Name: שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: למדו שיטת בחירת aptamers מיתוג מבנה באמצעות חרוזים מגנטיים לזיהוי colorimetric של ננו-חלקיקי זהב. הפרוטוקול מאפשר זיהוי רגיש של מולקולות קטנות כמו קורטיזול למדידת מצבי מתח פיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה בוצע בזמן שהמחבר (JAM) החזיק בפרס עמית מחקר של מועצת המחקר הלאומית במעבדות המחקר של חיל האוויר. מחבר שותף MW החזיק במלגת רייט למחקר בתמיכת משרד המחקר המדעי של חיל האוויר. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המחקר המדעי של חיל האוויר, מעבדת המחקר של חיל האוויר ו-Bio-X Strategic Technology Thrust.

<ol><li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).</li>
<li>Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortisol+assays+and+diagnostic+laboratory+procedures+in+human+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids.</a> Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).</li>
<li>Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+among+plasma+cortisol%2C+catecholamines%2C+neuropeptide+Y%2C+and+human+performance+during+exposure+to+uncontrollable+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosom.+Med%22%5BJournal%5D)">Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress.</a> Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).</li>
<li>Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Biomarkers+of+Physical+Fatigue+as+Markers+of+Sleep+Deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Sleep+Med%22%5BJournal%5D)">Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation.</a> J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).</li>
<li>Kwak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+biomarkers+from+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chrom.+B%22%5BJournal%5D)">Volatile biomarkers from human melanoma cells.</a> J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).</li>
<li>Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Cortisol+in+Saliva+with+a+Flow-Filtered%2C+Portable+Surface+Plasmon+Resonance+Biosensor+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System.</a> Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).</li>
<li>Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+functionalized+interdigitated+%CE%BC-electrode+%28ID%CE%BCE%29+based+impedimetric+cortisol+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor.</a> Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).</li>
<li>Kapczinski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allostatic+load+in+bipolar+disorder%3A+Implications+for+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+RNA+domain+that+binds+Zn2%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Selection of an RNA domain that binds Zn2.</a> RNA. 1 (5), 538-550 (1995).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Aptamers+Specific+for+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue.</a> PlosOne. 7, e37789(2012).</li>
<li>McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+biosensor+arrays+for+detection+and+quantification+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules.</a> Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free+electrochemical+biosensor+based+on+a+DNA+aptamer+against+codeine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine.</a> Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX%E2%80%94A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+An+Emerging+Class+of+Molecules+That+Rival+Antibodies+in+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics.</a> Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Morse, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+selection+of+RNA+beacon+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct selection of RNA beacon aptamers.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).</li>
<li>Nutiu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Switching+Signaling+Aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Structure-Switching Signaling Aptamers.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).</li>
<li>Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+fluorescence+biosensor+for+multiplex+detection+using+unmodified+gold+nanoparticles+Chem%5BTitle%5D)+AND+%22Commun%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem.</a> Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).</li>
<li>Li, H., Rothberg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li>
<li>Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+with+aptamer%E2%80%93gold+nanoparticle+conjugates%3A+effect+of+aptamer+length+on+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).</li>
<li>Hagen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalized+Zinc+Oxide+Field+Effect+Transistors+for+Selective+Sensing+of+Riboflavin+with+Current+Modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation.</a> Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).</li>
<li>Han, K., Liang, Z., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Strategies+for+Aptamer-Based+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors.</a> Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li>
<li>Hall, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+and+Amplification+of+DNA+Pools+for+In+Vitro+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Nucleic+Acid+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection.</a> Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).</li>
<li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li>
<li>Djordjevic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX+experiments%3A+New+prospects%2C+applications+and+data+analysis+in+inferring+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways.</a> Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).</li>
<li>Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RNA+with+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeting RNA with Small Molecules.</a> Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).</li>
<li>Jing, M., Boswer, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Methods+for+Measuring+Aptamer-Protein+Equilibria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).</li>
<li>Sachs, E. -F., Diederichsen, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSachs%2C+E-F+%22Binding+of+Triostin+Analogues+to+DNA%22">Binding of Triostin Analogues to DNA</a>. , AN NT008. (2011).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aptamer-linked+gold+nanoparticle+purple+aggregates+for+colorimetric+sensing+of+analytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes.</a> Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+Aptamer+Antidote+to+the+Anticoagulant+Drug+Bivalirudin%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin.</a> Plos One. 8 (3), e57341(2013).</li>
<li>Schütze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+SELEX+Process+with+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing.</a> Plos One. 6 (12), e29604(2011).</li>
<li>Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclic+identification+of+aptamers+for+human+alpha-thrombin+using+over-represented+libraries+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing.</a> Plos One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li>
<li>Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -C., Hudgens, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+Responses+to+Psychological+Stress+in+Men+Preparing+for+Skydiving%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).</li>
<li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Multiplexed+Proteomic+Technology+for+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery.</a> Plos One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+Addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).</li>
<li>Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+metabolites+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.-Relat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Progesterone metabolites in breast cancer.</a> Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).</li>
</ol>

הצהרת הפצה: מאושר לשחרור ציבורי; ההפצה היא בלתי מוגבלת (88 ABW-2,014-4,103). המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

