Name: בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי Ex Vivo תרבית תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: למדו לבודד לימפוציטים מעור אדם לניתוח פנוטיפי ex vivo ותרבית תאים. פרוטוקול זה משתמש בדיסוציאציה מכנית ואנזימטית ומאפשר ניתוח ציטומטרי ותרבית של תאי T תושבים בעור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ביופסיות עור מחולים פסוריאזיס נמסרו באדיבות על ידי ד&quot;ר אנדראס Koerber (המחלקה לדרמטולוגיה באוניברסיטת אסן, גרמניה) לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי. XH נתמכת גם על ידי NSFC 61263039 ו NSFC 11,101,321.

הערה: עור ביופסיות מיחידים בריאים התקבלו שאריות עור בטן של אנשים שעברו ניתוחים פלסטיים אלקטיבי לאחר הסכמה מדעת בעל פה או בכתב לשימוש מדעי. שימוש עור אנושי אושרה ובהתאם לתקנות שקבעו הוועדות האתיות הרפואיות למחקר האדם של המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud, ניימיכן, הולנד אונ&#39; אסן, גרמניה. 1. הכנת תרחיפים תא יחיד מעור אדם (עבודה סטרילית בתוך ארון-Flow אם תרבית תאים לאחר נדרש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבית תאים: RPMI 1640 + פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי 100 יחידות / מ&quot;ל ​​ו 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה) + פירובט (0.02 מ&quot;מ) ו Glutamax (0.02 מ&quot;מ), ללא בסרום הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני תרבות שלם: בינוני התרבות מוכן בשלב 1.1 + 10% בסרום נקווה אדם (HPS); לאחסן ב 4 ° C.. תביאו בינוני עד 20 ° C ± 2 לפנינוing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ביופסיה של העור באמצעות מכשיר ביופסיה סיבוב 4 מ&quot;מ ולשמור אותו במדיום תרבות שלמה RPMI1640 ב 20 ° C ± 2 עד 4 שעות או 4 ° C ON. לעבד הביופסיה בהקדם האפשרי עם ההגעה במעבדה. הערה: ארוכה יותר אחסון של עור ישפיע על תשואת התא כדאי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל צינור דיסוציאציה כחול הכתיר ולהוסיף 5 מ&quot;ל בינוני תרבות שלמה לתוך הצינור שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום תרבות שלמה לבאר כל (ב 3 בארות בסך הכל) של צלחת תרבות 6-גם סטרילי. השתמש בכלים סטריליים להציב הביופסיה לתוך באר אחת, לשטוף, תזיז אותה אל באר שני וחזור על שלב זה עוד פעם אחת, ובכך להשיג סכום כולל של שלוש שטיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביופסיה של העור שטוף היטב את צלחת פטרי סטרילית, להוסיף 100 μl של המדיום תרבות שלמה על החלק העליון של ביופסיה, ובזהירות לגרד רקמת שומן תת עורי באמצעות אזמל סטרילי חד פעמי נירוסטה. הערה: Thהוא הוא שלב קריטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל ביופסיה של עור ל -4 חתיכות קטנות על צלחת פטרי סטרילית. דגימות העברה (עד ארבעה 4 ביופסיות מ&quot;מ לכל צינור) אל הצינור דיסוציאציה מוכן המכיל 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבשר ומהדקים את הצינורות עם כובע, ולצרף במהופך לשרוול של Dissociator רקמות אוטומטיות. ודא כי כל חומר המדגם ממוקם באזור של הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את תהליך הניתוק ידי ההפעלה &quot;תכנית m_spleen _01&quot; (תכנית מוגדרת מראש שמספקת בזיכרון הפנימי של המכשיר או על ידי כרטיס התכנית המלווה) כדי לנתק את הביופסיה במהירות הסיבוב המתאימה 56 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיבוד, לנתק את הצינור דיסוציאציה מן Dissociator ולוודא שכל החומר ניתק נאסף בתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl collagenase IA (80 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך הצינור דיסוציאציה דגירה המדגם באמבט מים רועד ב 37° צלזיוס למשך 60 דקות. הוספת 100 μl של DNase אני (5 MU / מ&quot;ל) לתוך צינור thedissociation, ומערבבים היטב. הערה: ריכוז גבוה של collagenase או זמן הדגירה כבר תשנה כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הצינור דיסוציאציה לשרוול של Dissociator הרקמות האוטומטיות ולהפעיל את &quot;_01 טחול תכנית m_&quot; כדי לנתק את הביופסיה עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר על גבי צינור פלקון 50 מ&quot;ל. החל חומר המדגם ניתק מסננת תא זה כדי להסיר גושי תא / פסולת רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מסננת תא פעם אחת עם 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות שלמה. