Name: גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated: במבחנה משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למד שיטת תרבות משותפת של נוירוני DRG ותאי גזע ממקור שומני לחקר התחדשות עצבים היקפיים במבחנה. מודל זה מאפשר לחקור אינטראקציות תאיות וצמיחת נויטריטים בקרב חוקרי רפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לחקר הבריאות, האקדמיה למדעי הרפואה והאגודה הבריטית לכירורגיה של היד. אנו גם מודים על האספקה המתמשכת של GGF-2 מ-Acorda Therapeutics, ארה"ב. המחברים מבקשים להודות לפרופ' ג'ורג'יו טרנגי על תמיכתו והדרכתו רבת הערך בקבוצה שלנו במהלך השנים האחרונות שהובילו לפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול זה.

<ol><li>Wiberg, M., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+it+be+possible+to+produce+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Technol+Int%22%5BJournal%5D)">Will it be possible to produce peripheral nerves.</a> Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).</li>
<li>Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+and+basic+science+review%3A+past%2C+present%2C+and+future+of+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reconstr+Microsurg%22%5BJournal%5D)">Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair.</a> J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).</li>
<li>Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+for+return+to+work+in+patients+with+median+and+ulnar+nerve+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries.</a> J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).</li>
<li>Geuna, S., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%3A+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).</li>
<li>Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+differentiate+into+a+Schwann+cell+phenotype+and+promote+neurite+outgrowth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro.</a> Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).</li>
<li>Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+and+regeneration+of+the+peripheral+nervous+system%3A+From+Augustus+Waller%E2%80%99s+observations+to+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation.</a> J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+repair+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Regeneration and repair of peripheral nerves.</a> Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).</li>
<li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+dorsal+root+ganglia+neurons+purification+with+a+one-time+anti-mitotic+reagent+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment.</a> PloS One. 8 (4), e60558(2013).</li>
<li>Stettner, M., Wolffram, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+in+vitro+model+for+studying+peripheral+nerve+myelination+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse.</a> J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).</li>
<li>Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+and+neuron+co-cultures+for+the+study+of+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration.</a> Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).</li>
<li>Nissinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion%2FSchwann+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).</li>
<li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li>
<li>Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+role+of+the+cadherin%2Fcatenin+complex+at+the+Schwann+cell-axon+interface+and+in+the+initiation+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination.</a> J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).</li>
<li>Evans, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Challenges to nerve regeneration.</a> Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).</li>
<li>Webber, C., Zochodne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nerve+regenerative+microenvironment%3A+early+behavior+and+partnership+of+axons+and+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells.</a> Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).</li>
<li>Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+current+findings+and+future+persperctives%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives.</a> Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).</li>
<li>Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+and+nerve+regeneration%3A+promises+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls.</a> Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).</li>
<li>Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+differentiation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells.</a> Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).</li>
<li>Xu, Y., Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-forming+ability+of+Schwann+cell-like+cells+induced+from+rat+adipose-derived+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro.</a> Brain Res. 1239, 49-55 (2008).</li>
<li>Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells%3A+implications+for+cell-based+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy.</a> Neuroscience. 236, 55-65 (2013).</li>
<li>Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+secrete+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors.</a> Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).</li>
<li>Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+enhance+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).</li>
<li>Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+regeneration+of+peripheral+nerves+through+bioengineered+nerve+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts.</a> Neuroscience. 181, 278-291 (2011).</li>
<li>Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+decellularized+allogeneic+artery+conduits+with+autologous+transdifferentiated+adipose-derived+stem+cells+for+facial+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nerve+graft+constructed+with+xenogeneic+acellular+nerve+matrix+and+autologous+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).</li>
<li>Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cells and adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).</li>
<li>Bottenstein, J. E., Sato, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+rat+neuroblastoma+cell+line+in+serum-free+supplemented+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).</li>
<li>Mantovani, C., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+molecular+and+functional+differences+of+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+stem+cells+isolated+from+rats+of+different+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages.</a> Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).</li>
<li>Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+adipose-derived+stem+cells+act+synergistically+with+RGD-modi+fi+ed+surfaces+to+improve+neurite+outgrowth+in+a+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSumma%2C+PG+%22Tissue+Eng%22">Tissue Eng</a>. 19 (3-4), 368-379 (2013).</li>
<li>Fudge, N. J., Mearow, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-associated+gene+expression+in+adult+sensory+neuron+populations+cultured+on+a+laminin+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate.</a> BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).</li>
<li>Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+rigidity+and+ligand+density+influence+neuronal+response+in+methylcellulose-laminin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels.</a> Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).</li>
<li>Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21%3A+Use+of+stem+cells+for+improving+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Inl+Revi+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration.</a> Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).</li>
<li>Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+dorsal+root+ganglion+neurites+and+Schwann+cells+by+isolated+Schwann+cell+topography+on+poly%28dimethyl+siloxane%29+conduits+and+films%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films.</a> J Neural Eng. 8 (4), 046015(2011).</li>
<li>Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-aligned+Schwann+cell+monolayers+demonstrate+an+inherent+ability+to+direct+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth.</a> J Neural Eng. 7 (4), 046001(2010).</li>
<li>Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+of+polycaprolactone+films+via+surface-initiated+atom+transfer+radical+polymerization+for+covalently+coupling+cell-adhesive+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules.</a> Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).</li>
<li>Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+molecules+mediate+both+Schwann+cell+proliferation+and+activation+to+enhance+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth.</a> Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).</li>
</ol>

המחברים מאשרים כי אין ניגודי אינטרסים הקשורים לפרסום זה.