העובדה שמולקולות קטנות הן עניין ביולוגי, אלא רק מהוות 19% מכלל aptamers דיווחה הופכת שיטות שנועדו לבחירת aptamers החלימה על מולקולות קטנות של משמעות רבה. SELEX של מולקולות קטנות הוא מאתגר במיוחד כקבוצות פחות פונקציונליות, מוטיבים מבניים, ופני שטח זמינים לאינטראקציה עם רצפים בהשוואה לחלבוני 1, וזה כבר העריך כי פחות מ -30% מבחירות לכל המטרות ניסו הביאו aptamer 38. לכן, אחד חייב להיות מודע במיוחד של תכנון וביצוע ניסויי על מנת לבחור aptamer ליעד מולקולה קטן בהצלחה. שיטת בחירת aptamer המתוארת בעבודה זו היא יתרון משום שהוא חל על מולקולות קטנות ללא צורך בשינוי כימי שעשויים לשנות את מאפייני מחייבם. זה גם elution מבוססת, מה שאומר שמאז tהוא DNA, ולא היעד, תחילה מחויב אז eluted מן חרוזים המגנטיים על ידי היעד, DNA אינטראקציה עם מטריצת חרוז לא להיות מוגבר לסיבוב הבחירה הבא בגלל קלסרים למולקולה של העניין משתחררים לחיץ supernatant וקלסרים מטריצה ​​ספציפיים יישארו כבול. לעומת זאת, שיטה שלילית בחירה נגד מטריקס נדרש לשיטות שלשתק את היעד לתמיכה המוצקה בכל סיבוב, כי ה- DNA שאינטראקציה עם המטריצה ​​יהיה מוגבר בנוסף לקלסרים היעד 1. השיטה הנוכחית תוכננה כאסטרטגיה מבחר המצומצם T מ &#39;. משמעות דבר היא כי מ &#39;T של הכלאה / בריכת cDNA נשמר קרוב לRT. מורס משמש אסטרטגיה דומה, אבל מיושם בדיקה cDNA 6-mer עם T מ &#39;&lt;10 ° C עם תנאי בחירה על 4 מעלות צלזיוס 17. היישום שלנו היה לassay biosensing בוצע ב RT, כך אורכו של cDNA הותאם לפיly. דבר זה שומר את ההחמרה של מבחר הנמוך מספיק כדי שקלסרים פוטנציאל לא הולכים לאיבוד בגלל האינטראקציה מחייבת היעד מתרחשת במיקום מרוחק שלא לגרום לשינוי קונפורמציה מסוגל לשבש cDNA מחייב. עם זאת, יעילות חלוקת השיטה המוצעת היא נמוכה בגלל כמה רצפים יהיו dehybridize מבוסס אך ורק על תרמודינמיקה. בניגוד לכך, Nutiu מיושם et al. CDNA 15 mer-, והיו רק מסוגל לזהות aptamers לשניים מארבע המטרות, אולי בגלל T מ &#39;של 15 mer-היה גבוה מכדי לאפשר שחרור על ידי יעד מולקולה קטן 18. לכן, בעוד שאסטרטגית הבחירה הנוכחית תדרוש סיבובים רבים כדי להסיר רצפי רקע, על ידי שליטה על החומרה של הבחירה ומזעור אובדן קלסרים פוטנציאל סיכויי הצלחה של יוגדלו. חוקרים רבים חדשים לבחירת aptamer אינם מודעים להיבטים חשובים הקשורים לPCR שלקלסרים פוטנציאליים. אופטימיזציה מחזור (סעיף 4.5) נחוצה משום-הגברה מעל ספריות DNA מייצרת לא רצויה על ידי-מוצרים (בדרך כלל גדולים יותר בגודל) במספרי מחזור גבוהים, ואת המוצר הרצוי עלול להיעלם לחלוטין עם עודף של רק 5 מחזורים 39. במקרה של הגברה מעל, מוצרי PCR כבר לא מייצגים אותם רצפי eluted על ידי היעד, ואת סיכויי הצלחת בחירה הם פחתו באופן משמעותי. איור 4 ממחיש דוגמא של מחזור אופטימיזציה מסיבוב 5 בעבודה זו. המחזור הנמוך ביותר מייצר להקת מוצר מינימאלית, עולה להקה בסכום עד 8 מחזורים; בשעה 10 במחזורים הלהקה מתחילה מעבר למוצר על-הגברה גודל גבוה יותר, והוא כמעט שכולו המוצר-מוגבר מעל תוך 12 מחזורים. פרט נוסף שחוקרים רבים חסרי הניסיון בSELEX יכולים להתעלם הוא שכל הבריכה צריכה להיות מוגברת בהגברת PCR בקנה מידה הגדולה (סעיף 4.6) באשוחרח &#39;סיבוב כדי להקטין אובדן קלסרים. מספר הרצפים אפשריים ייחודיים מoligonucleotides הוא 4 N, שבו 4 מייצג את ארבעת בסיסי חומצות גרעין, וN הוא מספר הבסיסים באזור של הספרייה האקראי. עבור עבודה זו, N = 40, וכתוצאה מכך חלל רצפים של 1.2 x 10 24 רצפים ייחודיים אפשריים. 2.5 nmol של ספרייה משמשת בסיבוב הראשון של בחירה מתאימה ל~ 10 15 מולקולות, כלומר כל עותק של ה- DNA סביר מיוצג בבריכה הראשונית כרצף ייחודי. לכן, כל הנפח של DNA eluted מן החרוזים על ידי היעד חייב להיות מוגבר כדי לשמור עותק של כל קלסר פוטנציאלי לסיבוב הבחירה הבא. ברגע שהגברה ראשונית זה התרחשה, מספר עותקים זמינים לבחירה בסיבובים הבאים שבו פתרון הומוגני הנחה לדגימה. גם הריכוז של היעד יש לשקול בזהירות בכל סיבוב. Nutiu et al. שימושריכוז da של 1 מ&quot;מ יעד לאורך כל תהליך הבחירה, ונבחר aptamer ATP עם ד K = 600 מיקרומטר 18. שניהם העבודה הנוכחית והמחקר של מורס 17 התחילו עם 100 מיקרומטר יעד, ירידה לאורך הקורס של הבחירה, והביאו aptamers עם זיקה מייקרו נמוכה. בדיוק איזה סיבוב ההחמרה צריך להיות מוגבר (ריכוז היעד נמוך יותר) תלוי מתי העשרה הוא ציין. עוד צעד קריטי הוא ליישם צעדי סלקציה שליליים נכונים כל כך aptamers להפגין ספציפי למולקולת היעד. השולט משמשים מותנה ביישום המיועד של aptamer נבחר. לדוגמא, aptamer 15-1 נועד לתפקד כאלמנט הכרה בassay biosensing לקורטיזול, כך פרוגסטרון שימש כמולקולת סלקציה שלילית משום שהוא מבשר חילוף חומרים לקורטיזול, כי הוא נמצא בנוזלים פיסיולוגיים 40. Aptamer ATP שנבחר על ידי et al Nutiu. &lt;/ Em&gt; לא כלל שלב סלקציה שלילי, ואינטראקציה עם מולקולות דומות מבני כוללים ADP, AMP, אדנוזין, וdATP 18. הערה אחרונה בתמורה היא שassay AuNP לעתים קרובות דורש אופטימיזציה רבה לכל זוג aptamer / יעד. מחפש את עוצמת הקול של מלח שגורם לשינוי בקושי חזותי בולט לכיוון גוון כחול לאחר תוספת מלח הוא נקודת התחלה טובה, אבל התאמה של נקודת ההתחלה ייתכן שתהיה צורך לבחון את התגובה. יש לנו גם מצאתי כי assay מייצר תגובות שונות באופן דרסטי בהתאם לריכוז חיץ (חיץ הבחירה עשוי לדרוש דילול בגלל ריכוז מלח הגבוה של מאגרים לעתים קרובות גורם לצבירה) והרכבו, מידת כיסוי DNA (איור 3), הכנת מדגם (חלק אורגני ממסים המשמשים להמסת היעד עלולים לגרום רקע גבוה שמסכות למקד תגובה), טמפרטורה, סוג מלח וריכוז, ואינקובטוריםזמן tion (של שני DNA עם AuNP וDNA / AuNP עם יעד). בתנאים מותאמים באופן מלא, תוצאות נצפו בדרך כלל עם &lt;דקות זמן דגירה יעד 5, הממחישות את התועלת של תגובה מהירה יעד של פלטפורמת biosensing AuNP. לדוגמא, באיור 5 זמן הדגירה של aptamer / צעד AuNP הופחת מ O / N (איור 3) עד 30 דקות, ומלח התווסף מייד (&lt;10 שניות) לאחר תוספת היעד ולא 20 דקות מאוחר יותר (איור 3 ) בצפיפות טעינה של 73 D / NP. זה הגדיל את תגובת הקורטיזול ל~ 82% גבוהים יותר מאשר (איור 5 א) הריקים בריכוז 10 מיקרומטר יעד לעומת ~ 40% באמצעות התנאים הקודמים (איור 3). תגובה זו יכולה להיות מכובדת בעין בלתי מזוינת (איור 5). שים לב שהטווח ליניארי של זיהוי קורטיזול הוא שונה מאשר שימוש בתנאים הקודמים, מצביע על כך שתנאים אלה יכולים להיות מותאמים לרצוייםטווח גילוי. חומצת כולית ובקרות 2-methoxynaphthalene (2MNP) לא הניבו תגובה משמעותית (איורים 5 א-ב). חוקרים חייבים להיות מודעים לכך שצמצום זמני דגירה אלה עשויים להקל על תגובה מוגברת של analytes עם משטח AuNP, אשר יכול לתרום לאות כוללת משופרת (יעד) או רקע (מולקולות שאינם יעד). לכן, אפיון עיצוב assay וביצועים זהיר AuNP הוא הכרחי עבור כל זוג aptamer / יעד. הליך זה מתאר את פרוטוקול לבחירת aptamers קטנה מולקולה-מיתוג מבנה שפועלות בפלטפורמת biosensing כגון assay AuNP המתואר, הדורש שינוי קונפורמציה של DNA כדי לזהות הנוכחות של היעד. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות biosensor אחרות כגון אלקטרוכימיים או הקרינה המתפקדות באותה הנחת היסוד עבור כמעט כל יעד בגודל. כוחו של הפרוטוקול ניתן לפתח בניסוי נוסף על ידיכמה גישות. ראשית, הבחירה עצמה עשויה להיות שיפור פוטנציאלי על ידי חקירת שיטות של אופטימיזציה כגון קביעת T מ &#39;האידיאלי של הכלאה / ספריית cDNA המספקת אינטראקציה שהיא חלש מספיק כדי אינטראקציה עם יעד מולקולה קטן, אך חזק מספיק כדי להפחית את הכמות רקע רצפים dehybridized אך ורק מתרמודינאמיקה. זה לדחוס מספר המחזורים הנדרשים לבחירה, תוך חיסכון בזמן בעבודה והפחתת הצריכה מגיב. חקירות נוספות לשינויים בבחירה תהיה לקבוע את הריכוזים החיוביים ביותר של חרוזים ו- DNA, כך שאוכלוסייה מגוונת של רצפים חשופה ליעד, במיוחד בסיבוב הראשון. ההצלחה של ניסויי הוכחה של עיקרון אלה מספקת תשתית להשקיע משאבים נוספים לקראת אופטימיזציה והתאמת assay חיץ AuNP לנוזלים פיסיולוגיים. יש צורך לגיטימי לפלטפורמת biosensing מהירה, חזקה שיכול פוnction ככלי אבחון של המצב הפיזיולוגי של אדם, ופיתוח נוסף של assay AuNP בסרום אנושי, זיעה, או רוק יפגוש פער הנוכחי.

