מנוצל בתחום של בקרת מינים ספציפי יתושים.

<table><tbody><tr><td>0.02 מ"ל פיפטמן</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>להשעיה מחדש של RNA מפריע</td></tr><tr><td>0.2 מ"ל פיפטמן</td><td>Rainin</td><td>PR200</td><td>להשעיה מחדש של RNA מפריע והכנת RNA/ננו-חלקיקים מפריעים</td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינור בוגר&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-120</td><td>על ציטוט מושעה RNA מפריע</td></tr><tr><td>1 מ"ל פיפטמן</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td><td>על השעיה מחדש של RNA מפריע והכנת RNA/ננו-חלקיקים מפריעים</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל שפופרת מדורגת &nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-046</td><td>להכנת RNA/ננו-חלקיקים מפריעים</td></tr><tr><td>1M נתרן אצטט, pH 4.5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>להכנת חומצה אצטית חומצה אצטית נתרן אצטט</td></tr><tr><td>, AIRSTAR. ACS, USP, FCC דרגת</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>להכנת מאגר נתרן אצטט</td></tr><tr><td>Agarose Genetic Technology Grade</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>לציפוי RNA/ננו-חלקיקים מפריעים מוכנים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>לגלולה RNA/ננו-חלקיקים מפריעים</td></tr><tr><td>Chitosan, מקליפות שרימפס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>לשילוב עם RNA מפריע להכנה של RNA/ננו-חלקיקים מפריעים</td></tr><tr><td>שמרים יבשים</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>להכנת מזון זחלי יתושים עם RNA מפריע/ ננו-חלקיקים</td></tr><tr><td>E-RNAi כלי</td><td>המרכז הגרמני לחקר הסרטן</td><td>NA</td><td>לתכנון dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr> <tr><td>מזון דגי זהב</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>להכנת מזון זחלי יתושים עם RNA/ננו-חלקיקים מפריעים</td></tr><tr><td>אמבט מים מחומם</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>לחימום ה-RNA/ננו-חלקיקים המפריעים ב-55oC</td></tr><tr><td>קרח</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>להפשרת RNA מפריע והכנת RNA/ננו-חלקיקים</td></tr><tr> מפריעים<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>דלי קרח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-591-44</td><td>לאחסון קרח המשמש במהלך ההליך</td></tr><tr><td>אבקת כבד</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>להאכיל זחלי יתושים לאחר הפרעה לטיפול ב-RNA/ננו-חלקיקים</td></tr><tr><td>תנור מיקרוגל</td><td>מגוון ספקים</td><td>שאינם ישימים</td><td>להכנת תמיסת אגרוז 2%</td></tr><tr><td>פטרידיש (100 x 15 מ"מ)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>תא הזנת RNA/ננו-חלקיקים מפריעים לזחלים</td></tr><tr><td>מד pH</td><td>מטלר טולדו</td><td>S220</td><td>להכנת בופר</td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-640</td><td>לחלוקת ה-RNA/ננו-חלקיקים המפריעים להזנה</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>המותאם אישית</td><td>להכנת siRNA/ננו-חלקיקים</td></tr><tr><td>נתרן גופרתי, נטול מים (Na2SO4)</td><td>BDH/מופץ על ידי VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>להכנת תמיסת נתרן גופרתי של 50 מ"מ שבה ה-RNA המפריע יהיה </td></tr><tr><td>מדחום</td> מושעה <td>VWR</td><td>61066-046</td><td>למדידת טמפרטורת אמבט המים</td></tr><tr><td>קיסמי שיניים</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>לערבוב במהלך הכנת מזון RNA/ננו-חלקיקים מפריעים וחיתוך כדורי ג'ל</td></tr><tr><td>מקפיא אולטרה-נמוך</td><td>מגוון ספקים</td><td>שאינם ישימים</td><td>לאחסון של כמויות RNA מפריעות ו-RNA/ננו-חלקיקים מפריעים ב-80oC</td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-216-108</td><td>להכנת צ'יטוזן/רנ"א מפריע</td></tr><tr><td>נייר משקל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9798735</td><td>לחלוקת כדור הרנ"א/ננו-חלקיקים המפריע להזנה</td></tr></tbody></table>

chitosan / השתקת הגנים rna nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