הנוירונים DRG משמשים לעתים קרובות בין תאים עצביים לתרבות העיקרית ללמוד את ההתחדשות של תאי עצב לאחר axotomy in vivo. הנה פרוטוקול מדויק לקציר DRG מחולדות מבוגרות מוצג, אשר נועד להקטין את האוכלוסייה של תאי לווין בסביבה מבלי להתפשר על ההישרדות העצבית. כASC המובחן לפנוטיפ כמו SC-הן אלטרנטיבה חוקית לSC לטיפולים בתאים, מערכת שיתוף תרבות ASC / DRG כמו SC-גם תוארה בפירוט. זה ידוע שlaminin (או נגזר laminin רצפי פפטיד) שיש לו השפעה חיובית על הישרדות נוירון והיווצרות neurite 31-33. בעת ביצוע תרבויות נוירון DRG מומלץ לכן למעייל בעבר כל מצע עם laminin כדי להימנע מכל אובדן פונקציונלי של התאים עצביים. הרעיון של ציפוי laminin חל גם על מצעים ביולוגי לעיצובמבני הנדסת רקמות, כגון פולי - caprolactone (PCL) משמשים לעתים קרובות לייצור של צינורות עצב 30. כמו כן, העבודה קודמת הראתה כי מטריצות הפיברין הן חומרים המתאימים לתרבויות עצביות בתלת ממד 11. בנוסף לציפוי חלבון, מודלים שיתוף התרבות לספק תנאים חשובים להישרדות תא עצב DRG וסביבה מתאימה ללמוד את יחסי הגומלין המתרחשים בין תאי עצב וSC במערכת העצבים ההיקפית בעקבות פציעה. יכולים גם להיות מושתלים תאים in vivo על ידי שימוש במכשירים עצביים כדי לקצר את זמן הגיוס של תאי אוטולוגי באתר הפציעה. הדבר חשוב במיוחד בפציעות קשות, אשר יכול להוביל להזדקנות תא / מוות וניוון שרירים. למרות SC הם תאי גליה החשובים ביותר המעורבים בתהליך של התחדשות היקפית עצב וmyelination, זמינות המוגבלת שלהם וקצב ההתפשטות האיטי שלהם הופך אותם לבלתי מתאיםעבור יישומי הנדסת רקמות 34. ASC הוא אלטרנטיבה חוקית בשל השפע והיכולת להתמיין לפנוטיפ SC, המבטא סמני גליה ספציפיים ומראה דמיון פונקציונלי לSC יליד 19. ASC הוא גם מסוגל לייצר חלבונים וצמיחת גורמי 5 שיכולים להיות מועיל להיווצרות והארכת neurites ידי נוירונים DRG במערכת שיתוף תרבות. עם זאת, ניתן להגדיר שתי מערכות שיתוף תרבות שונה כפונקציה של צרכי הניסוי. השיטה המוצעת במאמר זה היא גרסה מתוקנת של פרוטוקול מבוסס היטב במעבדה שלנו 11 והוא כרוך במגע ישיר בין שני סוגי התאים (שיתוף תרבות ישירה), שבו הסוג השני תא (תאי עצב DRG) הם זורעים בחלק העליון של אחרים (ASC כמו SC-). גישה זו מבוססת על ממצאים קודמים שהראו את החשיבות של הנוכחות של שכבת תאי גלייה על המצע כאשר זריעת תרבויות עצביות 35 <sup&gt; - 37. השפעה זו היא כנראה עקב תאי תאי אינטראקציות דרך integrins DRG ומולקולות ECM הופקדו מASC ורמזים אחרים על פני השטח של תאי גזע. כמו כן, ציין כי הפחתה של סרום חלבון במדיום הפחיתה את ההתפשטות של זיהום תאי לווין שיכול לנבוע מהניתוק של נוירונים DRG, מבלי להשפיע על פונקציות ASC. עם זאת, תאי לווין, כולל אוכלוסייה קטנה של SC, קשה לחסל לחלוטין מתרבויות של נוירונים DRG וכמה תאים שנותרו גם יהיה נוכח במערכת שיתוף התרבות. לכן חשוב לציין כי תת-אוכלוסיות הקטנות אלה יכולים גם להשתתף בתהליכי myelination במהלך לימודים במבחנה, ונזכרו תאי אוטולוגי שנמצאים in vivo לאחר פציעה. הגישה השנייה (לא מוצג כאן) כרוכה בשימוש בתרבות מוסיף תא, הימנעות מגע ישיר בין שני סוגי התאים שונים (שיתוף תרבות עקיפה). Howevאה, זה לא נציג של תנאי in vivo במהלך רגנרציה עצב (היכולת המופחתת של תאים עצביים לפתח neurites הארוכה), אבל הוא משמש כדי לחקור את ההשפעה של גורמי diffusible שוחררו במדיום על ידי אוכלוסיית תא מסוימת על 38 האחרים .