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 10 דקות ו supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב הכביסה עוד פעם אחת. Resuspend כדורי תא 300 μl של מדיום תרבות השלם. המתלים תא יחיד מוכנים לניתוח נוסף; להמשיך עם פרוטוקולי תרבית תאי vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של i הנוספתמכתים ציטוקינים ntracellular, לעורר תאים עם PMA (12.5 ng / ml), ionomycin (500 ng / ml) ו Brefeldine A (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 4 שעות לפני ביצוע זרימת ניתוח cytometry. </li></ol> 2. הפעלת Polyclonal של תאי T עור-Resident (תרבית תאי Ex Vivo) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 100 תא בודד השעיות μl (מוכן בשלב 1.15) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית. הערה: לכל אחד מ -4 מ&quot;מ ביופסיה של העור, השעיות תא בודד רכשה ניתן לפצל לפחות שתי בארות של צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 מב-מצופה (25,000 חרוזים לכל טוב), ציטוקינים אנושי רקומביננטי RIL-2 (הריכוז הסופי 25 U / ml) ו RIL-1β (מ&quot;ל / הריכוז הסופי 50 נ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת תרבות עם מכסה צלחת גם שכותרתו, דגירה 5% CO 2, 100% לחות, 37 ° C חממה. שנה בינונית כאשר הצבע הבינוני פונה צהוב. <br/&gt; הערה: מושבת תא ברורה ניתן להבחין בין יום 8 של תרבית תאים. </li></ol> 3. ניתוח cytometry זרימה של הראשים / עור-Resident בתרבית תאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ FACS: PBS + 0.2% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר תאי עניין לתוך צלחת 96-גם נ-תחתון. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100 μl של PBS. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים עם 100 μl של eFluorescence780 מוכן מצומדות צבע הכדאיות ניתן לתקן (1: דילול 1,000 באמצעות PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מבז סמן פני התא הנדרש, למשל: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388.2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), ואת CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), להכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ FACS על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של מבז-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. דגירה 20 דק &#39;ב 20 ° C ± 2, להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות שרק דורשים מכתים פני התא, המשך לסעיף 3.16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של מכתים Foxp3 תוך תאי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן קיבעון חיץ permeabilization ידי ערבוב חלק אחד של תרכיז עם 3 חלקים של מדלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ permeabilization 1x: 1 חלק 10x permeabilization חיץ + 9 חלקים של H 2 O. לעקר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי Resuspend ב 100 μl של קיבעון permeabiliחיץ zation, ומערבבים היטב, דגירה על 4 ° C למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 חיץ permeabilization μl היטב כל, צנטריפוגות ב 450 XG ב RT במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם חיץ permeabilization עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נדרש מבז תאיים, למשל, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) ו IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). מכין את התערובת מהבזה באמצעות חיץ permeabilization המכיל סרום עכברוש נורמלי 2% על פי כל גורם לדילול מב נבדק. לקבוע את גדרות שער באמצעות שליטה אלוטיפ של נוגדן יחד עם מדגם לא כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מב-תערובת מוכנה לבאר כל אחד. לדגור על 4 ° C למשך 30 דקות, להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות דגירה, להוסיף 100 μl של חיץ permeabilization לבאר כל אחד. צנטריפוגה ב 20 ° C ± 2, 450 XG במשך 2 דקות, ולאחר supernatant לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם permeabilization buffer עוד פעם אחת. Resuspend גלולה ב 110 μl של חיץ FACS, השעיות תא העברה לתוך צינור microFACS. הערה: Sample מוכן למדידה באמצעות 10 צבעים cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של מספר סלולארי מדויק הנדרש, להוסיף 10 μl של השעיה אחידה מוּרבָּך של fluorospheres לתוך מדגם זה מייד לפני ביצוע מדידות באמצעות cytometry זרימה. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאי T תושב העור ביעילות ביופסיות עור האדם. היתרון של פרוטוקול זה הוא הבידוד של מספרים גבוהים יחסית של לימפוציטים קיימא, מבקש להביע סמני משטח רלוונטיים. תת תא מזוהה היו: CD11c + DCS, CD4 + ו- CD8 + T תאים Foxp3 + CD25 + תאים. חשוב לציין, לשעבר vivo התרבות של תאים מבודד עור תושב T הייתה טוב מאוד ריאלית ואפשר אנליזה פונקציונלית שלאחר מכן. <p class="jove_content" style=";text-align:right...