יתושי וקטור לגרום יותר סבל אנושי מכל אורגניזם אחר - ולהרוג יותר ממיליון אנשים בכל שנה. פרויקטי הגנום היתוש הקלו מחקר בהיבטים חדשים של ביולוגיה יתושים, כוללים מחקרים גנטיים תפקודיים בווקטור העיקרי אפריקה המלריה אנופלס gambiae ודנגי וקדחת צהובה וקטור Aedes aegypti. השתקת interference- RNA (RNAi-) בתיווך הגן נעשתה שימוש כדי למקד את הגנים של עניין בשני מיני יתושים וקטור מחלה אלה. כאן אנו מתארים הליך להכנת chitosan / מפריעים חלקיקי RNA שמשולבים עם אוכל ומעובדים על ידי זחלים. זה תפוקה גבוהה מבחינה טכנית פשוטה, ומתודולוגיה זולה יחסית, אשר תואם עם RNA הארוך גדילים הכפול (dsRNA) או מולקולות קטנות מפריעות RNA (siRNA), היו בשימוש כבר מציאה המוצלחת של מספר גנים השונים בא gambiae וא &#39; aegyptiזחלים. בעקבות האכלות זחל, מציאה, אשר מאומת באמצעות qRT-PCR או הכלאה באתר, יכולים להימשך, לפחות עד השלב מאוחר גלמים. מתודולוגיה זו עשויה להיות ישימה למגוון רחב של יתושים ומיני חרקים אחרים, כוללים מזיקים בחקלאות, כמו גם אורגניזמים שאינם מודל אחרים. בנוסף לשירות שלה במעבדת המחקר, בעתיד, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה, עלול להיות מנוצל בתחום.

<html> א gambiae: חלקיקי Chitosan / dsRNA נוצרים כתוצאה מהאינטראקציה אלקטרוסטטית בין קבוצות אמינו של chitosan וקבוצות פוספט של dsRNA. היעילות של שילוב dsRNA לתוך חלקיקים היא בדרך כלל מעל 90%, כפי שנמדד על ידי דלדול של dsRNA מהפתרון. תמונות במיקרוסקופ כוח אטומית עולות כי ממוצעי גודל חלקיקי chitosan-dsRNA nm 140 בקוטר, הנע 100-200 ננומטר (איור 1). <p class="jove_content...

