שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay
28 בפברואר 2015
פרוטוקול מסופק לבחירת אפטמרים ממתגי מבנה עבור מטרות מולקולות קטנות בהתבסס על שיטת בחירת חרוזים מגנטיים קפדנית ניתנת לכוונון. אפטמרים שנבחרו עם תכונות מיתוג מבנה מועילים לבדיקות הדורשות שינוי קונפורמציה כדי לאותת על נוכחות מטרה, כגון בדיקת ננו-חלקיקי הזהב המתוארת.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור התאמה למיתוג מבנה לאינטגרציה כרכיבי זיהוי בפלטפורמות זיהוי המתפקדות על ידי איתות על שינוי באישור האפטמר בעת קשירת המטרה. זה מושג על ידי הוספת בדיקת לכידה ביוטינילית וספריית DNA משלימה לחרוזים מגנטיים מצופים טביל סטרפטוקוקוס כדי לשתק את ספריית ה-DNA על פני החרוזים. לאחר מכן, מגנט מוחל על התמיסה כדי לחלק את רצפי הכריכה מהרצפים הלא מחייבים שנותרו על החרוזים.
לאחר מכן הרצפים שנשמרו מטוהרים ומוגברים לסיבוב הבחירה הבא. לאחר מספר סבבי בחירה, שלב בחירה שלילי נוסף לתהליך. לאחר מספר סבבי בחירה, ה-aptr שנבחר מדגים שינוי מבני בקשירת המטרה על סמך בדיקת זיהוי מטרה של ננו-חלקיקי זהב.
היתרון של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו תא X מבוסס תמיסה, הוא שאיננו צריכים לשתק את המטרה לתמיכה מוצקה. אז ההשלכות של טכניקה זו הן בהערכת הסיכון של המצב הפיזיולוגי של האדם, וזה נובע מהעובדה שקורטיזול הוא אינדיקטור ללחץ, מה שיכול להוביל להערכת הבעיות הבריאותיות. השתמש תמיד בתמיסות DNA טריות שהוכנו עבור פרוטוקול זה, במיוחד עבור המטרה והבקרה.
הכנת הדנ"א דורשת תשומת לב מיוחדת. העבירו כמות של 100 מיקרוליטר מספריית ה-DNA לתוך צינור תרמו-ציקלר וחממו אותו בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות במיקסר תרמו. לאחר מכן העבירו את הצינור לקרח עד שיהיה צורך בו לפני השימוש ב-DNA זה קבעו את הריכוז המדויק שלו בספקטרופוטומטר.
לאחר מכן, הכינו את החרוזים המגנטיים, חרוזים מגנטיים מקודדים מערבולת, והעבירו 400 מיקרוליטר מהם לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. הנח את הצינור הזה על המגנט למשך שתי דקות והסר את הסופרנטנט, ואז שטוף את החרוזים. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב ומערבל אותם להשלמת הכביסה.
השתמש במגנט כדי להפריד את החרוזים ולהשליך את הסופרנטנט. חזור על תהליך כביסה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, שתק את בדיקת הלכידה על החרוזים המגנטיים.
התחל בהשעיית החרוזים ו-400 מיקרוליטר של מאגר קשירה עם בדיקת לכידה של 50 מיקרו-מולאר. לאחר מכן דגרו את החרוזים למשך 10 דקות בתסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. כדי להסיר את בדיקת הלכידה החופשית, שטפו את החרוזים שלוש פעמים נוספות כמו קודם, תוך שימוש ב-400 מיקרוליטר של מאגר מחייב לכל שטיפה.
לאחר שלוש השטיפות, הוסיפו עוד 400 מיקרוליטר של חיץ ואספו 100 מיקרוליטר תמיסת חרוזים לשלבים הנותרים תוך שמירת השאר בארבע מעלות צלזיוס. השאר יכול לשמש לסבבי בחירה עוקבים עד שלושה שבועות. כאשר יש צורך בחרוזים נוספים, ניתן להכין אותם עם בדיקות ארוכות יותר להחמרה מוגברת בתוכנית בחירה זו.