העור, כממשק העיקרי בין הגוף לסביבה, מספקת את קו ההגנה הראשון נגד פיזי חיצוני, כימיים ועלבונות ביולוגיים כגון פציעה, קרינה אולטרה סגולה ו מיקרואורגניזמים. העור מורכב משני תאים העיקרי, האפידרמיס הדרמיס, ומכיל מגוון של תאי מערכת החיסון כולל תאי לנגרהנס, מקרופאגים, תאים דנדריטים (DCS), וכ -20 מיליארד תאי זיכרון T, כמעט פי שניים בהווה מספר בהיקף הדם כולו 1 , 2. גוף גדל והולך של נתונים תומך ברעיון כי העור יש פונקציות חיסוניות חיוניות, הן במהלך הומאוסטזיס רקמות במצבים פתולוגיים שונים. תאים חיסוניים תושב בעור רגיל נחשבים לנהל immunosurveillance 3 הוכחו לשחק תפקיד בהתפתחות של מחלות דלקתיות כגון פסוריאזיס 4. בשנת העור lesional פסוריאטית, הן CD4 + ו- CD8 + הסתננו תאי T היו observed וזה היה הראה כי היחס בין CD4 ו- CD8 משתנה בהתאם למצב המחלה 5. עם זאת, אוכלוסיות אלה של תאים שקשה ללמוד בגלל הטכניקות הקיימות לאפשר בידוד של תאים בודדים בלבד. הטכניקות בשימוש כיום נרחב עבור בידוד תא T מעור אדם לשלב ניתוק העור מכני עם טיפול אנזימטי. ביופסיות עור אדם הם טחונים בהרחבה וטופחו עם אנזימים כמו טריפסין, collagenase ו / או EDTA 6-8. עור בהתחשב בכך הוא רקם מחסום אשר עמיד מאוד לכוחות מתיחת חלוקה מכאנית, השיטות הוקמו של בידוד תא T המיוצר בתאים מעט מאוד, ואפילו מספרים נמוכים יותר של תאי קיימא, מה שהופך תרבות vivo לשעבר לתא של אוכלוסיות תאים אלה קשים מאתגר. כאן אנו מדווחים על שיטה שונה לבודד לימפוציטים הן מעור אדם פסוריאטית בריא מעורב ידי שילוב mechanדיסוציאציה iCal של העור באמצעות Dissociator רקמות אוטומטיות במקום השיטה הוקמה ממינסינג בהרחבה, יחד עם עיכול אנזימטי באמצעות collagenase. תת תא חיסון קיימא שונה כולל DCs ותאי T נצפו לאחר הכנת השעית תא בודד. חשוב לציין את הביטוי של סמני המשטח CD3, CD4 ו CD8 השתמר היטב. תאים ובכך מוכן, מוכנים לשימוש בתרביות תאים vivo לשעבר או ניתוח תזרים cytometric. פרוטוקול זה הועסק בהצלחה לניתוח ביופסיות עור יחידות (4 מ&quot;מ) נגזרות עור lesional של חולי פסוריאזיס. תוצאות המחקר הראו כי תושב העור המטופל בתאי T מיוצר יותר ציטוקינים דלקתיים כמו IL-17 ו IFNγ בהשוואה למתנדבים בריאים 9.