מולקולות קטנות כבר מזמן מוכרות כממלא תפקידים חיוניים בתהליכים ביולוגיים מגוונים כגון רעילות פיזיולוגית או תזונה, איתות תא, וטיפולי תרופות למחלות כמו 1. מולקולות קטנות שונות יש גם הציעו כסמנים ביולוגיים מעידים על תנאים פיסיולוגיים כוללים לחץ 2,3, עייפות 4, ומחלה 5. לדוגמא, רמות הקורטיזול גבוהות לתאם עם לחץ אשר עלול לגרום לביצועים פיסיולוגיים ירדו ומצבים בריאותיים אחרים 6-8. כמו כן, שינויים ביחסים של פפטידים מסוימים ברוק הם ניבוי של עייפות, שבו תופעות פיסיולוגיות כוללות חוסר הריכוז, זמן תגובה לקוי, ותפקוד הקוגניטיבי מופחת 4. לכן, הפיתוח של חיישנים ביולוגיים יעד ספציפי כדי לפקח על הרמות של מולקולות קטנות עשוי לספק מדד לא יסולא בפז להערכת יכולות בריאות וביצועים של individual. מבחינה הסטורית, גילוי מולקולה קטן שבוצע על ידי טכניקות הפרדה עתירת עבודה או על ידי הכרה מבוססת נוגדן 6,7. לאחרונה, aptamers חומצות גרעין 9,10 צמחה כאלמנטים הכרה בכך שיש יתרונות ברורים על פני נוגדנים ביישומים ספציפיים. עם היכולת שלהם להיקשר יעד שונה בגודל מיוני מתכת 11 לרקמות 12, aptamers כבר מיושמת באופן נרחב כאלמנטים הכרה בפלטפורמות biosensing 13,14. בהשוואה לנוגדנים, aptamers כימית מסונתזת, ולכן פשוט להציג שינויים כימיים לשחזור לקיבוע משטח או דיווח. ניתן לבחור Aptamers עם סגוליות גבוהות יעד בתנאים הרצויים על ידי שינוי תנאי הבחירה בשימוש, ואילו נוגדנים מוגבלים לתנאים פיסיולוגיים 15,16. בנוסף, aptamers מסוגלות צפיפות יגנד גבוהה יותר בשל הEIR גודל קטן יותר, וכתוצאה מכך היעד גבוה איתות יעילות על פלטפורמת biosensor, והיציבות המשופרת של aptamers מאפשרת שימוש חוזר ואחסון חיישן לטווח ארוך 16. Aptamers נוצרים באמצעות הליך המכונה SELEX, שבו ספרייה ראשונית של רצפים הוא התפתחה 10 13 -10 15 מולקולות ייחודיות לברכה סופית מועשרת המכילה מספר (10 1 -10 2) רצפים עם פוטנציאל לקשור מולקולת היעד. הבריכה מועשרת הסופית לאחר מכן רצף, וקבועי דיסוציאציה (ד K) מתקבלים ממחייבים מבחני של רצפי עותק המספר הגבוהים ביותר עם ​​מולקולת היעד. אבולוציה של הבריכה לאוכלוסייה מועשרת סופית במעקב על ידי ניטור אחוז הבריכה מחייבת היעד בכל סיבוב, עד העשרה המרבית מתקבלת. זה מתרחש על פני מספר סיבובי אבולוציוני, שבו רצפים מחייבים הינן מחיצות מnonbinders וamplified באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז (PCR). היכולת לחלק בצורה יעילה ולשמר קלסרים היא אחד מהגורמים העיקריים ליעילות של השפעות בחירה ובאופן ישיר את המאפיינים של aptamers נבחר 15. שלב מחיצות SELEX הוא מאתגר יותר עבור מולקולות קטנות כיוון שהם לא מחזיקים את הגודל או מגוון של קבוצות פונקציונליות המסייעות בתהליך חלוקת מטרות חלבון 1,15. לדוגמא, פלטפורמות מחיצות חלבון רבות מסתמכות על גודל או הפרדה מבוססת תשלום, עם זאת את המאפיינים של מתחמי יעד כרוכים DNA-קטן מולקולה הם בדרך כלל לא שונים באופן משמעותי מזה של רצפים בלתי מחייבים, וכתוצאה מכך לא יעילות מחיצות 1. שיטות מחיצות SELEX חלופיות עשויות להיות כרוכה בחוסר תנועה או תיוג של היעד, אשר באופן פוטנציאלי לשנות את המאפיינים המחייבים של מולקולה קטנה. כתוצאה מכך, עיצוב של הליך בחירה כדי ליצור aptamers למולקולה קטנה מטרות requires התייחסות מיוחדת. מגוון של שינויים הוחלו על המתודולוגיה SELEX המקורית כדי לשפר את יעילות החלוקה של ההליך, לשפר את הזיקה או סגוליות של הרצפים בבריכה הסופית, או להפוך אותו נוח יותר ליישומים שונים 15,16. שינוי SELEX אחד מסוגל בחירה למולקולות קטנות נועד ליצור aptamers-מיתוג מבנה, או aptamers שעובר שינוי קונפורמציה על אינטראקציה עם מולקולת יעד 17,18. בדוגמא אחת של שיטה זו, ספריית הכלאה לקטע קצר של DNA משלים לא מחייב (cDNA) משותק על חרוזים מגנטיים 17. על היעד מחייב, השינוי קונפורמציה של רצפי מחייב מאפשר להם dehybridize מcDNA, משחרר אותם לפתרון supernatant, בעוד nonbinders נותר הכלאה לcDNA / חרוזים מגנטיים למחיצות וזנוח. שיטה זו היא advantageous למולקולות קטנות, כי היא אינה דורשת קיבוע או תיוג של מולקולת היעד כדי להשיג הפרדה. Aptamers המסוגלים מבנה מיתוג יש תכונה רבת ערך עבור כל פלטפורמת biosensor פוטנציאלית שמחייבת שינוי במבנה aptamer כדי לזהות הנוכחות של מולקולת יעד. באופן ספציפי, ניתן לשלב aptamers עם חלקיקי זהב (AuNPs) כדי ליצור מבחני שפועלים על בסיס העיקרון-מיתוג המבנה לייצר תגובת colorimetric בנוכחות מולקולת היעד לאחר אתגר מלח 19,20. בassay AuNP, aptamer דנ&quot;א חד-גדילים (ssDNA) תחילה adsorbs אל פני השטח AuNP ומגן עליו מאתגר מלח. הנוכחות של היעד גורמת לשינוי קונפורמציה בaptamer שחושף את פני השטח AuNP, וכתוצאה מכך שינוי צבע אדום-כחול-לבא בנוסף מלח. AuNP מבחני גם הוכחו כדי להגביר אות, שבו aptamer זיקת מייקרוים יכול לזהות יעד בהזמנות רמות גודל נמוך מקבוע דיסוציאציה (ד K) 21. תכונה זו היא אטרקטיבית במיוחד למטרות מולקולה קטנות, שבו זיקות בדרך כלל נעות בין מייקרו הנמוך לריכוזי millimolar 1,15. בדרך כלל, assay הוא גם מהיר ופשוט יחסית לביצוע, עידוד מחקר נוסף של מבחני aptamer-AuNP כפלטפורמות גילוי biosensor. