Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג ולשנות תאים בודדים של הבליטה המשוננת ולעקוב אחר התפתחותם. זה מושג על ידי הזרקת DNA תחילה להמיספרה אחת של המוח ביום העוברי, 15.5 או 18.5. השלב השני הוא אלקטרופוטציה של ה-DNA המוזרק לאזור הבליטה המשוננת המתפתחת.

לאחר מכן מכינים את חלקי המוח באמצעות ויברטור, ופרוסות המוח נשמרות בתרבית עד 14 יום. השלב האחרון הוא צביעה אימונו-פלואורסצנטית של פרוסות המוח באמצעות נוגדנים מתאימים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית משמשת להצגת שינויים בתאי הגרגיר ששונו של הפיתול המשונן.

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחומי נוירוביולוגיה, כגון תפקידם של גנים מסוימים בהתפתחות של תאי עצב ספציפיים באזורי מוח שונים. במקרה שלנו, גורם שעתוק BC 11 B בהתפתחות פיתול. התחל את ההליך על ידי ניתוח הרחם של עכבר שעבר המתת חסד, המכיל את העוברים.

מניחים אותו בצלחת פטרי המכילה 15 עד 20 מיליליטר HBSS שלם קר על קרח. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי להפריד כל עובר מקרן הרחם. לאחר מכן הניחו אותו בצלחת פטרי שנייה המכילה HBSS שלם וקר תחת מיקרוסקופ מנתח, חתכו את דופן שריר הרחם.

שחררו בזהירות את העובר משק החלמון והשליה. לאחר מכן. השתמש במספריים כדי לערוף את ראשי העוברים ממש מעל הצלעים הקדמיות בזווית של 60 מעלות.

אם הניסוי דורש גנוטיפ של העוברים, אסוף דגימת רקמה לבידוד DNA גנומי. לאחר מכן מעבירים את הראש לצלחת פטרי נקייה ויבשה. מכיוון שראשו של הראש נערף בזווית של 60 מעלות, הוא אמור להטות לצד אחד כאשר הוא מונח בצד הגב כלפי מעלה.

כעת הניחו מחט בזהירות באמצע חצי הכדור, קרוב ל-bgma. הזרקו כשניים עד שלושה מיקרוליטרים של תמיסת DNA על ידי דריכה על דוושת הפיקו שפריצר. שלוש, תוך שימוש ב-30 פאונד של לחץ למשך 10 עד 15 אלפיות השנייה לכל פולס.

הפעלת חמישה עד שמונה פולסים עם שנייה אחת בין פולסים. לפני הנחת האלקטרודות, יש למרוח כמה טיפות של HBSS מלא על ראש העובר O.לאחר מכן הניחו את האלקטרודות בצורה כזו שהמסוף השלילי נמצא באותו צד הוא החדר המוזרק והאלקטרודה החיובית בצד הנגדי של החדר המוזרק מתחת לאוזן ראש העובר. לאחר מכן, החל חמישה פולסים של 50 וולט.

לאחר אלקטרופורציה. מניחים את ראש העובר בכלי המכיל 15 עד 20 מיליליטר תמיסת HBSS שלמה קרה. מקלפים את העור מראש העובר.

לאחר מכן בצע חתך קטן באמצע המוח הקטן בקו האמצע של הגולגולת. הכנס את מספרי הקפיץ לחתך וחתוך לאורך התפר הסגיטלי. מקלפים את הגולגולת ומנתקים את המוח ממנה.

בינתיים יוצקים 4% LMP aros לתבנית מתקלפת ומקלפים אותה בטמפרטורת החדר. הוציאו את המוח מה-HBSS השלם על ידי מרית סקופ קטנה ורוקנו את עודפי ה-HBSS עם נייר טישו עדין או מגבון כימי. הניחו את כל המוח בעדינות לתוך ורדי האגר והתאימו את מיקומו בעזרת מחט דקה.