<table><tbody><tr><td>ביופסיה חד פעמית פונץ'</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 מ"מ</td></tr><tr><td>אזמל סטרילי חד פעמי</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>צינור עדין MACS C</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>מכסה כחול, המשמש כצינור הדיסוציאציה.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>דיסוציאטור רקמות אוטומטי. שימוש ב"spleen_01 התוכנית" לדיסוציאציה של ביופסיית העור.</td></tr><tr><td>מסננת סלולרית&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 ומיקרו; m ניילון</td></tr><tr><td>96 בארות צלחת U תחתונה</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>אנושי סרום מאגר (HPS)</td> <td>מוכן</td><td></td><td></td>בבית</tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>סוג 1-A, מתאים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>צבע כדאיות קבוע (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>צביעת תאים מתים לפני קיבוע התאים; לדלל עם PBS ב-1:1,000</td></tr><tr><td>תרכיז קיבוע/פרמיביליזציה</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>קיבוע/פרמיביליזציה מדלל</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פרמיביליזציה (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 עכבר אנטי-אנושי CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>שיבוטHI30;: מקדם דילול 1:50</td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי אנושי CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>שיבוט: TUK4; גורם דילול 1:50</td></tr><tr><td>PE עכבר אנטי אנושי CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>שיבוט: MOC-1; גורם דילול 1:50</td></tr><tr><td>עכבר ECD אנטי אנושי CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>שיבוט: UCHT1; גורם דילול 1:50 לצביעה על פני השטח; גורם דילול 1:25 לצביעה תוך תאית.</td></tr><tr><td>PC5.5 עכבר אנטי אנושי CD4</td><td>בקמן - קולטר</td><td>B16491</td><td>שיבוט: 13B8.2; גורם דילול 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 עכבר אנטי אנושי CD11c</td><td>בקמן - קולטר</td><td>A80249</td><td>שיבוט: BU15; גורם דילול 1:50</td></tr><tr><td>APC עכבר אנטי אנושי CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>שיבוט: AD5-8E7; גורם דילול 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 עכבר אנטי אנושי CD8</td><td>בקמן - קולטר</td><td>A66332</td><td>שיבוט: B9.11; גורם דילול 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 עכבר אנטי-אנושי CD19</td><td>בקמן - קולטר</td><td>A94681</td><td>שיבוט: J3-119; גורם דילול 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 עכבר אנטי-אנושי CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>שיבוט: BC96; גורם דילול 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; CLA עכברוש אנטי אנושי</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>שיבוט: HECA-452; גורם דילול 1:</td></tr> <tr><td>eFluo450 חולדה אנטי אנושי Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>שיבוט: PCH101; צביעה תוך-תאית; גורם דילול 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 עכבר אנטי אנושי IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>שיבוט: eBio64DEC17; צביעה תוך-תאית; גורם דילול 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 עכבר אנטי-אנושי IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>שיבוט: 4S. ב3; מכתים תוך תאיים; גורם דילול 1:400</td></tr><tr><td>פלואורוספירות ספירת זרימה</td><td>בקמן - קולטר</td><td>7547053</td><td>חרוזי ספירה, לזרימה ציטומטרית</td></tr></tbody></table>