פציעות עצבים היקפיים נפוצות עם כ -9,000 מקרים בבריטניה המתרחשים בכל שנה בעיקרה צעיר ואוכלוסייה עובד 1. למרות טכניקות תיקון עצב מייקרו, שיקום רגיל של פונקציה הוא בלתי ניתן להשגה עם תוצאת יד תחושה לקויה, תפקוד מוטורי מופחת וכאב תכוף וחוסר סובלנות קרה 2. יש להם פציעות כגון השפעה עמוקה וקבועה על המטופל ועל יכולתן לבצע פעולות יומיומיות, עם פחות מ -60% חוזרים לעבודה 3. בעקבות פציעה, פנוטיפ והמורפולוגיה של תאי עצב ותאי שוואן שינוי (SC) על מנת ליצור סביבה מתאימה שתאפשר נביטת האקסון. במקרה של חיתוך רוחב, העצב מחולק להפרוקסימלי וגדמי דיסטלי; להיות הנקודה שממנה את תהליך ההתחדשות מתרחש, תוך הגדם הדיסטלי הגדם הפרוקסימלי עובר ניוון Wallerian ואז ניתק SCמהאקסונים נפצעו, דה-להבדיל ולהתרבות. זה הוא יסוד לכיוון הסרת המיאלין פסולת והכנת הגדם הדיסטלי ל4,5 מחדש דור עצב. ההנבטה אקסון נתמכת על ידי הייצור של גורמי neurotrophic וכמוקינים שפורסמו על ידי SC בגדם הדיסטלי, ומונחה על ידי lamina הבסיס נשאר מאחור הבא ניוון Wallerian 6,7. SC ליישר לצד האקסון ההתחדשות להרכיב הלהקות של Büngner, אשר מסייע צמיחת האקסון לאיבר המטרה, הפחתת ההסתעפות מחוץ לצינור endoneurial. בעקבות reinnervation, SC מהווה את מעטפת המיאלין החדשה עוטפת את האקסונים מחדש, אבל תפקוד חושי ומוטורי הוא רק החזיר 8 באופן חלקי. גרעיני שורש הגבי (DRG) הם מבנים הממוקמים בforamina חולייתי בעמוד השדרה, המכילים את התאים עצביים התחושתיים innervating האיברים ההיקפיים. כאשר ניתק, הם יכולים לשמש כמתאימים במבחנה modאל לחקר התחדשות עצב 9-11, כוללים חקירות של היווצרות המיאלין. בפרט, הנוירונים DRG המבוגרים לחקות את מאפייני in vivo של תאים אלה ולספק כלי אימתני ללמוד אסטרטגיות חדשות לתיקון עצב היקפי בהנדסת רקמות. שיתוף תרבויות מייצגות מערכת דינמית המדמה במבחנה הגומלין של שני (או יותר) סוגי תאים בסביבה מסוימת in vivo. אחד היתרונות של דגמי שיתוף תרבות תאים אלה הוא הגמישות ושליטה גבוהה שיכול להיות שהופעלה על הסביבה תאית. הנוירונים DRG היו בשימוש לעתים קרובות במערכות שיתוף תרבות עם SC לחקות את האינטראקציות המתרחשות בפועל בין שני סוגי התאים במערכת העצבים ההיקפית 10,12 - 14. זה היה הראה כי SC להפריש מטריצה ​​תאית (ECM) חלבונים וגורמי גדילה שיכולה לשפר פלאיםהיכולת של נוירונים DRG לשרוד ולנבוט neurites 15,16. עם זאת, SC דורש תקופות ארוכות של זמן להתרבות ו, למרות ההתקדמות בטכניקת תרבית תאים, זה עדיין קשה כדי ליצור מספר מתאים של תאים עבור יישומי הנדסת רקמות. בנוסף, את ההקרבה של עצב בריא מתחייבת למסוק SC אוטולוגי. לכן, ההבדל בSC המקור חשוב לשניהם הנדסת הרקמות ובבדיקת מבחנה של תאי עצב חדש. בתצוגה זו, ASC יכול להיחשב חלופה רבת ערך לפיתוח מבנה רקמות מהונדסות כדי לשמש ל17,18 תיקון עצב ההיקפי. עבודה קודמת הוכיחה את יכולתם של התאים להתמיין לASC כמו SC-, להביע גליה-סמנים אופייניים, כגון S-100, p75 וחלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) 19, כמו גם את חלבון המיאלין אפס (P0) 20 . הפרשת גורמי גדילת גליה, כגון גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), גורם גדילה עצבית (NGF) וגורם שמקורן בתאים גליה neurotrophic (GDNF) נצפו גם 21,22. לכן, ASC כמו SC-יכול לשמש כאמרגן של התחדשות עצבים היקפית, כפי שהודגם על ידי שני במבחנת in vivo לומד 23-26. בנוסף, ניתן לקצור ASC באמצעות הליכים מינימאלי פולשנית במספר גבוה יותר בהשוואה לסוגים אחרים של תאי גזע; התדירות של תאי גזע ברקמת שומן היא 100 עד 1,000 גבוה פי יותר מאשר במח עצם 27, ויש להם שיעור ריבוי גבוה יותר בהשוואה לתאי גזע mesenchymal SC ומח עצם. עבודה זו נועדה לספק פרוטוקול מפורט לביצוע קציר יעיל גבוה של נוירונים DRG ניתקו וASC בהתאמה, האחרון שהבדיל לתוך תאים כמו SC-. התרבות המשותפת של שני סוגי התאים ולכן תספק מערכת מעשית מאוד שיכול לשמש למחקרים עתידיים ביכולת של ne DRGurons לנבוט neurites והמנגנונים של היווצרות המיאלין על פיגום שונה להנדסת רקמות עצבים.