לדוגמה, נעשה שימוש בבדיקות ארוכות יותר לאחר סבב 13, ובשלב זה הושגה העשרה משמעותית באמצעות מחמירים אחרים. בעת שימוש בחרוזים שנלקחו מהאחסון, התחל בשטיפת האליקוט העובד פעמיים, תוך שימוש ב -200 מיקרוליטר של מאגר מחייב לכל שטיפה. אחרת, חרוזים טריים כבר נקיים.
כעת הוסיפו לחרוזים 100 מיקרוליטר של DNA קריר ודגרו אותם במשך חצי שעה בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה. לאחר הדגירה, בודדו את החרוזים לפני השלכת הסופרנטנט. חשב את ריכוז ה-DNA המכיל כדי לקבוע כמה DNA קשור לחרוזים.
לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מאגר כריכה. תן למאגר הכריכה לשטוף את החרוזים בתסיסה עדינה במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן הכינו את מולקולת המטרה במאגר קשירה ב-100 מיקרומולר והשעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של תכשיר זה, מולקולת המטרה.
במקרה זה, קורטיזול בדרך כלל מרוכז מאוד בסבב הבחירה הראשון. דגרו את החרוזים עם המטרה למשך חצי שעה עם תסיסה עדינה בתנאי הסביבה. לאחר הדגירה, שמור את החטיפה המכילה את הרצפים המרומזים על המטרה.
אחרי כל סבב העשרה שני, קחו דגימה מהסופרנטנט הסופי כדי לעקוב אחר תהליך הניטור. הסר את הקורטיזול מהסופרנטנט על ידי דיאליזה. ניתן לדלג על זה אם מולקולת המטרה אינה מפריעה למדידת ספיגת ה-DNA ב-260 ננומטר לאחר כל סיבוב, מגבירה את ה-DNA קושר המטרה על ידי PCR באמצעות הסופרנטנט שנאסף משלב הברירה החיובית כתבנית.
באופן ראשוני תמיד הפעל PCR בדיקה קטן כדי לקבוע את המספר האופטימלי של הגברות. קח 10 דגימות מיקרוליטר לאחר כל מחזור והשווה את הדגימות לסולם של 25 זוגות בסיסים. כאן, הספרייה צריכה לפעול ב-85 זוגות בסיסים על מוצרים מוגברים שנראים לאחר המחזור העשירי, ולכן יש להשתמש בפחות מחזורים.
תוצאה זו יכולה להשתנות מסיבוב לסיבוב, כך שתמיד יש צורך בריצת מבחן. לאחר מכן בצע PCR בקנה מידה גדול באמצעות מספר המחזורים שנבחר באמצעות שמונה צינורות רצועה. הגבירו שישה עד שמונה מיליליטר של תערובת תגובה כדי לקבל את הכמות הנדרשת של אמפליקון לסבב הבחירה הבא, שהוא בין 1 ל-2.5 ננומול של DNA.
בדוק שוב דגימה של מוצרי ה-PCR באמצעות ג'ל. לאחר מכן המר את עיקר המוצרים ל-DNA חד-גדילי באמצעות חרוזים מצופים סטרפט לא מגנטיים. טען 300 מיקרוליטר חרוזים לתוך עמוד קטן שנחסם על ידי פריץ.
לאחר מכן בעזרת מזרק נעילת פיתיון, שטפו בעדינות את החרוזים עם חמישה מיליליטר של מאגר כריכה. בעת החלפת התמיסה לשטיפת העמוד, הסר את המזרק מהעמוד והסר את הבוכנה מהמזרק. זה מונע הפרעה מיותרת של החרוזים.
צור ושטוף מספיק עמודות חרוזים עבור מיליליטר אחד של מוצר PCR לעמודה. העבירו מוצר PCR דרך העמודים באמצעות לחץ עדין. תוצרי ה-DNA יישמרו על ידי החרוזים המחוברים על ידי גדילי האנטי-סנס שלהם.