שמור את התבנית על קרח עד שושנת האגר מתמצקת והבלוק נחתך. כעת חתוך את בלוק האגרוס LMP והדביק אותו לשלב הדגימה באמצעות דבק סופר. לאחר שהדבק יבש, העבירו את שלב הדגימה למגש החיץ של הוויברטור.

מלאו אותו ב- HBSS קר כקרח עד שהבלוק טובל בתמיסה. כדי להתכונן לחתך, הגדר את הוויברטור להגדרות המתאימות. חותכים את החלקים המכילים את הרקמה הרצויה במהירות איטית, החל מהמוח האחורי, ואוספים חמישה עד שבעה חלקים מהמוח.

לאחר מכן העבירו את החלקים לכלי תרבית נקי של שש בארות המכיל חמישה מיליליטר קר כקרח, השלימו את HBSS ושמרו אותו על קרח עד שכל החלקים נאספים. לאחר מכן מניחים את תוספות הממברנה לצלחת שש בארות המכילה 1.8 מיליליטר מדיום תרבית פרוסות. הרטיבו את הממברנה בצורה צולבת עם 100 מיקרוליטר של HBSS שלם לפני הנחת החלקים על הממברנה על מנת להקל על כיוון החלקים.

לאחר מכן, העבירו את החלקים אל הממברנה. הניחו עד חמישה חלקים על קרום אחד, ואל תחפפו את החלקים זה עם זה. הסר את עודפי HBSS מהקרום באמצעות פיפטה.

דגרו את צלחת התרבות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 11 או 14 יום במבחנה והחליפו מחצית מהמדיום כל יומיים. בשלב זה, הוסף ריאגנטים כגון ברומו דאוקסיורידין לתיוג תאים מתרבים למדיה במשך 20 השעות הראשונות של זמן התרבית. בשלב זה, השתמש בלהב אזמל נקי וחד כדי לקצץ את הממברנה בהתאם לכיוון החלקים.

העבירו את החלקים יחד עם הממברנה לצלחת של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של 4% PFA ודגרו את החלקים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים עם XPBS אחד למשך 15 דקות בכל כביסה. לאחר מכן דגרו את החלקים למשך הלילה עם תמיסה חדירה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה למחרת, דגרו על החלקים עם הנוגדנים הראשוניים המתאימים, תמיסה מדוללת וחדירה למשך הלילה או למשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.

לאחר מכן, שטפו את החלקים שלוש פעמים במשך 15 דקות עם XPBS אחד ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם הנוגדנים המשניים המתאימים, תמיסה מדוללת וחדירה. לאחר הדגירה יש לשטוף את החלקים פעם אחת עם XPBS אחד למשך 15 דקות, ולאחר מכן מכתים דפים למשך 10 דקות בסוף, לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם XPBS אחד למשך 15 דקות כל אחד ולהעביר לשקופיות המיקרוסקופ. הוסף תושבת חיסונית ובעדינות.

הנח החלקה על גבי החלקים. יבש את השקופיות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ואוטם עם לק לפני ניתוחן במיקרוסקופיה קונפוקלית. מוצגת כאן הזרקת דנ"א המבטא GFP להמיספרה אחת, ואחריה צביעה חיסונית ביום 18.5 לאחר אלקטרופורציה.

תמונה זו מציגה את צביעת ה-DPI של GFP מוצגת בתמונה זו והתמונה הממוזגת מוצגת כאן. איור זה מציג את מחיקת הפסיפס של BCL 11 B על ידי רחם X, אלקטרופורציה, ואחריה פרוסה אורגנוטיפית. קטעי תרבית הוכתמו במערכת החיסון על ידי שימוש בנוגדנים, זיהוי GFP ו-NeuroD, השיבוצים המציגים GFP ו-BCL L 11 B. צביעה בהגדלה גבוהה יותר מדגימה את אובדן ביטוי BCL 11 B בתאים המבטאים Cree recombinase.

להלן הניתוח הסטטיסטי של תאים חיוביים GFP, נוירו-D ו-GFP. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו שעתיים וחצי לארבעה עוברים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל ברקמות בזהירות ולהימנע מזיהום.