<table><tbody><tr><td>100 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td>70 &mu; מסננות M (מק"ט 352350) יכולות לשמש כחלופה</td></tr> צינורות <tr><td>פלסטיק 15 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלסטיק 50 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ2 צלוחיות</td><td>קורנינג</td><td>BC301</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית >98% HPLC</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>תוסף ARA-C</td><td>סיגמא</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF-בסיסי (154 aa)</td> <td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td> <td>סיגמא</td><td>A9205</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג I</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td>הערה: קולגנאז זה משמש רק לעיכול רקמות שומן</td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג IV</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>LS004188</td><td>הערה: קולגנאז זה משמש רק לפירוק צמחי DRG</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Biosera</td><td>FB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>F3917</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB50253</td><td>חומר חד לסילוק בהתאם גורם</td></tr><tr><td>גדילת גליה-2 (GGF-2)</td> <td>Acorda Therapeutics</td><td></td><td>GGF-2 נתרם באדיבות על ידי Acorda Therapeutics. לחלופה זמינה מסחרית, אנו ממליצים על NRG1 ובטא; 1 (מו"פ & D Systems, Abingdon) להתמיינות תאי גזע לשימוש בריכוז הסופי של 200 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>תערובת נוטריאנטים F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N6658</td><td>חם ב-37 מעלות; C באמבט מים אלא אם כן צוין</td></tr><tr><td>האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>חם ב-37 מעלות; C באמבט מים אלא אם כן צוין</td></tr><tr><td>תוסף N-2 (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>17502</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor 2.5s חלבון, בלוטות תת-לסתות של עכבר&nbsp; (נ.ג.ף)</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (PS)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>קורנינג</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי PDGF-AA</td><td>פפרוטק</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>חם ב-37 מעלות; C באמבט מים. זה משמש לניתוק תאים מצלוחיות תרבית רקמות</td></tr><tr><td>טריפסין (2x לבלב בקר)</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה</td><td>LS003703</td><td>זה משמש לדיסוציאציה של DRG</td></tr><tr><td>מינימום חיוני בינוני נשר (MEM)</td> <td>Sigma</td><td>M8042</td><td>חם ב-37 מעלות; C באמבט מים אלא אם כן צוין</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>הכן את התמיסה בארון הביולוגי</td></tr></tbody></table>

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

נוירונים של גרעיני שורש גבי (DRG), הממוקמים בנקב הבין חולייתי של עמוד השדרה, יכולים לשמש ליצירת מערכת חוץ גופית המאפשרת את חקר התחדשות העצבים והמיאלינציה. תאי הגליה של מערכת העצבים ההיקפית, תאי שוואן (SC), הם מסייעים מרכזיים לתהליכים אלה; לכן חיוני שהאינטראקציות של רכיבים תאיים אלה יילמדו יחד. מגע ישיר בין נוירוני DRG לתאי גליה מספק גירויים נוספים המורגשים על ידי קולטני ממברנה ספציפיים, ומשפר עוד יותר את התגובה העצבית. SC משחרר גורמי גדילה וחלבונים במדיום התרבית, המשפרים את הישרדות הנוירונים וממריצים נביטה והתרחבות של נויריטים. עם זאת, SC דורש זמן התפשטות ארוך כדי לשמש ליישומי הנדסת רקמות והקרבה של עצב בריא למקורם. תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) המובחנים לפנוטיפ SC הם חלופה תקפה ל-SC להקמת מודל תרבית משותפת עם נוירונים DRG לחקר התחדשות עצבים. העבודה הנוכחית מציגה פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור שלב אחר שלב לקצירת נוירונים DRG ו-ASC מחולדות בוגרות; להבדיל ASC לכיוון פנוטיפ SC; ומשלב את שני סוגי התאים במערכת קו-תרבית ישירה כדי לחקור את יחסי הגומלין בין נוירונים ו-SC במערכת העצבים ההיקפית. לכלי זה יש פוטנציאל גדול באופטימיזציה של מבנים מהונדסי רקמות לתיקון עצבים היקפיים.