לאחר מכן שטפו את העמודות הקשורות ל-DNA עם חמישה מיליליטר של מאגר מחייב כדי להסיר את כל רכיבי ה-PCR, ולהשאיר רק את ה-DNA של מאגר הקישור כדי להכליא את ה-DNA מהעמודה להוסיף 0.5 מיליליטר של 0.2 נתרן הידרוקסיד מולארי. לאחר מכן מסירים את ה-DNA החד-גדילי ב-eit באמצעות עמוד התפלה שהוכן עם מים נטולי נוקלאז. השלך את 0.5 מיליליטר הזרימה הראשונית.
לאחר מכן העבירו מיליליטר אחד של מים נטולי נוקלאז דרך העמודה כדי לאסוף את ה-DNA המומלח. מדוד את ספיגת ה-DNA שנאסף והכין אותו לסבב הבחירה הבא. כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ה-DNA החד-גדילי שנאסף מתווסף כעת בחזרה לכמות חרוזים טרייה שהוכנה עם בדיקת לכידה.
סבב הבחירה השני דומה לראשון עם ריכוז קורטיזול נמוך יותר. עם זאת, החל מהסיבוב השלישי, שלבו שלב בחירה שלילית לפני הבחירה החיובית. לסבב הראשון של הבחירה השלילית, הוסף 200 מיקרוליטר של פרוגסטרון מיקרו-מולרי אחד במאגר קשירה לחרוזים.
הוא דומה מבחינה מבנית אך שונה מקורטיזול. בסבבים הבאים, הגדל את ריכוז הפרוגסטרון לאחר ניעור עדין של התערובת במשך חצי שעה בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופינטה ושטפו את החרוזים פעמיים באמצעות 200 מיקרוליטר ממאגר הכריכה.
לאחר מכן המשך בבחירה חיובית. כפי שתואר קודם לכן עם התקדמות הסבבים, ריכוז המצע השתנה כדי להשפיע על קפדנות תהליך הבחירה. הפרטים נידונים בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, עקוב אחר פרוטוקול הטקסט כדי לבצע את בדיקת ננו-חלקיקי הזהב לזיהוי קורטיזול. קריאה מהירה ופשוטה זו של מדדי צבע מסתמכת על שינוי מבני של האפטמר בעת קשירת המטרה. לפיכך, הוא מספק מדד להערכת יכולתה של השיטה לבחור אברים עם מאפייני מיתוג מבנה.
יתרון נוסף לבדיקת ננו-חלקיקי הזהב הוא שהיא מגבירה אות כך שניתן לזהות אפטמר זיקה מיקרו-מולרית המשותף למולקולות קטנות ברמות נמוכות בסדר גודל מקבוע הדיסוציאציה. פרוטוקול הברירה הבא שימש לבידוד אברים ספציפיים לקורטיזול. ניטור דיאליזה והעשרה שימשו כדי להראות פליטה מוגברת של מולקולת המטרה לאחר שלבי בחירה מאוחרים יותר.
ירידה בפליטה נצפתה כאשר נעשה שימוש בפחות מולקולת מטרה ובדיקות לכידה ארוכות יותר בשלבים הסופיים. ריצוף הדור הבא שימש לניתוח ה-DNA החמקמק לאחר מספר סבבים שונים. בשלב מוקדם לאחר סיבוב הבחירה השישי, אחוז נמוך מהרצפים הגדיל את מספר העותקים, שדורג ל-20 סלים לאחר 13 סיבובים.
אחוז גדול בהרבה מהאברסים היו במספר עותקים גבוה. לאחר מכן על ידי הפיכת תהליך הבחירה למחמיר יותר. בסבבים 14 ו-15, כמעט מחצית מהאייברים שנבחרו היו בדרגה הראשונה של תדירות מספר העותקים.
היו כ-3000 רצפים ייחודיים ב-30,000 ריצות בשלב זה. ה-AP שנבחר הודגר עם ננו-חלקיקי זהב ואחריו הוספת מטרה או מצעי בקרת השוואה. בדיקה זו הראתה של-AP יש יותר ספציפיות לקורטיזול מאשר לחומצה קולית או לניסיון הליך זה.
