שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay
February 28th, 2015
פרוטוקול מסופק לבחירת אפטמרים ממתגי מבנה עבור מטרות מולקולות קטנות בהתבסס על שיטת בחירת חרוזים מגנטיים קפדנית ניתנת לכוונון. אפטמרים שנבחרו עם תכונות מיתוג מבנה מועילים לבדיקות הדורשות שינוי קונפורמציה כדי לאותת על נוכחות מטרה, כגון בדיקת ננו-חלקיקי הזהב המתוארת.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור התאמה למיתוג מבנה לאינטגרציה כרכיבי זיהוי בפלטפורמות זיהוי המתפקדות על ידי איתות על שינוי באישור האפטמר בעת קשירת המטרה. זה מושג על ידי הוספת בדיקת לכידה ביוטינילית וספריית DNA משלימה לחרוזים מגנטיים מצופים טביל סטרפטוקוקוס כדי לשתק את ספריית ה-DNA על פני החרוזים. לאחר מכן, מגנט מוחל על התמיסה כדי לחלק את רצפי הכריכה מהרצפים הלא מחייבים שנותרו על החרוזים.
לאחר מכן הרצפים שנשמרו מטוהרים ומוגברים לסיבוב הבחירה הבא. לאחר מספר סבבי בחירה, שלב בחירה שלילי נוסף לתהליך. לאחר מספר סבבי בחירה, ה-aptr שנבחר מדגים שינוי מבני בקשירת המטרה על סמך בדיקת זיהוי מטרה של ננו-חלקיקי זהב.
היתרון של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו תא X מבוסס תמיסה, הוא שאיננו צריכים לשתק את המטרה לתמיכה מוצקה. אז ההשלכות של טכניקה זו הן בהערכת הסיכון של המצב הפיזיולוגי של האדם, וזה נובע מהעובדה שקורטיזול הוא אינדיקטור ללחץ, מה שיכול להוביל להערכת הבעיות הבריאותיות. השתמש תמיד בתמיסות DNA טריות שהוכנו עבור פרוטוקול זה, במיוחד עבור המטרה והבקרה.
הכנת הדנ"א דורשת תשומת לב מיוחדת. העבירו כמות של 100 מיקרוליטר מספריית ה-DNA לתוך צינור תרמו-ציקלר וחממו אותו בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות במיקסר תרמו. לאחר מכן העבירו את הצינור לקרח עד שיהיה צורך בו לפני השימוש ב-DNA זה קבעו את הריכוז המדויק שלו בספקטרופוטומטר.
לאחר מכן, הכינו את החרוזים המגנטיים, חרוזים מגנטיים מקודדים מערבולת, והעבירו 400 מיקרוליטר מהם לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. הנח את הצינור הזה על המגנט למשך שתי דקות והסר את הסופרנטנט, ואז שטוף את החרוזים. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב ומערבל אותם להשלמת הכביסה.
השתמש במגנט כדי להפריד את החרוזים ולהשליך את הסופרנטנט. חזור על תהליך כביסה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, שתק את בדיקת הלכידה על החרוזים המגנטיים.
התחל בהשעיית החרוזים ו-400 מיקרוליטר של מאגר קשירה עם בדיקת לכידה של 50 מיקרו-מולאר. לאחר מכן דגרו את החרוזים למשך 10 דקות בתסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. כדי להסיר את בדיקת הלכידה החופשית, שטפו את החרוזים שלוש פעמים נוספות כמו קודם, תוך שימוש ב-400 מיקרוליטר של מאגר מחייב לכל שטיפה.
לאחר שלוש השטיפות, הוסיפו עוד 400 מיקרוליטר של חיץ ואספו 100 מיקרוליטר תמיסת חרוזים לשלבים הנותרים תוך שמירת השאר בארבע מעלות צלזיוס. השאר יכול לשמש לסבבי בחירה עוקבים עד שלושה שבועות. כאשר יש צורך בחרוזים נוספים, ניתן להכין אותם עם בדיקות ארוכות יותר להחמרה מוגברת בתוכנית בחירה זו.
לדוגמה, נעשה שימוש בבדיקות ארוכות יותר לאחר סבב 13, ובשלב זה הושגה העשרה משמעותית באמצעות מחמירים אחרים. בעת שימוש בחרוזים שנלקחו מהאחסון, התחל בשטיפת האליקוט העובד פעמיים, תוך שימוש ב -200 מיקרוליטר של מאגר מחייב לכל שטיפה. אחרת, חרוזים טריים כבר נקיים.
