Name: הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למד סקרינינג כימי ברמת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המשנות ויסות לאחר תעתיק דרך אזור ה-3' UTR. השיטה משתמשת בדיווח לוקיפראז בתאים יציבים לגילוי מולקולות פעילות בבקרת גנים ובתגלית תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לקרן הנוירובלסטומה האיטלקית על התמיכה הכספית המלאה בפרויקט זה.

הערה: התפוקה של מערכות assay זה תלויה בציוד המעבדה HTS זמין. פרוטוקול זה הוא בהנחייתם של טקאן חופש רובוט EVO 200, אשר מבצע טיפול נוזלי בפורמט 96-היטב. מזעור לפורמט 384 גם הוא גם אפשרי. מערכת הטיפול הנוזלי רובוטית ממוקמת מתחת הזרימה למינרית על מנת לשמור על תנאים אספטיים במהלך כל שלבי הניסוי. אם אין אוטומציה של טיפול בנוזלים זמינה, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לפורמט נמוכה תפוקה. הקרנה ראשונית 1. יום 1: הכן ותאי זרע הערה: תאי זרע להניב מפגש 80% בעת מנסה לאמוד פעילות לוציפראז, כלומר, 48 שעות לאחר זריעה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend trypsinized תאי נוירובלסטומה CHP134-mycn3UTR לריכוז של 2 × 10 5 תאים / מיליליטר בRPMI המכיל 10% FBS ו -1% L- גלוטמין. במשך 27 צלחות להכין לפחות 250 מיליליטר של<html> השעיה תא לוקחת בחשבון טיפול נוזלי, שקתות כרכים מתים וצעדי pipetting חוזרים ונשנים. יוצקים את ההשעיה התא לתוך מאגר סטרילי ולמקם אותו על שולחן הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 9 צלחות המינימרקטים לבנים שטוחות תחתונה 96-היטב ותיבה של 200 μl טיפים pipet סטרילי על שולחן הרובוט. מערבבים את ההשעיה התא על ידי pipetting לפני כל צעד היתר להימנע מתאי שיקוע תחת כוח הכבידה. לוותר 75 μl של תאים לתוך באר כל 9 צלחות כדי לקבל צפיפות סופית של 1.5 × 10 4 תאים לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחות עם העפעפיים ולהשאיר אותם מחוץ לחממה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים למשקעי תחתית הבאר. זה יהיה למזער את אפקט קצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2 ו -1.3 פעמיים כדי להכין את המספר כולל של 27 צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו דגירה של 24 שעות. </li></ol> 2. יום 2: פנק את התאים עם תרכובות הספרייה ntent &quot;&gt; הערה: ספריית המולקולה הקטנה ספקטרום האוסף מורכב של 2,000 תרכובות מסודרות בשורות 8 ו -10 עמודים ב- 25 96-גם צלחות בריכוז של 10 מ&quot;מ בDMSO הבארות בעמודים הראשונים ואחרונים נותרו ריקות עבור פקדים. . מבחני מיון מתחם מבוצעים בדרך כלל בריכוז מתחם 1-10 מיקרומטר 8. פרוטוקול ההקרנה המתואר כאן מתקן 2 מיקרומטר כריכוז העבודה ו -24 שעות כנקודת סיום assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 9 צלחות ספריית מתחם בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי שקתות עם PBS סטרילי ופתרונות DMSO%-0.5 PBS ומניח אותם על שולחן הרובוט. לכל צלחת ספרייה, להכין ולתייג בהתאם צלחת דילול אחד - פוליפרופילן צלחת 96-היטב U-תחתונה עם נפח עבודה של לפחות 400 μl. מלא היטב בכל עמודות 2-11 לוחות דילול עם 398 μl של PBS סטרילי באמצעות טיפים הקבועים של המטפל הנוזלי. עמודים מלא 1 ו -12 עם 50 μl של PBS סטריליעם DMSO 0.5% על מנת לשחזר את ריכוז הרכב בבארות השליטה (0.02%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שתי צלחות ספרייה, צלחות דילול שכותרתו בהתאמה, שתי קופסות של טיפים pipet סטרילי 50 μl ושש צלחות תאים על שולחן הרובוט. לחשוף לוחות תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 2 μl של פתרון 10 מ&quot;מ מניות מאחת משתי צלחות ספרייה בצלחת הדילול המתאימה ומערבבים היטב. זה יגרום ריכוז תרכובות ביניים של 50 מיקרומטר. באמצעות אותה הקבוצה של טיפים, לוותר 3 μl של דילול 50 מיקרומטר ב 3 96-גם צלחות הלבנות המינימרקטים עם תאים. תוצאות תכנית דילול זה ב 2 מיקרומטר עובד ריכוז של כל נבדקו מתחם. הערה: כדי למנוע מניפולציות מיותרות עם