חשוב לשלוט בקפדנות הבחירה בכל סבב וכן לייעל את מספר מחזורי ה-PCR. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחור מבנה מחליף AP ולבצע בדיקת זיהוי ננו-חלקיקי זהב.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבחירת אפטמרים בעלי שינוי מבני (structure-switching aptamers) עבור מולקולות מטרה קטנות, באמצעות שיטת ברירה המבוססת על חרוזי מגנט. האפטמרים שנבחרו מראים שינויים קונפורמציונליים בעת קישור למטרה, דבר המהווה יתרון עבור בדיקות זיהוי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- כימיה אנליטית
רקע
- אפטמרים הם מולקולות קצרות של DNA או RNA בעלות גדיל בודד, המסוגלות להיקשר למטרות ספציפיות.
- אפטמרים בעלי מעבר מבני משנים את הקונפורמציה שלהם בעת קישור למטרה, ובכך משפרים את יכולות הגילוי.
- בדיקות המבוססות על ננו-חלקיקי זהב מנצלות שינויים קונפורמציונליים אלה לצורך אותות.
- שיטה זו מאפשרת גילוי של מולקולות קטנות ללא צורך בקיבוע של המטרה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לבחירת אפטמרים בעלי שינוי מבני (structure-switching aptamers).
- שיפור שיטות זיהוי של מולקולות קטנות, כגון cortisol.
- הערכת מצבים פיזיולוגיים על בסיס מדדי סטרס.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גששים ללכידה בביוטיניזציה וספריית DNA משלימה משמשים יחד עם חרוזי מגנט.
- הפרדה מגנטית מועסקת כדי לבודד רצפי קישור מרצפים שאינם נקשרים.
- סבבים מרובים של ברירה והגברה מבוצעים כדי להעשיר את האפטמרים הרצויים.
- בדיקות ננו-חלקיקי זהב מועסקות כדי להדגים את התפקוד של האפטמרים.
תוצאים עיקריים
- בחירה מוצלחת של אפטמרים המציגים שינויים מבניים בעת קישור למטרה.
- יעילות מוכחת בזיהוי קורטיזול כסמן למצבי לחץ.
- הפרוטוקול מאפשר שימוש בתמיסות DNA שהוכנו טרי כדי להשיג תוצאות אופטימליות.
- העשרה של אפטמרים משתפרת עם שימוש בגששים ארוכים יותר ועל ידי הגברת המחומרות (stringency).
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לבחירת אפטמרים בעלי שינוי מבני (structure-switching aptamers).
- אפטמרים אלו יכולים להגביר את הרגישות של בדיקות לזיהוי מולקולות קטנות.
- לגישה זו פוטנציאל ליישומים בהערכות בריאות הקשורות למצבי לחץ.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
שיטה זו מאפשרת בחירה של אפטמרים בעלי שינוי מבני (structure-switching aptamers) עבור מטרות של מולקולות קטנות ללא קיבוע של המטרה, ובכך תומכת בפיתוח ביו-חיישנים עבור סממנים פיזיולוגיים. הגישה מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי העשרה של אפטמרים שעוברים שינוי קונפורמציוני בעת קישור, ובכך מפחיתה תוצאות חיוביות כוזבות הנובעות מאינטראקציות לא ספציפיות עם חרוזיים. היא מספקת זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לגילוי לצורך פיתוח בדיקות בשלבים מוקדמים של פיתוח תרופות, ובמיוחד עבור מטרות כמו קורטיזול, שבהן קריאה קולורימטרית מהירה היא בעלת ערך לבדיקות מבוזרות. הדגש של הפרוטוקול על ברירה שלילית והארכת אורך הגשש משפר את רמת המחומריות, ומסייע בזיהוי מובילים (leads) על ידי מזעור רצפי רקע והעשרת קושרים בעלי זיקה גבוהה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי בחירת אפטמרים העוברים שינוי קונפורמציונלי המושרה על ידי המטרה, ובכך מספק תיקוף פונקציונלי של ספציפיות קישור.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בקיבוע המטרה, מה שמפשט את זרימת העבודה ומפחית ארטיפקטים הנובעים מאינטראקציות מבוססות שטח פנים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי העשרה של רצפים בעלי יכולת מוכחת למעבר מבני, ובכך מגביר את הביטחון במעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יצירת אפטמרים התואמים לבדיקות המבוססות על ננו-חלקיקי זהב, המאפשרים קריאה כמותית וקולורימטרית לסריקה בספיק גבוה.