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; ex vivo</em&gt; תרבית תאים

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

יש עור אדם תפקיד מחסום חשוב ומכיל תאים חיסוניים שונים שתורמים הומאוסטזיס רקמות והגנה מפני פתוגנים. כפי שהעור הוא יחסית קל לגשת, הוא מספק פלטפורמה אידיאלית ללמוד מנגנוני ויסות היקפיים חיסוניים. תאי תושב חיסון immunosurveillance התנהגות עור הבריא, אלא גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של מחלות עור דלקתיות, כגון פסוריאזיס. למרות תובנות מתעוררים, הבנתנו את הביולוגיה שבבסיס מחלות עור שונות דלקתי עדיין מוגבלת. יש צורך באיכות טובה (יחיד) אוכלוסיות תאים שבודדו דגימות עור ביופסיה. עד כה, נהלי בידוד כבר הקשו ברצינות על ידי חוסר קבלת מספר מספיק של תאי קיימא. בידוד לניתוח שלאחר מכן גם הושפעו אובדן סמני שושלת תא חיסון, בשל הלחץ המכאני וכימיות נגרם על ידי נהלי דיסוציאציה הנוכחיים להשיגהשעית תא בודדת. כאן, אנו מתארים שיטה שונה כדי לבודד תאי T משני בריא מעורב עור אנושי פסוריאטית ידי שילוב דיסוציאציה עור מכאני באמצעות Dissociator רקמות אוטומטי וטיפול collagenase. מתודולוגיה זו שומרת ביטוי של סמני שושלת החיסוניים ביותר כגון CD4, CD8, Foxp3 ו CD11c רק בעת הכנה של השעיות תא בודדות. דוגמאות של בידוד תא מוצלח CD4 + T ו פנוטיפי עתידי אנליזה פונקציונלית מוצגות.

הפרוטוקול המובא כאן יניב בין 2,200 ± 615 (ממוצע ± SEM, עור של מתנדבים בריאים) עד 178,000 ± 760 (ממוצע ± SEM, עור lesional של חולי פסוריאזיס) לימפוציטים קיימא מעור אדם בעת שימוש ביופסיה של עור יחידה 4 מ&quot;מ. סוגים שונים של CD45 + תאים אותרו תא בודד השעיות נגזר העור של אנשים בריאים כולל CD4 + T-תאים (~ 45%), CD8 + T תאים (~ 30%), ו CD11c + DCS (~ 5% ), בעוד כמה B תאים ...