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול אוניברסלי לבחירת aptamers-מיתוג מבנה למולקולות קטנות עבור יישומי biosensing באמצעות קורטיזול סמן מתח כמולקולת נציג. ערכת זיהוי biosensor AuNP היא עניין בשל פשטותו של מבצע וקריאת colorimetric, אבל aptamers-מיתוג מבנה חלות על תפוקות פלטפורמת חישה חלופיות, כגון 22 אלקטרוכימיים או הקרינה 23 שגם מספקים זיהוי באמצעות שינוי בconformatio aptamern על היעד מחייב. בהשוואה לשיטות קודמות, צעדי סלקציה שליליים מרובים שולבו בעיצוב 17,18, וערכת זיהוי העשרה מבוססת UV פשוט יושמה (איור 1). פרוטוקול זה הוא בניגוד לתכנית איתור העשרת radioligand שימוש בשיטות מורשה 17. השיטה המוצעת גם שולבה עלייה באורך של בדיקות לכידת cDNA משמשות בבחירה כדי להגביר את יעילות מחיצות וביעילות מנגינה ההחמרה של מבחר לאחר העשרה מקסימלי נצפתה 24. העופרת מכוונת ההחמרה לשיעור כולל נמוך יותר של ה- DNA eluted על ידי היעד בבריכה הסופית, אבל הביאה למספרים גבוהים יותר של עותק רצף שקשרו עם זיקה משופרת בהשוואה לרצף מספר העותק הגבוה ביותר מסיבוב קודם. רצף מספר העותק הגבוה ביותר מהברכה האחרונה היה מוחל על assay AuNP כדי להמחיש כי הרצף היה נוח לפלטפורמהשדורש שינוי מבני כדי לציין יעד מחייב. assay החיץ מבוסס זה מראה כי התגובה של assay AuNP ניתן לשנות על ידי שינוי הצפיפות של DNA מוחל על פני השטח, ומשמש כהוכחה של עיקרון עבודה להקדיש מאמצי מחקר עתידיים לפיתוח חיישנים הביולוגיים AuNP מבוסס aptamer מולקולה קטנה ב נוזלים פיסיולוגיים.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td>תואם למגנט DynaMag-2</td></tr><tr><td>מגנט DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>תואם ל-Dynabeads M280 סטרפטווידין</td></tr><tr><td>סטרפטווידין ספרוז ביצועים גבוהים</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-01</td><td>זהו מוצר סטרפטווידין בצפיפות גבוהה להכנת ssDNA</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H4001</td><td>&ge; 98%</td></tr> <tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא</td><td>P0130</td><td>&ge; 99%</td></tr> <tr><td>חומצה כולית</td><td>Sigma</td><td>C1129</td><td>&ge; 98%</td></tr> <tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>הוחלף בדגם ND-2000</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>&ge; 99.9%</td></tr> <tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>&ge; 99.5%</td></tr> <tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>פלוקה</td><td>63068</td><td>&ge; 98%</td></tr><tr><td>500 מ"ל מערכת סינון</td><td>קורנינג</td><td>430769</td><td>0.22 ומיקרו; m תאית אצטט ממברנה</td></tr><tr><td>DNA</td><td>ספריית אופרון</td><td>מותאם אישית</td><td>HPLC מטוהר</td></tr><tr><td>כל שאר</td> בדיקות ופריימרים <td>ללכידה מותאמים אישית</td> של DNA <td>IDT</td><td>& #8212; מותפל; אפטאמרים &#8212; HPLC</td></tr><tr><td>תרמו-מיקסר &nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>R</td><td>כל דגם עם&nbsp; בקרת טמפרטורה ומהירות ערבוב יעבוד</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn</td><td>Agilent</td><td>600674</td><td>Taq polymerase ניתן להשתמש גם</td></tr><tr><td>בתערובת דאוקסינוקלאוטיד, PCR-Grade&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200415</td><td>מותגים אחרים יעבדו כאן</td></tr><tr><td>10x Pfu משובט DNA פולימראז מאגר</td><td>Agilent</td><td>200532</td><td>מאגר זה עבר אופטימיזציה עבור PfuUltra II פולימראז</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>9700</td><td>כל מודל המאפשר לחוקר לפתוח מכסה לאופטימיזציה של מחזור יעבוד</td></tr><tr><td>Agarose-LE</td><td>Ambion</td><td>AM9040</td><td>&ge; 99.9%</td></tr> <tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא</td><td>E-1510</td><td>רעילות חריפה, שאיפה; חשד לסרטן</td></tr><tr><td>עמודות סינתזה ריקות, 1 ומיקרו; m Expedite Style</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>דגם זה אידיאלי בגלל התאמת Luer-Lok לשילוב עם מזרק</td></tr><tr><td>החלפת מסננים Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>1 & micro; m גודל</td></tr><tr><td>Illustra NAP-25 עמודות</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0852-01</td><td>כל מותג עם עמוד סינון ג'ל שרף בדרגת DNA יעבוד</td></tr><tr><td>קלטת דיאליזה Slide-A-Lyzer קלטת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66205</td><td>2k MWCO בשימוש</td></tr><tr><td>זהב (III) כלוריד הידרט</td><td>סיגמא</td><td>254169</td><td>99.999% טוהר חשוב</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>SAFC</td><td>W302600</td><td>מצאנו כי התרכובת המיוצרת מיצרנים שונים משפיעה מאוד על מבחני AuNP</td></tr><tr><td>SpectraMax&nbsp;</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>M5</td><td>התוצאות היו דומות למערכת Bio-TEK</td></tr><tr><td>Synergy</td><td>Bio-TEK</td><td>HT</td><td>התוצאות היו דומות למערכת התקנים מולקולריים</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Amresco</td><td>J848</td><td>כל מותג שמייצר מוצר מעוקר יעבוד</td></tr><tr><td>250 מ"ל מערכת</td><td>סינון קורנינג</td><td>430767</td><td>0.22 ומיקרו; m קרום אצטט</td></tr><tr><td>תאית ספקטרופוטומטר UV</td><td>Varian</td><td>Cary 300&nbsp;</td><td>מותגים אחרים יעבדו כאן</td></tr><tr><td>מזרק 5 מ"ל</td><td>בקטון-דיקינסון</td><td>309646</td><td>דגם זה אידיאלי בגלל התאמת Luer-Lok לשילוב עם עמודת Expedite</td></tr><tr><td>ThermoEC Minicell Primo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EC320</td><td>תואם לספק</td></tr><tr><td>כוח ספק כוח</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB300</td><td>תואם ל-ThermoEC Minicell Primo</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>דליק נוזל</td></tr><tr><td>2-מתוקסינפתלין</td><td>סיגמא</td><td>148245</td><td>99%</td></tr> <tr><td>צלחת בדיקה</td><td>קורנינג</td><td>3370</td><td>96 בארות תחתית שטוחה, סטרילית</td></tr></tbody></table>