כעת הוסיפו לחרוזים 100 מיקרוליטר של DNA קריר ודגרו אותם במשך חצי שעה בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה. לאחר הדגירה, בודדו את החרוזים לפני השלכת הסופרנטנט. חשב את ריכוז ה-DNA המכיל כדי לקבוע כמה DNA קשור לחרוזים.
לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מאגר כריכה. תן למאגר הכריכה לשטוף את החרוזים בתסיסה עדינה במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן הכינו את מולקולת המטרה במאגר קשירה ב-100 מיקרומולר והשעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של תכשיר זה, מולקולת המטרה.
במקרה זה, קורטיזול בדרך כלל מרוכז מאוד בסבב הבחירה הראשון. דגרו את החרוזים עם המטרה למשך חצי שעה עם תסיסה עדינה בתנאי הסביבה. לאחר הדגירה, שמור את החטיפה המכילה את הרצפים המרומזים על המטרה.
אחרי כל סבב העשרה שני, קחו דגימה מהסופרנטנט הסופי כדי לעקוב אחר תהליך הניטור. הסר את הקורטיזול מהסופרנטנט על ידי דיאליזה. ניתן לדלג על זה אם מולקולת המטרה אינה מפריעה למדידת ספיגת ה-DNA ב-260 ננומטר לאחר כל סיבוב, מגבירה את ה-DNA קושר המטרה על ידי PCR באמצעות הסופרנטנט שנאסף משלב הברירה החיובית כתבנית.
באופן ראשוני תמיד הפעל PCR בדיקה קטן כדי לקבוע את המספר האופטימלי של הגברות. קח 10 דגימות מיקרוליטר לאחר כל מחזור והשווה את הדגימות לסולם של 25 זוגות בסיסים. כאן, הספרייה צריכה לפעול ב-85 זוגות בסיסים על מוצרים מוגברים שנראים לאחר המחזור העשירי, ולכן יש להשתמש בפחות מחזורים.
תוצאה זו יכולה להשתנות מסיבוב לסיבוב, כך שתמיד יש צורך בריצת מבחן. לאחר מכן בצע PCR בקנה מידה גדול באמצעות מספר המחזורים שנבחר באמצעות שמונה צינורות רצועה. הגבירו שישה עד שמונה מיליליטר של תערובת תגובה כדי לקבל את הכמות הנדרשת של אמפליקון לסבב הבחירה הבא, שהוא בין 1 ל-2.5 ננומול של DNA.
בדוק שוב דגימה של מוצרי ה-PCR באמצעות ג'ל. לאחר מכן המר את עיקר המוצרים ל-DNA חד-גדילי באמצעות חרוזים מצופים סטרפט לא מגנטיים. טען 300 מיקרוליטר חרוזים לתוך עמוד קטן שנחסם על ידי פריץ.
לאחר מכן בעזרת מזרק נעילת פיתיון, שטפו בעדינות את החרוזים עם חמישה מיליליטר של מאגר כריכה. בעת החלפת התמיסה לשטיפת העמוד, הסר את המזרק מהעמוד והסר את הבוכנה מהמזרק. זה מונע הפרעה מיותרת של החרוזים.
צור ושטוף מספיק עמודות חרוזים עבור מיליליטר אחד של מוצר PCR לעמודה. העבירו מוצר PCR דרך העמודים באמצעות לחץ עדין. תוצרי ה-DNA יישמרו על ידי החרוזים המחוברים על ידי גדילי האנטי-סנס שלהם.
לאחר מכן שטפו את העמודות הקשורות ל-DNA עם חמישה מיליליטר של מאגר מחייב כדי להסיר את כל רכיבי ה-PCR, ולהשאיר רק את ה-DNA של מאגר הקישור כדי להכליא את ה-DNA מהעמודה להוסיף 0.5 מיליליטר של 0.2 נתרן הידרוקסיד מולארי. לאחר מכן מסירים את ה-DNA החד-גדילי ב-eit באמצעות עמוד התפלה שהוכן עם מים נטולי נוקלאז. השלך את 0.5 מיליליטר הזרימה הראשונית.