תרבויות של נוירונים DRG ניתק לייצג מתאימות במודל חוץ גופית לחקר תאי עצב חדש. עם זאת, מצעים שלא טופלו לא מספקים סביבה מתאימה לקובץ מצורף DRG והרחבה של neurites. כמו SC-ASC מסוגל לייצר גורמי גדילה וכמוקינים 19 אשר יכולה לשפר את היכולת של נוירונים DRG לנבוט neurites כאשר הם משתחררים במדיום התרבות. הנוכחות של ASC כמו SC-במערכת התרבות ולכן יכולה לשחק תפקיד חשוב בויסות פונקציות DRG. פרוטוקול זה (איור 1) ממחיש את ההליך כדי לבצע שיתוף תרבות ישירה של נוירונים ASC וDRG כמו SC-, שבמהלכו תאים עצביים לקבל בקשר ישיר עם ASC כמו SC-זרע בעבר. הקושי העיקרי הקשורים בהליך זה הוא שונות הגבוה של מספר הנוירונים DRG שנקטפו מבעלי חיים שונים. מסיבה זו, תוצאות יכולות להיות לפעמים קשה comparדואר ותשומת לב מיוחד צריכים להיות משולם במהלך הליך הזריעה כדי להשיג תמיד צפיפות תאים דומה בכל ניסוי. הפרוטוקול כבר מותאם להפחתה לפחות את מספר תאי לווין שנותרו מניתוק נוירון DRG באמצעות שיפוע BSA (שלב 3.11). בנוסף, תוספת ציטוזין-arabinose (ARA-C) ניתן להוסיף למדיום BS כדי למזער את אוכלוסיית תאי לווין נוסף, כפי שתוארה על ידי et al Kingham. 11. עם זאת, הבחירה של זמן הטיפול צריכה להיות מאוזן היטב עם DRG וחיוניות ASC כמו SC-, השפיע גם על ידי הנוכחות של תוספת ARA-C במדיום התרבות. לכן, זה מאוד קשה להשיג בחינם-מערכת תא לווין. איור 2 מראה את החשיבות של ASC כמו SC-לneurite DRG הנבטה במודל שיתוף תרבות באמצעות פולי שלא טופלו וכימי-שונה - סרטי caprolactone (PCL) כמו מצעים. הנוירונים DRG היו maintained בתרבות במשך 3 ימים בנוכחות או עדר של ASC כמו SC-, באמצעות פתרון מעורב המכיל 50% של מדיום BS ו -50% של מדיום התמיינות תאי גזע, כפי שמתואר בשלב 4.5. בעקבות תקופה זו, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4% ומוכתמים בβ טובולין III (נוירונים DRG) וS100 (ASC כמו SC-) לחקור מורפולוגיה של תאים וללמוד את היכולת של נוירונים DRG כדי לבלוט neurites. אין neurites נצפתה על משטחים שלא טופלו בהעדר ASC (איור 2 א) כמו SC-, תוך היווצרות neurites שופרה במערכת שיתוף התרבות (איור 2 ג) באופן ברור. בממוצע, מספר neurites לגוף תא גדל באופן משמעותי 0-3 בנוכחותם של תאי גזע. אישור לתוצאות אלה ניתנו גם על ידי סריקה מיקרוסקופי אלקטרונים ניתוח (SEM), שמוצג באיור 3. בפרט, תמונות SEM מראות כי היכולת של הנוירונים DRG לנבוט neurites מתרחשת באופן מועדף בשיתוףעם ASC כמו SC-, כפי שצוין על ידי החצים הצהובים באיור 3 ג. יש לציין שהשימוש במצעים-שונה laminin (כוללים פפטידים המופק laminin) במערכות תרבות המכילות נוירונים DRG הוגדר לעתים קרובות כתנאי מתאימים לתרבית תאים עצבית, שיש השפעות מדהימות על היווצרות והארכת neurite 30-32 . עם זאת, התוצאות מוצגות באיור 2 ד ו איור 3D מראות כי השילוב של אותות כימיים וביולוגיים נוסף יכול לשפר את התגובה של נוירונים DRG. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" /> הכנת איור 1. של מערכת שיתוף תרבות ASC כמו DRG-SC הישירה. נוירונים DRG וASC נגזרים בהתאמה מעמוד השדרה והשומן הקרביים ומפשעה של mal הבוגרחולדות הדואר Sprague-Dawley. לאחר העיכול של רקמת השומן דרך מפל של תגובות אנזימטיות, ASC נבדל לתאים כמו SC-ונשמר בתנאים תת-מחוברות עד הצורך. ASC כמו SC-הם מראש זרע על כל שעה מצע 24 לפני קציר DRG. ביום, הנוירונים DRG מופקים וניתקו באמצעות סדרה של פעולות אנזימטיות ומכאניות. אז נוירונים הם זורעים בחלק העליון של ASC כמו SC-זרע בעבר ומתוחזק בתרבות עד assayed (בינוני מעורבת: מכילים 50% של מדיום התמיינות תאי גזע ו -50% של מדיום BS שונה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" /> איור 2. תמונות הקרינה של נוירונים DRG בתנאי תרבות מגוונים.