שיטה לבחירת aptamers מיתוג מבנה יישומית לcolorimetric זהב nanoparticle assay

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

מולקולות קטנות לספק מטרות עשירות עבור יישומי biosensing בשל ההשלכות הפיזיולוגיות שלהם כסמנים ביולוגיים של היבטים שונים של בריאות וביצועים אנושיים. aptamers חומצות גרעין יושמה יותר ויותר כאלמנטים הכרה בפלטפורמות biosensor, אבל בחירת aptamers למטרות מולקולה קטנות דורשת שיקולי עיצוב מיוחדים. עבודה זו מתארת ​​שינוי ושלבים קריטיים של שיטה שנועדה לבחור aptamers-מיתוג מבנה למטרות מולקולה קטנות. רצפים מחייבים מספריית ה- DNA הכלאה לבדיקות DNA לכידה משלימות בחרוזים מגנטיים מופרדים מnonbinders באמצעות שינוי מושרה יעד בקונפורמציה. שיטה זו יש יתרון משום שרצפים מחייבים מטריצת התמיכה (חרוזים) לא יהיו מוגברים יותר, והיא אינה דורשת קיבוע של מולקולת היעד. עם זאת, טמפרטורת ההתכה של חללית הלכידה והספרייה נשמר באו מעט מעל RT, כזה שלא רצפיםdehybridize הכובע מבוסס על תרמודינמיקה גם יהיה נוכח בפתרון supernatant. זה למעשה מגביל את יעילות המחיצות (יכולת היעד נפרד מחייבת רצפים מnonbinders), וסיבובי בחירה לכן רבים יידרשו כדי להסיר רצפי רקע. שיטת הדיווח שונה מבחירות aptamer-מיתוג מבנה קודם בגין יישום צעדי סלקציה שליליים, ניטור העשרה פשוטה, והארכת משך הבדיקה הלכידה הבאה העשרת מבחר לספק חומרה משופרת. Aptamers-מיתוג המבנה שנבחרה היא יתרון בפלטפורמת assay ננו-חלקיקי זהב שמדווחת על הנוכחות של מולקולת מטרה על ידי השינוי קונפורמציה של aptamer. Assay ננו-חלקיקי הזהב יושם משום שהוא מספק קריאה פשוטה, מהירה colorimetric כי הוא מועיל בסביבה קלינית או לפרוס. שיקולי עיצוב ואופטימיזציה מוצגים עבור assay כהוכחה של principlעבודת דואר במאגר לספק בסיס להרחבה נוספת של העבודה לקראת biosensing מולקולה הקטן בנוזלים פיסיולוגיים.