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לתכנן ולהשתמש בננו-חלקיקים של RNA מפריע ל-tussin עבור מחקרי השתקה גנטית בזחלי יתושים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ננו-חלקיקים של RNA מפריע ל-tussin באמצעות שילוב של קיטין ו-RNA מפריע, ולאחר מכן חימום, ערבוב בוורטקס וסרטיפוגציה. המטרה הבאה היא לערבב את הננו-חלקיקים עם מזון לזחלים ואגרוז כדי להכין פלטי ג'ל המכילים מזון וננו-חלקיקים.מזון הננו-חלקיקים ניתן לזחלי היתוש, והזחלים הניזונים מהכדור נצפים, ובסופו של דבר נערכת אימות של השתקת הגנים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (quantitative real-time polymerase chain reaction), או באמצעות שתי בדיקות היברידיזציה. ניתן לבחון פנוטיפים של אובדן תפקוד.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המחקר של יתושים כווקטורים. לדוגמה, השתמשנו בה כדי לחקור את תפקודי הגנים במהלך ההתפתחות של מערכת הריח, המעי האמצעי של המוח ורקמות אחרות בעלות חשיבות לווקטור. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם תפוקה גבוהה, עלות נמוכה יחסית ופגיעה מועטה יותר באורגניזם בהשוואה להחדרה של RNA מתערב באמצעות מיקרו-הזרקה, אשר דורשת רמה גבוהה יותר של מיומנות ואינה ניתנת ליישום בשטח.יחד עם עמיתת הפוסט-דוקטורט Ava Maur, הטכנאי Ping Lee ידגים את הפרוצדורה. כדי להתחיל, המיסו tussin בבופר סודיום אצטט 0.1 molar כדי להכין תמיסת עבודה בריכוז 0.02%. שמרו את התמיסה בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר מכן, המיסו RNA דו-גדילי או siRNA (שניהם יכונה להלן RNA מפריע) ב-50 microliters של מים דה-יוניים.הכינו תמיסה בנפח 100 µL המכילה 32 µg של חומצת גרעין ל-100 µL של sodium sulfate בריכוז 50 mM. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת tussin לתמיסת ה-RNA המפריעה. חממו את התערובת במקלח מים בטמפרטורה של 55 °C למשך דקה אחת.הכינו ביקורת על ידי הוספת 100 µL של sodium sulfate בריכוז 50 mM ל-100 µL של תמיסת Tustin, ופעלו לפי אותו הליך לאחר החימום. ערבבו את התמיסות מיד למשך 30 שניות באמצעות vortex במהירות גבוהה בטמפרטורת החדר כדי להקל על היווצרות הננו-חלקיקים. צנטריפוגו את התערובת ב-13,000 G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שלאחריה אמור להיראות משקע (pellet). העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה בנפח 1.5 mL וייבשו את המשקע באוויר למשך כ-10 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.להכנת מזון ליתושים באמצעות ספקטרופוטומטריה של UV, מדדו את ריכוז ה-interfering RNA ב-SNAT תוך שימוש ב-S supernatant מהביקורת כבלאנק (blank) כדי לחשב את הכמות הכוללת של interfering RNA שנותרה ב-snat. השתמשו בהפרש בין הכמויות ההתחלתיות של interfering RNA לבין הכמויות שנותרו ב-supernatants כדי לחשב את אחוז ה-interfering RNA שנלכד בננו-חלקיקים. יעילות טעינה זו היא בדרך כלל מעל 90%. חזרו על אותו הליך אם דרושים ננו-חלקיקים נוספים.יש להשתמש בננו-חלקיקים המיובשים באופן מיידי, שכן השפעת אחסון קר של החלקיקים לפני השימוש לא נבחנה. כדי להכין תחילה את מזון היתושים, הכין תמיסת agro בריכוז 2% במים דאיוניים והמס את ה-aros. שמור את תמיסת ה-agro המומסת באמבט מים בטמפרטורה של 55 °C לפני השימוש.בשלב הבא, ערבבו פתיתי מזון לדגים ושמרים יבשים ביחס של אחד לשניים. טחנו את התערובת לחלקיקים קטנים באמצעות מכתש ועלי. המזון הטחון הוא בעל גוון חום.במבחנה של 1.5 מיליליטר, ערבבו שישה מיליגרם של מזון טחון עם הננו-חלקיקים היבשים בעזרת קיסם. לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטר של תמיסת agarose gel בריכוז 2% שהומסה מראש לתערובת המזון והננו-חלקיקים. ערבבו מיד וביסודיות באמצעות קיסם או קצה של פיפט.