() סרטים PCL שלא טופלו; (ב) סרטי PCL שונה-RGD; (ג) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL שלא טופלו; (ד) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL שונה-RGD. תאים נשמרו בתרבות במשך 3 ימים באמצעות פתרון מעורב המכיל 50% של מדיום BS שונה ו -50% מבינוניים התמיינות תאי גזע. לאחר פרק זמן זה, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4%, permeabilized בפתרון Triton-X, ואתרי קישור שאינם ספציפיים חסומים עם BSA 1%. תאים עצביים אז היו מוכתמים נגד β טובולין III (FITC; ירוק) וASC כמו SC-נגד S-100 (AlexaFluor568; אדום) נוגדנים. לבסוף גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אולימפוס BX60, יפן). (Re-הדפסה באישור דה לוקה et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדול</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" /> איור 3. תמונות SEM של נוירונים DRG בתנאי תרבות מגוונים () סרטי PCL שלא טופלו (B) סרטי PCL שונה-RGD;. (ג) שיתוף תרבותי עם ASC כמו-SC על סרטי PCL שלא טופלו; (ד) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL-שונה RGD. החיצים הצהובים מצביעים על נקודות המגע בין ASC כמו SC-וDRG, המאשרים האינטראקציה הישירה שלהם במערכת שיתוף התרבות. תאים נשמרו בתרבות במשך 3 ימים וקבועים בglutaraldehyde 2.5%. בעקבות התייבשות בסדרה מדורגת אתנול (50%, 70%, 90%, 100%), תאים היו סוף סוף לשטוף בhexamethyldisilazane ויבש לפני ההרכבה של ספחים וזהב מקרטעות לניתוח SEM. תמונות נרכשו באמצעות SEM (Zeiss EVO60, בריטניה) עם כרך מאיץכאחוז של 10kV. (Re-הדפסה באישור דה לוקה et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר הפציעה.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים תרביות השתלה משותפת (co-cultures) של תאי גזע המופקים מרקמת שומן ושל נוירונים מ ganglion של השורש האחורי (DRG), לצורך חקר התחדשות עצבית in vitro. הדבר מושג תחילה על ידי הפקת תאי גזע לא מובחנים מרקמת שומן של חולדה. בשלב השני, התאים מובחנים לתאים דמויי שוואן באמצעות תערובת של גורמי גדילה.בשלב הבא, נוירונים של גנגליונים של שורש אחורי (DRG) נאספים מחוט שדרה של חולדה, ובשלב הסופי, הנוירונים מושבצים על תאי הגזע המובחנים כדי ליצור את מערכת התרבית המשולבת (co-culture) במעבדה (in vitro). לבסוף, התאים נצבעים לסמנים נוירונליים וגליאליים כדי לאפשר צמיחת נוריטים וכימות שלהם, ומצולמים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לצורך הערכה מורפולוגית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות שונות בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון כיצד תאי גזע נגזרים מרקמת שומן מקיימים אינטראקציה עם נוירונים של DRG על גבי חומרים ביולוגיים שונים?הסיבה לכך שהדגמה של שיטה זו היא קריטית היא ששלבים אלו קשים ללמידה בשל הנגישות הנמוכה והגודל הקטן של הרקמות בתוך מ╅בת ביולוגית. התחילו בקיצוץ דק של השומן הוויסראלי והמפשעות, שנלקח מחולדות Sprague Dawley זכרים בוגרות, עד למרקם דק, באמצעות מספריים ולהב תער סטרילי. לאחר מכן, העבירו את תמיסת השומן שהתקבלה למבחנה המכילה 15 milliliters של תמיסת קולגןאז type one מסוננת וסטרילית שהוכנה זה עתה, והניחו את המבחנה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C תחת ערבוב רציף למשך 30 עד 60 דקות.יש לעקוב מקרוב אחר תהליך העיכול ולהפסיקו לפני שהרקמה מתפרקת לחלוטין, כדי לשפר את חיוניות התאים ואת תנובתם. כאשר הרקמה מוכנה, יש לסנן אותה דרך מסנן תאים של 100 micron. עיכול תקין יביא למרקם שומני הומוגני שנראה בצבע בז' בעת ערבוב עדין.נטרלו את אנזימי העיכול באמצעות 15 milliliters של מצע גידול לתאי גזע בטמפרטורה של 37 degrees Celsius המועשר ב-FBS. לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה כדי לאסוף את הפракציה הווסקולרית הסטרומלית. שאבו את הנוזל העליון (supinate), החל משכבת השומן העליונה.שחזר את המשקע במיליליטר אחד של בופר ISIS לתאי דם אדומים באמצעות פיפוט. לאחר דקה, עצור את הליזיס על ידי הוספת 10 מיליליטר של מצע טרי וסובב שוב את התאים בצנטריפוגה. כעת, שאב בזהירות את ה-S supernatant.ששוף מחדש את התאים ב-10 milliliters של מצע והעבר אותם לבקבוק תרבית של 75 square centimeter בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide. שמור על התאים ברמות סוב-קונפלואנטיות עד למעבר הראשון או השני, שבו התאים יהיו מוכנים לדיפרנציאציה לתאים דמויי שוואן על ידי טיפול ב-beta mercaptoethanol וחומצה רטינואית, כדי להשיג נוירונים של DRG לאחר קציר של חוט השדרה.