לאחר מכן העבירו מיליליטר אחד של מים נטולי נוקלאז דרך העמודה כדי לאסוף את ה-DNA המומלח. מדוד את ספיגת ה-DNA שנאסף והכין אותו לסבב הבחירה הבא. כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ה-DNA החד-גדילי שנאסף מתווסף כעת בחזרה לכמות חרוזים טרייה שהוכנה עם בדיקת לכידה.
סבב הבחירה השני דומה לראשון עם ריכוז קורטיזול נמוך יותר. עם זאת, החל מהסיבוב השלישי, שלבו שלב בחירה שלילית לפני הבחירה החיובית. לסבב הראשון של הבחירה השלילית, הוסף 200 מיקרוליטר של פרוגסטרון מיקרו-מולרי אחד במאגר קשירה לחרוזים.
הוא דומה מבחינה מבנית אך שונה מקורטיזול. בסבבים הבאים, הגדל את ריכוז הפרוגסטרון לאחר ניעור עדין של התערובת במשך חצי שעה בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופינטה ושטפו את החרוזים פעמיים באמצעות 200 מיקרוליטר ממאגר הכריכה.
לאחר מכן המשך בבחירה חיובית. כפי שתואר קודם לכן עם התקדמות הסבבים, ריכוז המצע השתנה כדי להשפיע על קפדנות תהליך הבחירה. הפרטים נידונים בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, עקוב אחר פרוטוקול הטקסט כדי לבצע את בדיקת ננו-חלקיקי הזהב לזיהוי קורטיזול. קריאה מהירה ופשוטה זו של מדדי צבע מסתמכת על שינוי מבני של האפטמר בעת קשירת המטרה. לפיכך, הוא מספק מדד להערכת יכולתה של השיטה לבחור אברים עם מאפייני מיתוג מבנה.
יתרון נוסף לבדיקת ננו-חלקיקי הזהב הוא שהיא מגבירה אות כך שניתן לזהות אפטמר זיקה מיקרו-מולרית המשותף למולקולות קטנות ברמות נמוכות בסדר גודל מקבוע הדיסוציאציה. פרוטוקול הברירה הבא שימש לבידוד אברים ספציפיים לקורטיזול. ניטור דיאליזה והעשרה שימשו כדי להראות פליטה מוגברת של מולקולת המטרה לאחר שלבי בחירה מאוחרים יותר.
ירידה בפליטה נצפתה כאשר נעשה שימוש בפחות מולקולת מטרה ובדיקות לכידה ארוכות יותר בשלבים הסופיים. ריצוף הדור הבא שימש לניתוח ה-DNA החמקמק לאחר מספר סבבים שונים. בשלב מוקדם לאחר סיבוב הבחירה השישי, אחוז נמוך מהרצפים הגדיל את מספר העותקים, שדורג ל-20 סלים לאחר 13 סיבובים.
אחוז גדול בהרבה מהאברסים היו במספר עותקים גבוה. לאחר מכן על ידי הפיכת תהליך הבחירה למחמיר יותר. בסבבים 14 ו-15, כמעט מחצית מהאייברים שנבחרו היו בדרגה הראשונה של תדירות מספר העותקים.
היו כ-3000 רצפים ייחודיים ב-30,000 ריצות בשלב זה. ה-AP שנבחר הודגר עם ננו-חלקיקי זהב ואחריו הוספת מטרה או מצעי בקרת השוואה. בדיקה זו הראתה של-AP יש יותר ספציפיות לקורטיזול מאשר לחומצה קולית או לניסיון הליך זה.
חשוב לשלוט בקפדנות הבחירה בכל סבב וכן לייעל את מספר מחזורי ה-PCR. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחור מבנה מחליף AP ולבצע בדיקת זיהוי ננו-חלקיקי זהב.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לבחירת אפטמרים משנים מבנה למטרות מולקולות קטנות באמצעות שיטת בחירה של חרוזים מגנטיים. האפטמרים שנבחרו מציגים שינויים קונפורמטיביים בעת קשירה למטרה, דבר שהוא יתרון עבור תהליכי זיהוי.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- כימיה אנליטית
רקע
- אפטמרים הם מולקולות DNA או RNA קצרות, חד-גדיליות שיכולות לקשור למטרות ספציפיות.
- אפטמרים משנים מבנה משנים את הקונפורמציה שלהם בעת קשירה למטרה, מה שמשפר את יכולות הזיהוי.
- תהליכי ננו-חלקיקי זהב משתמשים בשינויים קונפורמטיביים אלה לצורך איתות.