פרוטוקול מסופק לבחירת אפטמרים ממתגי מבנה עבור מטרות מולקולות קטנות בהתבסס על שיטת בחירת חרוזים מגנטיים קפדנית ניתנת לכוונון. אפטמרים שנבחרו עם תכונות מיתוג מבנה מועילים לבדיקות הדורשות שינוי קונפורמציה כדי לאותת על נוכחות מטרה, כגון בדיקת ננו-חלקיקי הזהב המתוארת.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לייצר apti בעלי השקפיה מבנית (structure switching) לשילוב כאלמנטים של זיהוי בפלטפורמות גילוי הפועלות באמצעות איתות על שינוי בקונפורמציה של האפטמר בעת קישור למטרה. מטרה זו מושגת על ידי הוספת גשש לכידה (capture probe) בביוטיניליציה וספריית DNA משלימה לחרוזי מגנט מצופים ב-strep tabin, כדי לקבע את ספריית ה-DNA על פני השטח של החרוזים. לאחר מכן, מפעילים מגנט על התמיסה כדי להפריד את רצפי הקישור מהרצפים שאינם נקשרים שנותרו על החרוזים.הרצפים שנשמרו מטהרים ולאחר מכן מוגברים עבור סבב הבחירה הבא. לאחר מספר סבבים של בחירה, מתווסף לתהליך שלב של בחירה שלילית. לאחר מספר סבבי בחירה, ה-aptr הנבחר מראה שינוי מבני בעת קישור למטרה, על בסיס בדיקה לזיהוי מטרה באמצעות ננו-חלקיקי זהב.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון תא X מבוסס תמיסה, הוא שאין צורך בקיבוע של המטרה לתמיכה מוצקה. לפיכך, המשמעויות של טכניקה זו הן בהערכת סיכונים של המצב הפיזיולוגי של הפרט, וזאת בשל העובדה שקורטיזול הוא מדד למתח, שעלול להוביל להערכת בעיות בריאותיות. השתמשו תמיד בתמיסות DNA שהוכנו טרי עבור פרוטוקול זה, ובמיוחד עבור המטרה והביקורת.הכנת ה-DNA דורשת תשומת לב מיוחדת. העבירו מנה של 100 µL מספריית ה-DNA למבחנה עבור תרמוסייקלר וחממו אותה בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות במיקסר תרמי. לאחר מכן, העבירו את המבחנה לקרח עד למועד השימוש; לפני השימוש ב-DNA זה, קבעו את ריכוזו המדויק באמצעות ספקטרופוטומטר.בשלב הבא, הכין את החרוזיים המגנטיים; בצע ערבול (vortex) לחרוזיים המגנטיים המצופים בסטרפטאווידין (streptavidin), והעבר 400 µL מהם למבחנה חדשה עבור מיקרו-צנטריפוגה. הנח את המבחנה על המגנט למשך שתי דקות והסר את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן שטוף את החרוזיים. הוסף 400 µL של תמיסת קישור (binding buffer) ובצע ערבול כדי להשלים את השטיפה.השתמש במגנט כדי להפריד את החרו지를 והשלך את הנוזל העליון. חזור על תהליך שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, קבע את גשש הלכידה (capture probe) על החרוזים המגנטיים.התחל בסיספנסיה של החרוצים ב-400 microliters של תמיסת קישור (binding buffer) המכילה 50 micromolar של פרוב לכידה (capture probe). לאחר מכן, דגרו את החרוצים במשך 10 דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר. כדי להסיר את פרוב הלכידה החופשי, שטפו את החרוצים שלוש פעמים נוספות כפי שבוצע קודם לכן, תוך שימוש ב-400 microliters של תמיסת קישור לכל שטיפה.לאחר שלושת השטיפות, יש להוסיף 400 µL נוספים של בופר ולאסוף 100 µL מתמיסת החרו지를 לשלבים הנותרים, תוך שמירת השאר בטמפרטורה של 4 °C. ניתן להשתמש בשארית לסבבי ברירה נוספים למשך עד שלושה שבועות. כאשר נדרשים חרוזים נוספים, ניתן להכינם עם גששים ארוכים יותר כדי להגביר את המחמירות בסכמת ברירה זו.לדוגמה, נעשה שימוש בגששים ארוכים יותר לאחר סבב 13, נקודה שבה הושג העשרה משמעותית באמצעות רמות מחמירות אחרות. בעת שימוש בחרוזים שהוצאו מאחסון, יש להתחיל בשטיפה של המנה המיועדת לעבודה פעמיים, תוך שימוש ב-200 µL של חוצץ קישור לכל שטיפה. אחרת, חרוזים שהוכנו טריים הם כבר נקיים.כעת יש להוסיף 100 µL של snap cool DNA לחרוזי ה-beads ולהדגיר אותם למשך חצי שעה בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב עדין. לאחר ההדגרה, יש לבודד את החרוזים לפני השליפת והשלכת הנוזל העליון (supernatant). חשבו את ריכוז ה-DNA כדי לקבוע כמות ה-DNA שנאגרה על החרוזים.בשלב הבא, שטפו את החרוצים שלוש פעמים עם 200 µL של תמיפת קישור (binding buffer). הניחו לתמיפת הקישור לשטוף את החרוצים תוך써 ערבוב עדין למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הכינו את מולקולת המטרה בתמיפת קישור בריכוז של 100 µM והשביו את החרוצים ב-200 µL מההכנה הזו, מולקולת המטרה.במקרה זה, קורטיזול הוא בדרך כלל בריכוז גבוה בסבב הבחירה הראשון. דגרו את החרוצים עם המטרה במשך חצי שעה עם ערבוב עדין בתנאי סביבה. לאחר הדגירה, שמרו את ה-snat המכיל את הרצפים המכוונים למטרה.בכל סיבוב שני של העשרה, קח דגימה מהעליון הסופי כדי לעקוב אחר התהליך. הסר את הקורטיזול מהעליון באמצעות דיאליזה. ניתן לדלג על שלב זה אם המולקולה המטרה אינה מפריעה למדידת בליעת DNA ב-260 ננומטר. לאחר כל סיבוב, הגבר את ה-DNA הקושר למטרה באמצעות PCR, תוך שימוש בעליון שנאסף משלב הברירה החיובית כתבנית.