התחילו בהסרת כל החלקים הגביים, ולאחר מכן השתמשו במספריים כירורגיים סטריליים וחדים כדי לחלק את עמוד השדרה לשניים לאורך הציר האורכי, ובכך לחשוף את רקמת חוט השדרה. חתכו את עמוד השדרה לשני מקטעים קטנים יותר מתחת למפלס כלוב הצלעות, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה עדינה כדי להוציא בעדינות את כל רקמת חוט השדרה. יש להיזהר לא למשוך ולהסיר את שורשי ה-DRG, הנראים כסיבים לבנים היוצאים ישירות מהתעלות.לאחר שכל רקמת הגלעין הוסרה, השתמשו בפינצטה עדינה מאוד כדי למשוך את שורש ה-DRG כולו, תוך הגעה לעומק תעלות החוליות והקפדה לא לפגוע בשורשי הגנגליונים. העבירו את ה-DRG לצלחת פטרי של 60 מילימטרים רבועים המכילה 3 עד 4 מיליליטרים של מצע hams F 12 מועשר באנטיביוטיקה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה סטרילית ובסכין מנתחים כדי להסיר שאריות של שורשי עצבים סביב הגנגליונים, וזאת כדי להפחית את זיהום תאי הלוויין.בשלב הבא, העבירו את ה-DRG לתוך צלחת פטרי של 35 square millimeter המכילה 1.8 milliliter של מצע F 12 טרי והוסיפו 200 microliters של תמיסת מלאי collagenase Type four. דגרו את ה-DRG למשך שעה אחת ולאחר מכן שאבו בזהירות את המצע באמצעות פיפטת זכוכית.יש להקפיד לא לשאוב או לפגוע ב-DRG. חזור על שלב הקולגנאז ושטוף את ה-DRG באמצעות מצע F 12. לאחר השטיפה השנייה, הוסף לתאים 1.8 milliliters של מצע F 12 ו-200 microliters של טריפסין.הסירה את ה-trypsin והוסף מיליליטר אחד של מצע מועשר ב-500 µL של FBS כדי לעצור את התגובה האנזימטית. לאחר מכן, שאב את המצע ושטוף בעדינות את ה-DRG עם מצע F 12 שלוש פעמים כדי להסיר את כל שאריות הסרום. כעת, הוסף לתאים שני מיליליטר של מצע F 12 טרי והשתמש בפיפטת זכוכית כדי להעביר בזהירות את תרחיף התאים למבחנה של 15 מיליליטר.בצעו פיפטור למעלה ולמטה שמונה עד 10 פעמים כדי להפריד בעדינות את הנוירונים, ולאחר מכן המתינו עד שהמשקע יצטבר בתחתית המבחנה. העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה והוסיפו שני מיליליטר של מצע F 12 טרי למשקע. חזרו על ההפרדה המכנית והעברת המצע עד שהסספנסיה תהפוך להומוגנית.לאחר מכן, בצעו ריסוף (rerate) של תרחיף התאים שלושה עד ארבעה פעמים, ולאחר מכן סננו את התרחיף ההומוגני שהתקבל דרך מסננת תאים של 100 micron לתוך מבחנה חדשה של 50 milliliter. סבבו את התאים בצנטריפוגה במבחנה של 15 milliliter; בזמן הסיבוב האיטי, טפטפו בעזרת פיפטה bovine serum albumin בריכוז 15% שהוכן טרי לאורך הדופן הפנימית של מבחנת 15 milliliter, המוחזקת בזווית של 45 מעלות, כדי ליצור נתיב חלבון הדרגתי.השתמשו במספרים שעל המבחנה כנקודת ייחוס למסלול ההיווצרות, ולאחר מכן שאבו את הנוזל מהתאים, תוך השארת 500 microliters אחרונים לצורך resus, השעיה של המשקע וחלוקה איטית של התאים לאורך נתיב החלבון אל תוך המבחנה החדשה. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף של התאים, השעו שוב את המשקע ב-1 milliliter של מצע BS משונה וזריעו את התאים בנפח קטן של מצע. בלוח 24 בארות למשך שעתיים, כאשר התאים נצמדו, הוסיפו מצע BS טרי המועשר ב-15 nanograms per milliliter של Nerve Growth Factor לאחר הדיסוציאציה.ניתן להשתמש בתאי DRG גם לתרבית משותפת (co-culture) עם תאי גזע אדיפוציטים דמויי תאי שוואן, על ידי זריעתם מעל לתאים שנזרעו מראש. תמונות אלו מדגימות את חשיבותם של תאי גזע אדיפוציטים דמויי תאי שוואן לצמיחת ניוריטים של DRG במודל של תרבית משותפת המשתמשת בסרטי פוליקפרוֹלקטון כתשתיות. לא נצפו ניוריטים על פני שטח לא מטופלים בהיעדרהם של תאי גזע אדיפוציטים דמויי תאי שוואן, בעוד שהיווצרות הניוריטים השתפרה בבירור במערכת התרבית המשותפת.בממוצע, מספר הניוריטים לכל גוף תא עולה באופן משמעותי בנוכחות תאי גזע. ואכן, כפי שתמונות אלה ממחישות, היכולת של נוירונים של DRG להנביט ניוריטים מתרחשת באופן מועדף בשילוב עם תאי גזע מובחנים, כפי שמוצג על ידי החצים הצהובים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים כעת להפיק תאי גזע ולהפריד נוירונים של DRG.אך כמו כן, עליכם להיות מסוגלים להקים מודל למחקר של ניוון פריפריה ממוצע.

