הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

ניסוי זה מסנן ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה לאחר שעתוק באמצעות שלושת האזורים העיקריים הלא מתורגמים של תעתיקים. ראשית, זהה את שלושת אזורי העניין העיקריים הלא מתורגמים בגן הממוקד. שיבוט זה שלושת ה-UTR הראשוניים לתוך פלסמיד מדווח בקרת El luciferase כדי ליצור El luciferase שלושה תעתיק כימרי ראשוני של UTR.

ואז ביציבות. שלב את שני הפלסמידים בקו תאים רלוונטי למחלה זרע את התאים הנושאים את התעתיק הכימרי ב 96. צלחות באר מטפלות בהן בספריית תרכובות למשך 24 שעות ואז מזהות את המולקולות המשפיעות על פעילות הלוציפראז.

בחר את המולקולות שנבחרו לבדיקת אימות נוספת, ולאחר מכן, טפל הן בתאי הבקרה והן בתאים הנושאים לוציפראז שלושה תעתיק כימרי UTR ראשוני עם תת-קבוצה של ספריית דובדבן. התוצאות יבדלו אם ההשפעה של תרכובת מתווכת באמצעות שלושת האזורים הראשוניים הלא מתורגמים או באמצעות רצפים וקטוריים אחרים. בניגוד למאמרי הסינון המבוססים ביותר על עיתונאים.

מבחנים המתמקדים בוויסות שעתוק, אלה מדווחים על בדיקות מבוססות תאים המתמקדות בזיהוי תרכובות המווסתות את רמות תעתיק ה-mRNA באמצעות שלושה אזורים ראשוניים ומתורגמים. קצור את תאי הנוירובלסטומה שעברו טרנספטציה יציבה על ידי טריפסין אסייתי. לדלל את התאים לריכוז של שניים כפול 10 עד חמישי תאים למיליליטר.

ב-RPMI המכיל 10% FBS ו-1% L-גלוטמין ל-27 צלחות. הכן לפחות 250 מיליליטר של תרחיף תאים, תוך התחשבות בטיפול בנוזלים, נפחים מתים בשוקת ושלבי פיפטינג חוזרים ונשנים. לאחר מכן שפכו את מתלה התא למאגר סטרילי והניחו אותו על שולחן הרובוט.

טען תשעה ברקודים לבנים שטוחים. 96 צלחות באר תחתונות וקופסה של 200 קצות פיפטה סטריליים של 200 מיקרוליטר על שולחן הרובוט. מערבבים את תרחיף התאים, ואז מחלקים 75 מיקרוליטר תאים לכל באר של תשע צלחות.

מכסים את הצלחות ומאפשרים לתאים לשקוע לתחתית הבאר למשך 30 דקות על מנת למזער את השפעות הקצה. לאחר מכן הניחו את כל תשע הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ודגרו למשך 24 שעות. באופן דומה, המשך עם הלוחות הנותרים תשע בכל פעם.

הפשירו את צלחות הספרייה המורכבות בטמפרטורת החדר. מלאו שוקת אחת ב-PBS סטרילי ועוד אחת עם 0.5% DMSO בתמיסת PBS והניחו אותם על שולחן הרובוט. לכל צלחת ספרייה.

הכן ותייג בהתאם. צלחת דילול אחת. כעת מלאו כל באר עמודים, שתיים עד 11 מלוחות הדילול ב -398 מיקרוליטר PBS סטרילי.

לאחר מכן מלאו את העמודות 1 ו-12 ב-50 מיקרוליטר של 0.5% DMSO ב-PBS סטרילי. לאחר מכן טען את שתי לוחות הדילול. שתי צלחות ספרייה, שתי קופסאות של 50 מיקרוליטר קצוות סטריליים ושישה צלחות תאים על שולחן הרובוט.

כעת חשוף את לוחות התאים, פיפטה שני מיקרוליטר מתמיסת המלאי של 10 מילי-מולרית מאחת משתי לוחות הספרייה בצלחת הדילול המתאימה וערבב היטב. שימוש באותו סט טיפים. העבירו שלושה מיקרוליטרים של דילול 50 מיקרו-מולרי לשלוש צלחות 96 בארות לבנות מקודדות המכילות את התאים.

החלף את ערכת העצות המלאה וחזור על השראת תאים עבור לוח הספרייה השני. מכסים את התרבויות ודוגרים למשך 24 שעות. לאחר מכן חזור על תהליך דילול התרכובת ואינדוקציה של התאים עבור לוחות הספרייה הנותרים.

לאזן את מגיב הלוציפראז המשוחזר לבחירתו לטמפרטורת החדר. הנח את מאגר הלוציפראז על שולחן הרובוט ושפך לתוכו ריאגנט. הסר תשע צלחות של תרביות מושרות מהחממה.