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי T תושבי עור מביופסיות עור אנושיות. פרוטוקול זה מניב מספר מספיק של לימפוציטים תושבי עור אנושי ברי קיימא לניתוח זרימה ציטומטרית ותרבית ex vivo.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ביעילות תאי T תושבי עור מביופסיות של עור אנושי. פעולה זו מתבצעת תחילה על ידי השגת ביופסיות של עור אנושי באמצעות מחץ ביופסיה עגול. לאחר מכן, כל ביופסיה של עור נחתכת לארבעה חלקים קטנים יותר בתוך צלחת פטרי.לאחר מכן, רקמת העור מופרדת באופן מכני ואנזימטי כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים. לבסוף, הלימפוציטים השוכנים בעור מנותחים באמצעות ציטומטריה זרימה ומגודלים ex vivo. בסיכום, ניתן לבודד מספרים מספיקים של לימפוציטים בני-חיים השוכנים בעור אנושי ולנתח אותם באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית ואנליזת FACS.שיטה זו תסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הדרמטולוגיה והאימונולוגיה של גידולי העור. לדוגמה, כיצד תאי T תושבים בעור תורמים למחלה. את הפרוצדורה תדגים Xuehui He, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלנו.לאחר הכנת מצע התרבית, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו שני מיליליטר של מצע מלא לשלושה בארות של פלטת תרבית סטרילית בעלת שש בארות. לאחר מכן, השתמשו במנקב ביופסיה עגול של ארבעה מילימטר כדי להוציא ביופסיית עור. הניחו אותה במצע תרבית RPMI 1640 מלא והשאירו אותה על שולחן העבודה למשך עד ארבע שעות, או בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך הלילה.בזמן שהביופסיה עוברת אינקובציה, סמנו מבחנה לפירוק (dissociation tube) בעלת פקק כחול והוסיפו לה five milliliters של מצע גידול מלא. לאחר מכן, השתמשו בכלי סטריליים כדי להניח את הביופסיה לתוך הבאר הראשונה לצורך שטיפה. העבירו את הרקמה לבאר השנייה, שטפו, וחזרו על התהליך פעם נוספת בבאר השלישית.העבירו את ביופסיית העור שנשטפה היטב לפטריה סטרילית והוסיפו בעזרת פיפט 100 µL של מצע גידול מלא על גבי הדגימה. לאחר מכן, השתמשו בסכין מנתח (scalpel) סטרילית חד-פעמית מפלדת אל-חלד כדי לגרד בזהירות את רקמת השומן התת-עורי. בפטריה סטרילית חדשה, חתכו כל ביופסיית עור לארבעה חלקים קטנים יותר.לאחר מכן, העבירו את הדגימות למבחורת הדיסוציאציה המוכנה המכילה 5 mL של מצע גידול מלא. סגרו את המבחורה היטב וחברו אותה כשהיא הפוכה לשרוול של המכשיר האוטומטי לדיסוציאציית רקמות. ודאו שכל חומר הדגימה נמצא באזור הרוטור.בשלב הבא, התחילו את תהליך הדיסוציאציה על ידי הרצת תוכנית M spleen zero one, כדי לבצע דיסוציאציה לדגימת הביופסיה במהירות הסיבוב המתאימה למשך 56 שניות. לאחר העיבוד, נתקו את מבחנת הדיסוציאציה מהדיסוציאטור וודאו שכל החומר שעבר דיסוציאציה נאסף בתחתית המבחנה.הוסף 150 µL של collagenous one A לשפופרת הדיסוציאציה והדגר את הדגימה במקלחית רוטטת בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 µL של DNase לשפופרת הדיסוציאציה וערבב היטב. חבר את שפופרת הדיסוציאציה לשרוול של מכשיר הדיסוציאציה האוטומטי של הרקמה והפעל את תוכנית M spleen zero one כדי לבצע דיסוציאציה של הביופסיה פעם נוספת.לאחר מכן, הניחו מסננת תאים מניילון בנקבים של 70 µm על גבי מבחנה מסוג falcon בנפח 50 mL והעבירו את חומרי הדגימה המפורקים דרך מסננת התאים כדי להסיר גושי תאים ושאריות רקמה. השתמשו ב-5 mL של מצע גידול מלא כדי לשטוף את מסננת התאים פעם אחת. לאחר מכן, סובבו את התסננת בצנטריפוגה ב-450 G ובטמפרטורה של 20 °C (בסטייה של פלוס או מינוס שתי מעלות) למשך 10 דקות, לפני שאיבת הנוזל העליון (supernatant).לאחר חזרה על שלב השטיפה פעם נוספת, השתמש ב-300 µL של מצע תרבית מלא כדי לחדש את התגשיית התאים (cell pallets). תרחיפי תאים בודדים מוכנים כעת להמשך אנליזה. לצורך ביצוע צביעת ציטוקינים תוך-תאית, השתמש ב-PMA, ionomysin ו-brefeldin A כדי לעורר את התאים והדגר אותם בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך ארבע שעות לפני ביצוע אנליזה בציטומטריית זרימה.