dorsal-root-ganglia-neurons-differentiated-adipose-derived-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

סרטון זה מדגים שיטה לפיתוח גרעיני שורש גביים או תרבית צמחי DRG ומודלים של תאים מנותקים DRG באמצעות רקמות DRG מבודדות של עכבר. מודלים אלה מסייעים לחקור מנגנונים שונים עם אינטראקציות נוירון-גלייה בסביבה מבוקרת.

יצירת גנגליון שורש גבי, חציל ותרבית תאים מנותקת

סרטון זה מדגים שיטה לקצירת תאי עצב מגרעיני השורש הגבי (DRG). DRG מעמוד השדרה של חולדה מבודד, מטופל באנזימים, ולאחר מכן מנותק מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. תאי העצב מופרדים מתאי גלייה באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות ומתורבתים במדיום גידול.

טכניקה לקצירת וניתוק גרעיני שורש גבי עבור תרביות עצביות

סרטון זה מדגים את מודל ההתרבות של צמח גנגליון שורש גבי ותאי Schwann. בתנאי קוטורטור, חומצה אסקורבית מקדמת התמיינות של תאי Schwann לצורות myelinating. תאי Myelinating Schwann עוטפים את האקסונים מספר פעמים כדי ליצור מעטפת מיאלין, החיונית לתפקוד העצבים.

גידול משותף של צמח גנגליון שורש גבי עם תאי Schwann למיאלינציה של נוירונים

פרוטוקול זה מציג את השימוש בהזרקת גנגליון שורש גבי (DRG) עם וקטור ויראלי ופגיעת ריסוק שורש גבי במקביל בחולדה בוגרת כמודל לחקר התחדשות אקסון חושי. מודל זה מתאים לחקירת השימוש בריפוי גנטי לקידום התחדשות אקסון חושי.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

בדו ח זה, היתרונות של תרבויות organotypic ותרבויות הפומבית העיקרי של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים מודגשים לחקור מגוון רחב של מנגנונים הקשורים אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, בתגובה זיהום ויראלי.

Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי

שורש העץ הגרעינים (DRG) ראשי תרבויות משמשים לעתים קרובות כדי לחקור פונקציות פיזיולוגיים או אירועים הקשורים לפתולוגיה, החישה הניריונים. כאן, נדגים את השימוש המותני תרבויות DRG כדי לזהות את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים לאחר neuropeptide FF קולטן הקלד 2 גירוי עם אגוניסט סלקטיבי.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.

מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

פרוטוקול זה מתאר שיטות להקמת תרביות שלמות ומנותקות של גרעיני שורש הגב של העכבר (DRG) והשימוש בהן להערכת אינטראקציות גידול-עצב.

הקמת מודלים במבחנה של תרבית גרעיני שורש גב: גישות משלימות לחקירת הצלבה בין סרטן לעצב

למד שיטת תרבות משותפת של נוירוני DRG ותאי גזע ממקור שומני לחקר התחדשות עצבים היקפיים במבחנה. מודל זה מאפשר לחקור אינטראקציות תאיות וצמיחת נויטריטים בקרב חוקרי רפואה רגנרטיבית.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:

גלה סרטונים נוספים