Busulfan כסוכן Myelosuppressive ליצירת ברמה גבוהה יציבה מח עצם chimerism בעכברים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחליף את מדול העצם בעכברי מקבל בעזרת תאי מדול עצם מעכברי תורם המבטאים באופן גלובלי חלבון פלואורסצנטי ירוק. בהיעדר הקרנה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת העכבר המקבל באמצעות הזרקות תוך-peritoneal סדרתיות של התרכובת המדכאת מיילואידים busulfan.

בשלב הבא, תאי מוח עצם מבודלים מהפמור ומטיביה של עכבר תורם המבטא באופן גלובלי חלבון פלואורסצנטי ירוק. לבסוף, תאי מוח העצם של התורם מושתלים בעכבר המקבל שעבר התניה באמצעות הזרקה לווריד הזנב. בסופו של דבר, נאסף דם מהעכבר שעבר השתלה והוא מנותח באמצעות ציטומטריה עם זרימה כדי להעריך את מידת התחלופה של מוח העצם.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הקרנה של כל הגוף, הם שניתן להשיג רמה גבוהה של דה-סלולריזציה של מח העצם ללא ההשפעות הציטוטוקסיות של הקרנה של כל הגוף וללא צורך במתקנים ובציוד מיוחדים. שיטה זו אינה מאפשרת רק הבנה של הצטברות תאים ממח העצם במערכת העצבים המרכזית, אלא היא יכולה לשמש גם לחקר נושאי מחקר כגון התפתחות שושלות המטופואטיות, אימונוביולוגיה ולוקמיה. כדי להכין עכברים מקבלים, הכין בוסולפן מדולל בהתאם לפרוטוקול הכתוב והשתמש בהזרקה IP כדי למתן 20 milligrams per kilogram לעכברים מקבלים מדי יום.

לאחר קטילת העכברים בהתאם להנחיות המוסדיות, תחת מנשף זרימה למינרית, רסס את העכבר ב-70% ethanol. הרם את העור באזור הבטן ובאמצעות מספריים כירורגיים, בצע חתך דרך העור מחלל הבטן, מעלה לאורך הרגל לכיוון הקרסול תוך כדי החזקת כף הרגל. משוך בחוזקה את העור מהקרסול לכיוון הירך, כדי לחשוף את רקמת הרגל.

הסיר את השרירים והשומן מהפמור (עצם הירך) כדי לחשוף את מפרק הירך תוך כדי משיכה עדינה של כף הרגל. כדי ליישר את הרגל, הצמד את המספריים לעצמות האגן וגזור מעט מעל ראש הפמור, תוך הקפדה לא לחתוך את הפמור עצמו. כדי לסייע בשמירה על סטריליות, החזק את הרגל בכף הרגל ונקה שאריות רקמה מהפמור באמצעות מספריים ורקמות שעברו אוטוקלאב לשפשוף פני השטח של העצם.

הפרידו את ה-femur מה-tibia על ידי חיתוך של מפרק הברך והניחו את ה-femur בצלחת תרבית המכילה PBS לדגירה על קרח. לאחר מכן, הסירו והשליכו את ה-fibula על ידי חיתוך בנקודות החיבור של ה-fibula ל-tibia. לאחר מכן, נקו את ה-tibia.

הסר את כף הרגל על ידי חיתוך ה-tibia בנקודה שבה מסתיים מח העצם האדום, והנח את ה-tibia בכלי התרבית יחד עם ה-femur והדגר על קרח. השתמש בפינצטה כדי להחזיק את ה-femur ובמספריים כירורגיים גלח בזהירות את הקצוות הדיסטליים של העצם. הסר כמות מינימלית של עצם ככל הנדרש כדי לחשוף את חלל המוח (medullary cavity) באמצעות 3 mL של PBS סטרילי.

מלאו מזרק וחברו לו מחט בכיול (gauge) 23. חדרו בזהירות עם המחט אל תוך חלל המוח (medullary cavity) ושטפו את מח העצם אל תוך צלחת תרבית סטרילית. השתמשו בקצה המחט כדי לגרד את חלל המוח כדי להבטיח את הסרת כל התאים הרצויים לאחר השליפה.

יש לוודא שמוח העצם האדום אינו נראה יותר ושהעצם נראית כעת לבנה. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק את השוקית (tibia) ובעזרת מספריים כירורגיים, גלחו בזהירות את הקצה שבו השוקית הייתה מחוברת לברך. כדי לחשוף את חלל המוח (medullary cavity), מלאו מזרק ב-3 mL של PBS סטרילי וחברו לו מחט בכילוי (gauge) 25.

קדחו בזהירות עם המחט אל תוך חלל המוח (medullary cavity) ושטפו את מח העצם אל תוך הצלחת המכילה את מח העצם שנאסף מעצמות הירך. בעזרת טיפ של פיפט של 1 ml, טריטו בעדינות את מח העצם כדי להפריד את התאים. העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן סל של 40 micron אל תוך מבחנת צנטריפוגה סטרילית של 50 ml.

