גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated: במבחנה משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים תאי גזע שמקורם בשומן וגנגליון שורש גבי או תרביות קו-נוירונים DRG לחקר התחדשות עצבים במבחנה. זה מושג על ידי השגת תאי גזע שמקורם בשומן לא ממוינים מרקמת שומן של חולדות. בשלב השני, התאים מתמיינים לתאים דמויי שוואן באמצעות קוקטייל של גורמי גדילה.

לאחר מכן, נוירוני ה-DRG נקצרים מחוט השדרה של חולדה וקשורים בשלב האחרון, הנוירונים יושבים על תאי הגזע הממוינים כדי ליצור את מערכת התרבות המשותפת במבחנה. בסופו של דבר, התאים צבועים לסמנים עצביים וגליה כדי להקל על צמיחת נויריט, כימות והדמיה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק להערכה מורפולוגית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות שונות בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון כיצד שומן תאי הגזע הנכונים מתקשרים עם נוירונים אורגניים על ביו-חומרים שונים?

הסיבה להדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שמדובר בצעדים שקשה ללמוד בגלל הנגישות הנמוכה והגודל הקטן של הרקמות בארון ביולוגי. התחל בשימוש במספריים וסכין גילוח סטרילי כדי לקצוץ דק את השומן הקרביים והמפשעתי שנאסף מחולדות ספרו זכרים בוגרים למרקם עדין. לאחר מכן, העבירו את תמיסת השומן המתקבלת לצינור המכיל 15 מיליליטר של פילטר טרי שהוכן, תמיסת קולגנאז מעוקרת מסוג אחד והניחו צינור לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמשכת למשך 30 עד 60 דקות.

עקוב מקרוב אחר עיכול לפני שהרקמה מתנתקת לחלוטין כדי לשפר את כדאיות התא ואת התפוקה. כאשר הרקמה מוכנה, סנן אותה דרך מסננת תאים של 100 מיקרון. עיכול טוב יביא לעקביות שומן הומוגנית שנראית בז' עם מערבולת עדינה.

לנטרל את אנזימי העיכול עם 15 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מדיום גידול תאי גזע בתוספת FBS. לאחר מכן סובב את התאים כדי לאסוף את שבר כלי הדם הסטרומלי. שאפו את השכיבה החל משכבת השומן העליונה.

השעו מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מאגר דאעש של כדוריות דם אדומות עם פיפטינג. לאחר דקה אחת, עצור את הליזיס על ידי הוספת 10 מיליליטר של צנטריפוגה טרייה, בינונית וצנטריפוגה לתאים. עכשיו שאפו בזהירות את ה-S supernatant.

השעו מחדש את התאים ב -10 מיליליטר מדיום וזרעו את התאים ב -75 סנטימטר מרובע. צלוחיות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. שמור על התאים ברמות תת-קונפלואנט עד למעבר הראשון או השני שבו התאים מוכנים להתמיינות לתאים דמויי שוואן על ידי טיפול באתנול בטא יותר וחומצה רטינואית כדי להשיג את נוירוני ה-DRG לאחר קצירת חוט השדרה.

התחל בהסרת כל חלקי הגב ולאחר מכן השתמש במספריים כירורגיים סטריליים וחדים כדי לחלק את עמוד השדרה לשניים לאורך ציר האורך, תוך חשיפת רקמת חבל הטבור. חותכים את עמוד השדרה לשני מקטעים קטנים יותר מתחת לגובה כלוב הצלעות, ולאחר מכן משתמשים במלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות את כל רקמת חבל הטבור. הקפדה לא למשוך ולהסיר את שורשי ה-DRG, המופיעים כחוטים לבנים היוצאים ישירות מהתעלות.

לאחר הסרת כל רקמת הליבה, השתמש במלקחיים עדינים מאוד כדי למשוך את כל שורש ה-DRG, להגיע עמוק לתוך התעלות הניתנות ולהקפיד לא לפגוע בשורשי הגרעין. מניחים את ה-DRG בצלחת עץ מחמד בגודל 60 מילימטר מרובע המכילה שלושה עד ארבעה מיליליטר של בשר חזיר F 12 בינוני בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במלקחיים סטריליים ובאזמל כדי לנקות את כל שורשי העצבים העודפים המקיפים את הגרעינים כדי להפחית את זיהום תאי הלוויין.