- שיטה זו מאפשרת זיהוי של מולקולות קטנות מבלי לייצב את המטרה.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לבחירת אפטמרים משנים מבנה.
- לשפר שיטות זיהוי למולקולות קטנות כמו קורטיזול.
- להעריך מצבים פיזיולוגיים על סמך מדדי לחץ.
שיטות ששימשו
- נעשה שימוש בגששים לכידה מצופים בביוטין ובספריית DNA משלימה עם חרוזים מגנטיים.
- נעשה שימוש בהפרדה מגנטית כדי לבודד רצפי קשירה משלא-קשרים.
- מבוצעות מספר סבבים של בחירה והגברה כדי להעשיר את האפטמרים הרצויים.
- תהליכי ננו-חלקיקי זהב משמשים כדי להדגים את תפקוד האפטמרים.
תוצאות עיקריות
- בחירה מוצלחת של אפטמרים המציגים שינויים מבניים בעת קשירה למטרה.
- הוכחה לאפקטיביות בזיהוי קורטיזול כמדד לחץ.
- הפרוטוקול מאפשר שימוש בפתרונות DNA שהוכנו טרי לתוצאות אופטימליות.
- העשרת האפטמרים משתפרת עם גששים ארוכים יותר ועם תנאי בחירה מחמירים יותר.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לבחירת אפטמרים משנים מבנה.
- אפטמרים אלו יכולים לשפר את הרגישות של תהליכי זיהוי למולקולות קטנות.
- לגישה יש יישומים פוטנציאליים בהערכות בריאות הקשורות לחץ.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables the selection of structure-switching aptamers for small molecule targets without target immobilization, supporting biosensor development for physiological biomarkers. The approach enhances predictive confidence in target validation by enriching aptamers that undergo conformational change upon binding, reducing false positives from non-specific bead interactions. It provides a reusable discovery workflow for assay development in early-stage drug discovery, particularly for targets like cortisol where rapid, colorimetric readout is valuable for decentralized testing. The protocol’s emphasis on negative selection and probe length extension improves stringency, aiding in lead identification by minimizing background sequences and enriching high-affinity binders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting aptamers that undergo target-induced conformational change, providing functional validation of binding specificity.
- Operational Value: Eliminates need for target immobilization, simplifying workflow and reducing artifacts from surface-based interactions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by enriching sequences with demonstrable structural switching, increasing confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates aptamers compatible with gold nanoparticle assays, enabling quantitative, colorimetric readout for high-throughput screening.
- Operational Value: Produces standardized binding pools through repeated selection and amplification, improving assay reproducibility across runs.
- Scalability: Extended capture probe length after enrichment increases stringency, supporting reuse of the selection platform for multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Selected aptamers demonstrate detection capability in buffer, providing a foundation for extension to physiological fluids like saliva or sweat.
- Biomarker Alignment: Cortisol detection aligns with stress-related biomarker monitoring, relevant for assessing physiological state in preclinical safety studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enrichment monitoring via elution and sequencing allows go/no-go decisions based on aptamer specificity and copy number frequency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from aptamer selection to functional assay development for small molecule detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating aptamers that reflect target-induced structural changes, clarifying binding mechanism and specificity.
- Screening: Delivers assay-ready aptamers with demonstrated performance in colorimetric formats, enabling reliable compound or ligand evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via gold nanoparticle signal shift, allowing comparison of binding conditions and enrichment progress.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through buffer-based proof-of-principle data, informing future adaptation to complex matrices.
- Enterprise Reuse: Magnetic bead selection with modifiable probe length creates a reusable platform for multiple small molecule targets, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by selecting aptamers with verifiable conformational switching, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through negative selection steps and defined washing protocols, minimizing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by enabling early assessment of aptamer functionality, reducing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through enrichment tracking and sequencing data, informing advancement based on copy number dominance and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, magnetic bead separation, and PCR optimization to avoid amplification bias.
- Dependent on magnetic separation equipment, thermocyclers, and spectrophotometry for DNA quantification and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of binding buffer conditions and negative selection compounds (e.g., progesterone) to ensure reproducibility.
- Adaptation to physiological fluids may require optimization of salt concentration and temperature to maintain aptamer stability and target binding.
- Practical limitation: Partitioning efficiency is constrained by keeping melting temperature near room temperature, necessitating multiple selection rounds to reduce background.