- ערך תפעולי: הפקת מאגרי קישור סטנדרטיים באמצעות סבבים חוזרים של ברירה והגברה, מה שמשפר את השחזוריות של הבדיקה בין הרצות שונות.
- قابיליות הרחבה: הארכת אורך גשש הלכידה לאחר ההעשרה מגבירה את הרגישות (stringency), ובכך תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמת הברירה עבור מטרות מרובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: אפטמרים נבחרים מדגימים יכולת זיהוי בבופר, ובכך מספקים בסיס להרחבה לנוזלים פיזיולוגיים כגון רוק או זיעה.
- התאמה לסמנים ביולוגיים: זיהוי קורטיזול תואם לניטור סמנים ביולוגיים הקשורים למתח, דבר הרלוונטי להערכת המצב הפיזיולוגי במחקרי בטיחות פרה-קליניים.
- קידום מותאם סיכונים: ניטור העשרה באמצעות אלucian וריצוף מאפשר קבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) בהתבסס על ספציפיות האפטמר ותדירות מספר העותקים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת התקדמות מבחירת אפטמרים לפיתוח בדיקה תפקודית לזיהוי מולקולות קטנות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי בידוד אפטמרים המשקפים שינויים מבניים המודעים על ידי המטרה, ובכך מבהירה את מנגנון הקישור והספציפיות.
- סריקה: מספקת אפטמרים המוכנים לבדיקה עם ביצועים מוכחים בפורמטים קולורימטריים, המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות או ליגנדים.
- אנליטיקה: מספקת פלטים כמותיים באמצעות הסטה של אות מננו-חלקיקי זהב, המאפשרת השוואה של תנאי קישור והתקדמות ההעשרה.
- מחקר תרגומי: מקשרת לזרימות עבודה פרה-קליניות באמצעות נתוני הוכחת היתכנות מבוססי בופר, המכוונים התאמה עתידית למטריצות מורכבות.
- שימוש חוזר ארגוני: בחירה באמצעות חרוזי מגנט עם אורך גשש ניתן לשינוי יוצרת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מספר מטרות של מולקולות קטנות, ובכך מפחיתה את מאמצי הפיתוח מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה באמצעות בחירת אפטמרים בעל יכולת מעבר קונפורמציוני הניתנת לאימות, ובכך מפחית עמימות מנגנונית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות שלבי ברירה שלילית ופרוטוקולי שטיפה מוגדרים, מה שממזער את השונות בין סדרות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות בקבלת החלטות של go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של התפקוד האפטמרי, ובכך מפחית השקעה במועמדים שאינם ברי-ביצוע.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים באמצעות מעקב אחר העשרה ונתוני ריצוף, ומספק בסיס לקידום המבוסס על דומיננטיות של מספר עותקים וספציפיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחומצות גרעין, הפרדה באמצעות חרוזי מגנט ואופטימיזציה של PCR כדי למנוע הטיות בהגברה.
- תלוי בציוד הפרדה מגנטית, תרמוסייקלרים וספקטרופוטומטריה לצורך כימות DNA ובקרת איכות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי באפר הקישור ותרכובות לברירה שלילית (למשל, progesterone) כדי להבטיח שחזוריות.
- התאמה לנוזלים פיזיולוגיים עשויה לדרוש אופטימיזציה של ריכוז המלח והטמפרטורה כדי לשמור על יציבות האפטאמר ועל הקישור למטרה.
- מגבלה מעשית: יעילות החלוקה מוגבלת בשל הצורך לשמור על טמפרטורת ההמסה קרוב לטמפרטורת החדר, מה שמחייב סבבי ברירה מרובים להפחתת הרקע.