השתמשו ב-PBS כדי לשטוף את הצלחת על מנת לאסוף את התאים הנותרים, והעבירו את התמימות דרך המסנן אל מבחנת הצנטריפוגה. הוסיפו PBS למבחנה עד לנפח סופי של 30 עד 40 milliliters וסובבו בצנטריפוגה ב-450 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant).

יש להשעות את המשקע בשלושה מיליליטר של erythrocyte lysing buffer ולהדגיר על קרח למשך 8.5 דקות. לאחר מכן, יש להוסיף כ-30 מיליליטר של PBS סטרילי כדי לעצור את פעולת ה-lysing buffer, לצנטריפוגה ולהסיר את העלייה.

דללו כמות קטנה של הומוגנאט תאים באמצעות PBS והשתמשו ב-hemo cytometer לספירת התאים. דללו את תרחיף התאים לריכוז של 8×10⁶ תאים למיליליטר והדגירו על קרח עד להזרקה. כדי לבצע את השתלת מחית העצם, העבירו 300 µL מהתרחיף המדולל למזרק של 0.5 מיליליטר.

עבור כל עכבר המיועד להזרקה, ודאו שכל בועות האוויר הוסרו. הניחו את כלוב העכברים המקבלים שעברו התנייה על פד חימום ואפשרו לוורידי הזנב הצדיים להתרחב. הניחו עכבר מקבל בתוך מכשיר קיבוע בגודל מתאים ונגבו את הזנב בעזרת גזה כירורגית ספוגה ב-70% ethanol. אחזו בחוזקה בזנב והחדירו בעדינות את המחט לאחד מוורידי הזנב הצדיים כאשר שיפוע המחט פונה כלפי מעלה, והזריקו את תרחיף התאים.

החזיקו גזה כירורגית על אתר ההזרקה עד להפסקת הדימום. לפני הכנסת העכבר לכלוב נקי חדש, כיומיים עד שלושה שבועות לאחר השתלת מח עצם, הניחו את העכבר בתוך שפופרת ריסון וגזרו את הפרווה ברגל האחורית כדי לחשוף את הווריד הספנוס הלטראלי (lateral saphenous vein).

אסוף כ-50 µL דם, ולאחר מכן השתמש בגזה כירורגית כדי לעצור את הדימום. ברגע שהדימום פסק, החזר את העכבר לכלוב. הוסף את הדם לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה המכילה 1 mL של fax buffer.

ערבב את המבחנה על ידי היפוך ושמור על קרח; סנטריפוג את דגימות הדם ב-900 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסרה והשלכה של הנוזל העליון (supernatant), השתמש ב-500 µL של תמיסת ליזיס של אריתרוציטים כדי להחזיר את המשקע לתמיסה (resuspend) והדגר על קרח למשך 8.5 דקות. לאחר מכן, הוסף 1 mL של תמיסת fax כדי לעצור את פעולת תמיסת הליזיס וסנטריפוג ב-900 ×g למשך חמש דקות.

לאחר ליזיס וסבב צנטריפוגה שני, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ודאו שהמשקע הוא כעת לבן. אם הוא אדום, חזרו על שלב הליזיס פעם שלישית. השעו את המשקע ב-fax buffer והשתמשו בציטומטריית זרימה (flow cytometry) כדי לכמת את שיעור התאים החיוביים ל-GFP.

גרף זה מציג את רמות הכימריזם שנמדדו מדי שבוע בדם ההיקפי של עכברים שעברו התניה ב-100 milligrams per kilogram של busalan וקיבלו השתלת מח עצם סינגנית מוצלחת, ועכברים שעברו התניה ב-80 milligrams per kilogram של busalan וקיבלו השתלת מח עצם אלוגנית שלא הצליחה. רמות כימריזם הגבוהות מ-80% מתבססות בדרך כלל תוך שלושה עד ארבעה שבועות לאחר השתלת מח עצם; המוצגים כאן הם נתונים מייצגים של דם היקפי המראים השתלת מח עצם מוצלחת ולא מוצלחת שלושה שבועות לאחר ההשתלה. נתוני ציטומטריית הזרימה הללו מראים כי דרגה גבוהה של כימריזם נשמרת למשך שנה אחת לפחות במח העצם, וכי התניה עם vehicle אינה מספיקה כדי להשרות כימריזם במח העצם.

בעוד שאין הבדלים משמעותיים ברמות הכימרה של מוח העצם המושגות באמצעות מנות של 60 עד 100 מיליגרם לקילוגרם של busulfan, תאים חיוביים ל-GFP מצטברים בתוך מערכת העצבים המרכזית באופן תלוי מינון. איור זה מדגים הצטברות של תאים חיוביים ל-GFP המופקים ממוח העצם באזור המותני של חוט השדרה בעכבר מסוג wild type, ובמידה רבה יותר במודל עכברים של המחלה הנוירודגנרטיבית amyotrophic lateral sclerosis. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בעכברי תורם ומקבל סינגניים מאותו מין כדי למזער את האפשרות לדחיית השתלה לאחר ביצוע הפעולה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ציטומטריה עם זרימה (flow cytometry) ואימונוהיסטוכימיה, כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם תאים המופקים ממוח העצם חודרים למערכת העצבים המרכזית.