לביצוע הפעלה פוליקלונלית של תאי T תושבי העור, העבירו מנה של 100 µL של תרחיף תאים בודדים לפלטת 96 בארות בעלת תחתית עגולה. הוסיפו מיקרו-בידס מצופים בנוגדנים נגד CD3 ו-CD28, וציטוקינים רקומיננטיים אנושיים, IL-2 ו-IL-1B. כסו את פלטת התרבית במכסה משקולת מסומן והדגירו ב-37 °C, 5% CO2 ולחות של 100%.לאחר מכן, כאשר צבע המצע הופך לצהוב, יש להחליפו. ניתן להבחין במושבת תאים צלולה ביום השמיני לתרבית התאים. לביצוע אנליזת FACS, העבירו את התאים הרלוונטיים לפלטת 96 בארות בעלת תחתית בצורת V.סבב במערכת צנטריפוגה במהירות של 450 G ובטמפרטורה של 20 °C, פלוס או מינוס שתי מעלות, למשך שתי דקות. לאחר מכן, שאב את הנוזל העליון (supernatant). השתמש ב-100 µL של צבע viability fixable conjugated 780 פלואורסצנטי מוכן כדי לצבוע את התאים באמצעות אינקובציה בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות.לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של FACS buffer וסובבו במערך צנטריפוגה לפני שאיבת הנוזל העליון (supernatant). בשלב הבא, לאחר בחירת הנוגדנים המוניקלונליים לסמני שטח התא מתוך הרשימה המופיעה בפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-FACS buffer להכנת תמיסות הנוגדנים. השתמשו בבקרת איזוטופ (isotope control) של הנוגדנים יחד עם דגימה לא צבועה כדי להגדיר את הגדרות השער (gate settings).כעת, הוסיפו 25 µL מתערובת הנוגדנים לעכבר שהוכנה לכל באער והגנו מאור. הדגירו בטמפרטורה של 20 °C למשך 20 דקות. הוסיפו 100 µL של FACS buffer, צנטריפוגו ושאבו את העלייה.בעזרת באפרים שהוכנו לצביעת foxp3 בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 100 µL של באפר קיבוע וחדירה (fixation and permeabilization buffer) כדי לתלה מחדש את המשקעים. ערבבו היטב והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של באפר חדירה (permeabilization buffer) לכל באר וסובבו בצנטריפוגה לפני שאיבת הנוזל העליון (supernatant).לאחר שטיפת התאים פעם נוספת ובחירת הנוגדנים המתאימים, הוסף 20 µL של תערובת נוגדנים מונוקלונליים מוכנה לכל באר והגנה אותה מהאור לפני דגירה בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. שטוף את התאים פעם נוספת באמצעות באפר חדירה (permeabilization buffer). לאחר מכן, השתמש ב-110 µL של באפר FACS כדי להשעות מחדש את המשקעים והעבר את תרחיפי התאים למבחנות FACS מיקרו.לבסוף, אם נדרש מספר תאים מדויק, הוסיפו 10 µL של סוספנזיה אחידה ומעורבבת היטב של fluorospheres לכל דגימה מיד לפני ביצוע מדידות FACS. כפי שמוצג כאן, סוגים שונים של לוקוציטים חיוביים ל-CD45 זוהו בסוספנזיות של תאים בודדים שהופקו מעור של אנשים בריאים, כולל תאי T חיוביים ל-CD4, תאי T חיוביים ל-CD8 ותאים דנדריטיים חיוביים ל-CD11c.בעוד שנצפו מעט תאי B, תאי NK או מקרופאגים. בנוסף, המתודולוגיה מאפשרת ניתוח של תאים חיוביים ל-CD4, חיוביים ל-CD25 וחיוביים ל-foxp3 בביופסיות של עור אנושי. לדוגמה, באמצעות שימוש בצביעה תוך-תאית לאחר קיבוע והחדרה (permeabilization), ניתן להדגים ביטוי של גורם השעתוק foxp3 בתאי T חיוביים ל-CD25.כפי שהודגם כאן, כדי למנוע פלואורסצנציית רקע אוטוגנית ולהימנע מאוכלוסיית תאים בעלת פלואורסצנציית רקע, מומלץ להשתמש בנוגדן עכבר נגד CD45 אנושי המצומד לכרומופור brilliant violet 421 לצורך ביצוע gating של אוכלוסיית הלימפוציטים. איור זה ממחיש כי מרבית התאים השוכנים בעור האדם היו תאי T חיוביים ל-CD3. לצורך ניתוח חיוניות תאים, מומלץ להשתמש בצבע חיוניות הניתן לקיבוע (fixable viability dye) כדי להבדיל בין תאים חיוניים לתאים מתים או גוססים.לצורך ניתוח פונקציונלי נוסף, באמצעות ביופסיית עור בודדת של ארבעה מילימטרים מעור פגוע של חולי פסוריאזיס, הוכח כי תאי T שהופקו מהביופסיה ייצרו IL-17a ו-interferon gamma. זאת בעקבות גירוי של ארבע שעות באמצעות PMA ionomycin בנוכחות brefeldin A. לבסוף, דמות זו מראה כי לתאי T מאנשים עם פסוריאזיס יש יכולת גבוהה הרבה יותר לייצר את הציטוקינים הקשורים לפסוריאזיס, IL-17a ו-interferon gamma. אין לשכוח כי עבודה עם רקמות אנושיות וחומרים מעבדתיים עלולה להיות מסוכנת.יש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי בטיחות.