הג'ל המכיל מזון וננו-חלקיקים מוכן כעת להאכלת זחלי יתוש מסוג anomalies gambi. הוצא גלגול ג'ל בודד מהמבחנה בנפח 1.5 milliliter באמצעות קיסם, וחתוך אותו לארבעה פרוסות שוות בעזרת להב תער נקי או קיסם. לאחר מכן, העבר 23 זחלי star לצחנת פטרי המכילה 100 milliliters של מים דה-יוניים.האילו את הזבובים בשלב הלרבה על ידי הוספת פרוסה אחת מהכדור ג'ל. חתכו את הכדור לחתיכות קטנות לכל צלחת פטרי. אחת ליום במשך ארבעה ימים, ודאו שאתם צופים בלרובות הניזונות מהכדור, שגודלו אמור להצטמצם משמעותית או להיעלם לחלוטין עד למחרת.היתושים יתפתחו לשלב הרביעי המאוחר של הלרווה. רשמו כל שינוי פנוטיפי נראה במהלך הניסוי. בחנו את רמות התמלול ושינויים פנוטיפיים אחרים כפי שנדון בפרוטוקול הטקסט בסיום תקופת ארבעת הימים להאכלת לרווה יתושי GTI שמונים.חתוך את כדור הג'ל לארבעה פרוסות שוות באמצעות להב תער נקי או קיסם כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, מקם 50 לרוות של כוכב שסונכרנו 24 שעות לאחר בקיעת הביצים בתוך צלחת פטרי.בכ-40 מיליליטר של מים דה-יוניזציה. האכילו את ה larvae בפרוסה אחת לכל Petri dish למשך ארבע שעות ביום. שוב, יש לקצוץ את הפרוסה דק לחתיכות קטנות יותר.לאחר מכן, העבירו את ה larvae בחזרה לתזונה הרגילה של larvae, המורכבת מיחס של שניים לאחד של פתיתי מזון לדגים טחונים ושמרים יבשים, למשך שאר היום. חזרו על הפרוצדורה מדי יום לאורך ארבעת שלבי ה-instar של ה-larvae. בחנו את רמות התמלול ושינויים פנוטיפיים אחרים כפי שנדון בפרוטוקול הטקסט בנקודת הזמן ההתפתחותית הרצויה.הנקודות המוצגות כאן הן זחלי *Anopheles gambiae* בשלב הגוזל הרביעי (fourth instar) שהוזנו בתזונה של קבוצת ביקורת ונראים נורמליים כצפוי. עם זאת, המטריקס הפרה-אטרופי (para atrophic matrix) משובש בזחלים שהוזנו ב-RNA המפריע לכיטין (chitin interfering RNA) המכוון לכיטין סינתטאז 1 (chitin synthase one), כפי שמעיד ה-dextran blue שדלף אל ה-gastric caeca. ביטוי נורמלי של orco, הקורספטור (coreceptor) המחייב של הריח, נצפה בקרנות המישוש של זחלי *Aedes aegypti* בשלב הגוזל הרביעי שהוזנו בתזונה של קבוצת ביקורת.לעומת זאת, ביטוי של Orco אינו קיים בבעלי חיים שהוזנו ב-RNA interference המכוון לגן single-minded, בהשוואה לבעלי חיים בקבוצת הביקורת. לבעלי חיים שבהם בוצע knockdown של single-minded יש התנהגות פגומה של מעקב אחר ריחות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בננו-חלקיקי RNA interference כדי להשתיק גנים במהלך התפתחות של יתושי וקטור.טכניקה זו, שניתן להרחיבה פוטנציאלית לחקר יתושים בוגרים או אורגניזמי מודל מתהווים אחרים, סללה את הדרך עבור חוקרים לבחון את תפקודיהם של גנים שזוהו בפרויקטים של מיפוי גנום של יתושים, המהווים וקטורים למחלות.

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

בפרוטוקול זה אנו משלבים RNAi בתיווך להשתקת גנים...

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

מוצג כאן פרוטוקול להעברת ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA בזחלי בומביקס מורי תולעי משי כדי לגרום להשתקת גנים באמצעות בליעה.

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

תיאור וירוס-Induced שיטה להשתקת (VIGS) הגן לדפוק למטה של ​​ביטוי...

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

למד שתיקת גנים בזחלי יתושים באמצעות ננו-חלקיקי RNA מפריע מכיטוזן. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בנשאי מחלות ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

גלה סרטונים נוספים