הנח אותם על שולחן הרובוט, חשוף והתאזן לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב הלוציפראז לבאר בין הצלחות. הכנס עיכוב השווה לזמן קריאת הזוהר של צלחת אחת.

לאחר דגירה של 30 דקות. ראשית רשום את הברקוד של הלוחית על מנת לשייך אותה לקובץ הנתונים המתאים. לאחר מכן, הניחו את הצלחת הראשונה בלומינומטר ומדדו זוהר.

לאחר שלב טלטול קצר, חזור על קריאות הזוהר עבור כל לוחות האינדוקציה. לאחר מכן אספו את המגיב הנותר של גזע לוציפר ואחסנו אותו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לאחר עיבוד נתוני הניסוי של הסקר הראשוני, בחר את הלהיטים כדי לאשר את ספציפיות התרכובת על ידי דובדבן סינון נגדי.

בחר את ההיטים שנבחרו וצור פריסה עבור לוחית ההקרנה החדשה, כולל מיקומים לפקדים. לאחר מכן, מתוך האליקוטים המאוחסנים בצינורות ברקוד דו-ממדיים בודדים, צור לוחות HIIT חדשים. מעקב אחר אותו פרוטוקול מיועד להקרנה.

הכן 3 96 צלחות באר מכל קו תאים יציב לכל צלחת היי. למחרת, טפלו בתאים בתרכובות ספרייה. השתמש בכל צלחת היי לטיפול בשלוש צלחות של CHP 1 34 micken, שלוש UTR ראשוני ושלוש צלחות עם תאי בקרה בריכוז עבודה של שני מיקרומולרים תוך 24 שעות.

למדוד את פעילות הלוציפראז בכל לוחות CHP 1 34, שלושת קבוצות הבקרה. בדומה לניתוח הנתונים בסינון הראשוני, נרמל נתונים ניסיוניים מבארות מטופלות לממוצע של בקרות שטופלו ברכב. לאחר מכן חשב את הממוצע וסטיית התקן על השכפולים עבור כל חישוב שנבדק.

שינוי הקפל של פעילות לוציפראז ב-CHP 1 34 MCIN שלושה ראשוני UTR לעומת CHP 1 34. תאי בקרה בוחרים חתכי שינוי מלא שרירותיים של יותר מ-1.5 וערכי P מובהקים של פחות מ-0.01. ניסוי זה סקר ספריית תרכובות של 2000 עבור מודולטורים פוטנציאליים של מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות שלושת ה-UTR הראשוניים של המיקרופון והאונקוגן, התוצאות של אותות לוציפראז של לוחית ספרייה מייצגת אחת מתוך 25 המוצגת כאחוז מהרכב המטופל.

בקרות מראות שרוב התרכובות לא עוררו השפעה נראית לעין על שלושת ה-UTR הראשוניים. הלהיטים נבחרו כאשר הערך הממוצע וסטיית התקן חושבו על פני כל ערכי הבדיקה תרכובות המפחיתות את פעילות הלוציפראז מתחת ל-20% מעידות ככל הנראה על רעילות תאית בולטת של התרכובת. גרף זה מציג תוצאות מייצגות לסינון נגדי של ארבע תרכובות נבחרות המסומנות WX, Y ו-Z.שתי התרכובות W ו-X גורמות לביטוי מוגבר של לוציפראז ממדווח ה-UTR האונקוגן שלושת הראשוניים כפי שמצוין על ידי הבדל שינוי קיפול ומבחן T: שימו לב שבעוד שההשפעות של שתי התרכובות W ו-X תלויות באמת בשלוש תרכובות UTR ראשוניות, ל-W אין השפעה משמעותית על כדאיות התא.

בעוד שתרכובת X מציגה פעילות ציטוטוקסית מסוימת כפי שמצוין על ידי אות לוציפראז מנורמל בתאי בקרה CHP 1 34, לא תרכובת Y ולא תרכובת Z בריכוז של שני מיקרומולריים מציגים השפעה תלויה ב-UTR של שלושה ראשוניים על רמות הלוציפראז. הירידה בפעילות הלוציפראז שזוהתה בבדיקה ראשונית בטיפול בתרכובת Y היא תוצאה של ציטוטוקסיות. במקרה של תרכובת Z, פעילות הלוציפראז המוגברת נובעת מחוסר ספציפיות במונחים של שלוש הפעלת UTR ראשונית של מקדם נגיפי.

מכיוון שנצפה ויסות שווה ערך הן בקבוצות בקרה והן בקבוצות לא מתורגמות בבדיקת תפוקה גבוהה זו, זכור כי אימות החום הראשוני בתאי הבקרה הוא קריטי להבחנה של התרכובות הפועלות באמת דרך שלושת האזורים הראשוניים הלא מתורגמים מאותן תרכובות הפועלות באמצעות מקדם.