lymphocyte-isolation-from-human-skin-for-phenotypic-analysis-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T...

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

פרוטוקול זה מתאר דיסוציאציה לא אנזימטית מהירה של שברי רקמות אנושיות טריות לצורך הערכה איכותית וכמותית של תאי CD45+ (לימפוציטים/לויקוציטים) הקיימים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות. בנוסף, ניתן לאסוף ולאחסן את הסופרנטנט המתקבל מהרקמה הראשונית הומוגנטית לצורך ניתוח או ניסויים נוספים.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

העור הוא ביתה של רשת תאי חיסון מורכבת. אנו מתארים מתודולוגיה יעילה לעיכול עור עכבר, מחלקים שונים בגוף החיה, על מנת לקבל תרחיף חד-תאי ולנתח את אוכלוסיות הלויקוציטים השונות השוכנות בעור על ידי זרימה ציטומטרית.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

פרוטוקול זה מתאר עיכול אנזימטי של עור עכבר במדיום עשיר בחומרים מזינים ואחריו הפרדת שיפוע לבידוד לויקוציטים.  תאים הנגזרים כך יכולים לשמש ליישומים מגוונים במורד הזרם. זוהי אלטרנטיבה יעילה, חסכונית ומשופרת למכונות דיסוציאציה של רקמות ופרוטוקולי עיכול רקמות קשים יותר וטריפסין מבוססי דיספאז.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאים מיאלואידים מעור העכבר וניקוז בלוטות הלימפה לאחר הזרקה תוך עורית של Plasmodium sporozoites. ציטומטריית זרימה של תאים שנאספו מספקת בדיקה אמינה לאפיון העור וניקוז התגובה הדלקתית של בלוטות הלימפה לטפיל.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מבוסס-FACS לבידוד של העור האנושי ושרירי הלסת. זה חוסם בתרבות מבחנה אשר היה בלתי נמנע עם פרוטוקול הבידוד הנפוץ ביותר דרך תרבויות ההסבר. ערכות המשנה שמקורם הפיצוץ הם ברורים מבחינה פונקציונלית ולהציג ביטוי גנים דיפרנציאלי ולוקליזציה בתוך dermis.

הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

למדו לבודד לימפוציטים מעור אדם לניתוח פנוטיפי ex vivo ותרבית תאים. פרוטוקול זה משתמש בדיסוציאציה מכנית ואנזימטית ומאפשר ניתוח ציטומטרי ותרבית של תאי T תושבים בעור.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

גלה סרטונים נוספים