בשלב מקדימה, הרץ תמיד PCR בדיקה קטן כדי לקבוע את מספר ההגבלות האופטימלי. קח דגימות של 10 µL לאחר כל מחזור והשווה את הדגימות לסולם של 25 bp. במקרה זה, הספריה צריכה להופיע ב-85 bp; אם נראים תוצרי הגבלה לאחר המחזור ה-10, יש להשתמש במספר מחזורים קטן יותר.תוצאה זו עשויה להשתנות מסבב לסבב, ולכן תמיד נדרשת הרצה ניסיונית. לאחר מכן, בצעו PCR בקנה מידה גדול באמצעות מספר המחזורים שנבחר, תוך שימוש בשמונה מבחנות רצועה (strip tubes). הגבירו שש עד שמונה מיליליטר של תערובת תגובה כדי לקבל את כמות האמפליקון הנדרשת לסבב הברירה הבא, שהיא בין 1 ל-2.5 nanomoles של DNA.בצע בדיקה חוזרת של מדגם מתוצרי ה-PCR באמצעות ג'ל. לאחר מכן, המר את מרבית התוצרים ל-DNA גדיל יחיד באמצעות חרוזי strept מצופים שאינם מגנטיים. טען 300 microliters של חרוזים לתוך עמודה קטנה החסומה על ידי fritz.לאחר מכן, באמצעות מזרק עם חיבור Luer Lock, שטפו בעדינות את החרוזיים עם 5 mL של תמיפת קישור (binding buffer). בעת החלפת התמיסה לשטיפת העמודה, הסירו את המזרק מהעמודה והוציאו את הבוכנה מהמזרק. פעולה זו מונעת הפרעה מיותרת לחרוזיים.יש להכין ולשטוף מספיק עמודי חרוצים עבור מיליליטר אחד של תוצר PCR לכל עמוד. העבירו את תוצר ה-PCR דרך העמודים תוך הפעלת לחץ עדין. תוצרי ה-DNA יישמרו על ידי החרוצים באמצעות קישורי הגדילים האנטי-סנס שלהם.לאחר מכן, שטפו את עמודי ה-DNA הקשורים בחמישה מיליליטרים של תמיסת קישור (binding buffer) כדי להסיר את כל רכיבי ה-PCR, כך שיישאר רק ה-DNA של מאגר הקישור. כדי לבצע דה-היברידיזציה של ה-DNA מהעמוד, הוסיפו 0.5 מיליליטרים של sodium hydroxide בריכוז 0.2 molar. לאחר מכן, בצעו דסאלטיזציה (הסרת מלחים) ל-DNA הגומש ב-eluate באמצעות עמוד דסאלטיזציה שהוכן עם מים נטולי נוקלאס. השליכו את 0.5 המיליליטרים הראשונים של תמיסת השטיפה (flow through).לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) דרך העמודה כדי לאסוף את ה-DNA שהוסר ממנו המלח. מדדו את הבליעה (absorbance) של ה-DNA שנאסף והכינו אותו לסבב הבחירה הבא. כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, ה-DNA החד-גדילי שנאסף מתווסף כעת בחזרה למנת עבדים (beads) שהוכנה טרי עם גשש לכידה (capture probe).סבב הבחירה השני דומה לראשון, אך נעשה בו שימוש בריכוז קורטיזול נמוך יותר. עם זאת, החל מהסבב השלישי, שלבו שלב בחירה שלילית לפני הבחירה החיובית. עבור סבב הבחירה השלילית הראשון, הוסיפו לחרוזי הקישור 200 µL של פרוגסטרון בריכוז 1 µM בבופר קישור.מבנהו דומה אך שונה מזה של קורטיזול. בסבבים הבאים, הגדל את ריכוז הפרוגסטרון לאחר ניעור עדין של התערובת במשך חצי שעה בטמפרטורת החדר. השלף את העלייה ושטוף את החרו지를 פעמיים באמצעות 200 µL של תמיסת קישור (binding buffer).לאחר מכן המשיכו בברירה חיובית. כפי שתואר בעבר, ככל שהסבבים התקדמו, ריכוז הסובסטרט שונה כדי להשפיע על רמת המחמירות של תהליך הברירה. פרטים נוספים דנים בפרוטוקול הכתוב.בשלב הבא, פעלו לפי הפרוטוקול הכתוב לביצוע בדיקת ננו-חלקיקי זהב לזיהוי קורטיזול. קריאה קולורימטרית מהירה ופשוטה זו מסתמכת על שינוי מבני של האפטמר בעת קישור למטרה. לפיכך, היא מספקת מדד להערכת יכולתה של השיטה לבחור אברים בעלי תכונות של החלפת מבנה.יתרון נוסף של בדיקת ננו-חלקיקי הזהב הוא שהיא מגבירה את האות כך שניתן לזהות אפטמר בעל זיקה מיקרומולרית, הנפוץ במולקולות קטנות, ברמות הנמוכות בסדרי גודל מקבוע הפירוק. פרוטוקול הבחירה הבא שימש לבידוד abers ספציפיים לקורטיזול. ניטור דיאליזה והעשרה שימשו להדגמת עלייה באלוציה של מולקולת המטרה לאחר שלבי בחירה מאוחרים יותר.נצפתה ירידה באלוציה כאשר נעשה שימוש בכמות קטנה יותר של מולקולת המטרה ובפרובים לתפיסה ארוכים יותר בשלבים הסופיים. ריצוף דור הבא שימש לניתוח ה-DNA שנאלואה לאחר מספר סבבים שונים. בשלב מוקדם, לאחר סבב הבחירה השישי, אחוז נמוך של הרצפים הראה מספר עותקים מוגבר, אשר סווג ל-20 קבוצות (bins) לאחר 13 סבבים.אחוז גבוה בהרבה מה-abers היו במספר עותקים גבוה. לאחר מכן, על ידי הפיכת תהליך הברירה למחמיר יותר, ובסבבים 14 ו-15, כמעט מחצית מה-abers שנבחרו היו בדירוג הראשון של תדירות מספר העותקים.בשלב זה היו כ-3000 רצפים ייחודיים ב-30,000 הרצות. ה-AP שנבחר הודגר עם ננו-חלקיקי זהב, ולאחר מכן נוספו סובסטרטי מטרה או סובסטרטים של ביקורת לצורך השוואה. בדיקה זו הראתה כי ל-AP הייתה ספציפיות גבוהה יותר לקורטיזול מאשר לחומצה קולית או ל-במהלך ניסיון ביצוע הליך זה.חשוב לשלוט ברמת המחמירות של הברירה בכל סבב, וכן למטב את מספר מחזורי ה-PCR. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו בוחרים AP בעל מעבר מבני ומבצעים בדיקת זיהוי באמצעות ננו-חלקיקי זהב.