לאחר מכן, העבירו את ה-DRG לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר רבוע המכילה 1.8 מיליליטר של מדיום F 12 טרי והוסיפו 200 מיקרוליטר קולגנאז. פתרון מלאי מסוג ארבע. דגרו את ה-DRG למשך שעה ואז שאפו בזהירות את המדיום בעזרת פיפטה מזכוכית.

הקפדה לא לשאוף או לפגוע ב-DRG. חזור על שלב הקולגנאז ושטוף את ה-DRG במדיום F 12. לאחר הכביסה השנייה, הוסף לתאים 1.8 מיליליטר F 12 בינוני ו -200 מיקרוליטר טריפסין.

הסרת הטריפסין והוספת מיליליטר אחד של מדיום בתוספת 500 מיקרוליטר FBS כדי לעצור את התגובה האנזימטית. לאחר מכן שאפו את המדיום ושטפו בעדינות את ה-DRG עם מדיום F 12 שלוש פעמים כדי להסיר את כל עקבות הסרום. כעת האכילו את התאים בשני מיליליטר של מדיום F 12 טרי והשתמשו בפיפטה מזכוכית כדי להעביר בזהירות את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר.

פיפטה למעלה ולמטה שמונה עד 10 פעמים כדי לנתק בעדינות את הנוירונים ואז לאפשר לחיך להצטבר בתחתית הצינור כאשר החך התייצב. מעבירים את הסופינט לצינור חדש ומוסיפים שני מיליליטר מדיום F 12 טרי לחיך. חזרה על הדיסוציאציה המכנית והעברת המדיום למתלה הופכת הומוגנית.

לאחר מכן דרג מחדש את תרחיף התא שלוש עד ארבע פעמים ולאחר מכן סינון של התרחיף ההומוגני שנוצר דרך מסננת תאים של 100 מיקרון לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים בצינור של 15 מיליליטר בזמן שהם מסתובבים לאט פיפטה מוכנה טרייה. 15% אלבומין בסרום בקר במורד החלק הפנימי של שפופרת של 15 מיליליטר, מוחזק בזווית של 45 מעלות ליצירת שובל חלבון הדרגתי.

השתמש במספרים על הצינור כהתייחסות למסלול היווצרות, ואז שאב את החטיפה מהתאים, שמור את 500 המיקרוליטרים האחרונים להחייאה, תלה את הגלולה והוציא לאט את התאים לאורך שביל החלבון לתוך הצינור החדש. לאחר סיבוב התאים, שוב, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום BS שונה וזרעו את התאים בנפח קטן של מדיום. בצלחת של 24 בארות למשך שעתיים כאשר התאים התחברו הוסיפו מדיום BS טרי בתוספת 15 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה עצבי לאחר דיסוציאציה.

תאי ה-DRG יכולים לשמש גם לתרבית משותפת עם תאי גזע שומנים דמויי תאי ברבור על ידי זריעתם על גבי תאי הקדם-זרע. תמונות אלה מדגימות את החשיבות של תאי גזע שומן דמויי תאי שוואן להנבטת DRG Neurite במודל תרבית משותפת תוך שימוש בסרטי פוליקפרולקטון כמצעים. לא נצפו נויריטים על משטחים לא מטופלים בהיעדר תאי גזע שומנים דמויי תאי ברבור, בעוד שהיווצרות הנויריטים השתפרה בבירור במערכת התרבית המשותפת.

בממוצע, מספר הנויריטים לגוף התא גדל משמעותית בנוכחות תאי גזע. ואכן, כפי שתמונות אלה ממחישות, היכולת של נוירוני DRG להנביט נוירונים מתרחשת באופן מועדף בשילוב עם תאי גזע מובחנים כפי שמצוין על ידי החיצים הצהובים ורד. אז לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות מסוגל כעת להשיג תאי גזע שמקורם ב-lib ולנתק נוירונים DGen.

אבל גם אתה צריך להיות מסוגל להגדיר מודל ללימוד בניוון הממוצע ההיקפי.