a-method-for-selecting-structure-switching-aptamers-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקולים Selex מהווים סבבים רבים של ברירה, שכל אחד מהם דורש התחדשות של ligands כבול, אשר בתורו דורשים רצפים פריימר קבוע איגוף האזורים ספריה אקראי. רצפים אלה תחל קבוע יכול להפריע בתהליך הבחירה (חיוביות שגויות תשלילים). כאן אנו מציגים פריימר ללא פרוטוקול.

פריימר ללא aptamer לבחירה באמצעות ספריית ה-DNA אקראיים

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת הבדיקה החיסונית הישירה המבוססת על ספקטרוסקופיית ראמאן לאיתור אנטיגני מטרה ספציפיים. הנוגדנים, אשר נספגים על פני השטח של ננו-חלקיקי זהב המחוברים לגשושיות ראמאן, מתקשרים עם אנטיגני מטרה ומייצרים ספקטרום ראמאן ספציפי, אשר מזוהה לאחר מכן.

בדיקה חיסונית ישירה מבוססת ספקטרוסקופיית ראמאן לזיהוי אנטיגן ספציפי

מוצג פרוטוקול לסינון תרופות מולקולרי קטן המבוסס על סינתזה באתרה של ננו-אשכולות זהב פלואורסצנטיים קטנים במיוחד (Au NCs) באמצעות חלבון טעון תרופות כתבנית. שיטה זו פשוטה לקביעת הזיקה של תרופות לחלבון מטרה על ידי אות פלואורסצנטי גלוי הנפלט מתבנית החלבון Au NCs.

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

העיצוב והפיתוח של assay colorimetric nanoparticle aptamer-זהב לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. בנוסף, יישום colorimetric חכם-התקן (אפליקציה) קיבלה תוקף ו אחסון לטווח ארוך של assay הוקמה לשימוש בתחום.

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

בדיקות אופטיות מבוססות ננו-חלקיקים תוכננו ככלי לזיהוי אנטיגנים באמצעות ספקטרוסקופיה של Raman ו-UV-Vis. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת בדיקות כאלה לבדיקה אימונולוגית של ספקטרוסקופיה UV-Vis/Raman באופן שישלב יכולות ריבוב עתידיות.

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

בעבודה זו, מוצג עבור שיפור האות של biosensing nanoprobe מבוססי פרוטוקול. הפרוטוקול מבוסס על ההפחתה של חומצה chloroauric על פני nanoprobes הקיים המורכבים של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל.

שיפור האות Nanoprobe מהירה על ידי באתרו בתוך Nanoparticle זהב סינתזה

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

פיתוח רצועה חיסונית של זרימה רוחבית לגילוי מהיר וכמותי של תרכובות מולקולות קטנות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכנולוגיית תיוג מיקרוסקופיית אלקטרונים ניתנת לשיבוט לגילוי חלבונים מתויגים במתכות בתאים באמצעות טכניקת סינתזת ננו-חלקיקי זהב חדשנית המבוססת על מנגנון דיכוי אוטו-נוקלציה.

סינתזה ישירה של ננו-חלקיקי זהב גלויים EM בתאים לניתוח לוקליזציה של חלבונים עם מבנה אולטרה שמור היטב

וידאו זה מדגים כיצד להשתמש C. elegans להעריך ניוון מוחיים נוירון דופאמין כמודל למחלת פרקינסון. יתר על כן, מסכי גנטית משמשות כדי לזהות גורמים או לשפר ניוון או neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

למדו שיטת בחירת aptamers מיתוג מבנה באמצעות חרוזים מגנטיים לזיהוי colorimetric של ננו-חלקיקי זהב. הפרוטוקול מאפשר זיהוי רגיש של מולקולות קטנות כמו קורטיזול למדידת מצבי מתח פיזיולוגיים.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

גלה סרטונים נוספים