הטיפים, להשתמש סט מלא של 96 טיפים מההתחלה, למרות שצלחות הספרייה מכילות רק 80 תרכובות. זה אפשרי מאז ראשון והטורים האחרונים של צלחות הספרייה ריקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הטיפים pipet וחזור Step 2.4 לצלחת הספרייה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחות תאים ולהחזיר אותם לחממה למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.3-2.6 פעמים נוספות לצלחות ספרייה שנותרו. </li></ol> 3. יום 3: בצע בלוציפראז Assay הערה: לפני ביצוע assay בלוציפראז, ניתן זמנית אותו עם assay כדאיות תא המבוסס על הפחתה של resazurin על מנת לקבל מדד תא-כדאיות מכל הטוב 9. לוציפראז Multiplexing וassay כדאיות תוצאות מבחני בהפחתה של אות בלוציפראז ש, לעומת זאת, אפשר להתעלם ממנו אם התאים לספק מספיק רמה גבוהה של פעילות בלוציפראז. פעילות לוציפראז יכולה להיות מזוהה על ידי מגוון רחב של חומרים כימיים assay 10,11 לוציפראז מסחריים וביתיים עם אות זורח יציבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן מגיב לוציפראז מחדש של בחירה לטמפרטורת חדר. ודא שעוצמת הקול הוא מספיק לכל צלחות assayed. במשך 27 צלחתשל 170 מיליליטר של מגיב לוציפראז יידרש תוך טיפול נוזלי חשבון, שקתות נפח מת וצעדי pipetting חוזרים ונשנים. יוצקים את מגיב לוציפראז לתוך מאגר ולמקם אותו על שולחן הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 9 צלחות עם תאים מן החממה, מניח אותם על שולחן הרובוט, לחשוף ולחכות עד equilibrated לטמפרטורת חדר. הוסף 50 μl של מגיב לוציפראז לכל צלחת היטב על ידי צלחת. בין הלוחות, להציג עיכוב שווה לזמן קריאת הארה של צלחת אחת. זה יבטיח שכל הצלחות נמדדות בתוך פרק זמן שווה מבנוסף מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, מניח את הצלחת הראשונה בluminometer ולמדוד הארה אחרי צעד רועד קצר. חזור על פעולה עבור כל הצלחות. רשום את הברקוד של כל צלחת ולשייך אותו לקובץ נתונים המקביל, כדי למנוע טעויות הנובעות ממספר רב של צלחות בטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2-3.3 פעמיים במשך 18 הצלחות שנותרו עם תאים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את מגיב לוציפראז שנותר ולאחסן אותו ב -20 ° C. </li></ol> 4. יום 4: ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני ניסוי תהליך באמצעות נורמליזציה של כל הדגימות לממוצע של בקרות רכב שטופל על-צלחת. לכל מתחם ספרייה, לחשב את ממוצע x הערך וSD על triplicates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עד-ויסות ולהיטים ידי קביעת סף של X ± k × SD, שבו x הערך הממוצע וSD מחושבים על כל ערכי assay מעובד, וk ויסות כלפי מטה הוא מוגדר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סף שרירותי חתוך &lt;20% בקבוצת ביקורת שטופל ברכב כאשר הפחתה של אות בלוציפראז היא ככל הנראה קשורה עם רעילות מתחם. השלכת הלהיטים מתחת לסף זה יהיה להפחית באופן משמעותי מספר הלהיטים חיוביים שגויים בדלפק-ההקרנה. הערה: במקום נורמליזציה מבוססת שליטה, יכולים להיות מעובד נתוני ניסוי החלת ציון Z או B של האנלוגי החזקה שלהליבה 12. בנוסף, גישות סטטיסטיות חלופיות לבחירת להיט זמינות 12. </li></ol> 5. Counter-הקרנה הערה: תרכובות שזוהו במסך הראשי (שכותרתו &#39;להיטים&#39;) הם אישרו והערכה לסגולית על ידי נגדי הקרנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחור לעצמה את הלהיטים שנבחרו מaliquots מאוחסן בצינורות המינימרקטים 2D אחת וליצור חדשים &quot;פגעה צלחות&quot;, להציל את הפריסה המקבילה. אל תשכח להשאיר עמדות חינם לבקרה. הערה: בהעדר מערכת דובדבן-קטיף יעיל, אפשר לבדוק את שניהם שליטה ו -3 תאים &#39;UTR נושאות במקביל בהקרנה הראשונית. במקרה זה, בחירה ספציפית של תרכובות עם אפקטים תלויים רק ב3 &#39;UTR הציג תתאפשר לאחר ההקרנה הראשונית ומבטלת את הצורך של נגד הקרנה. עם זאת, ההקרנה המקבילה בשתי שורות תאים תכפיל את assayעלויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;יום 1: הכן ותאי זרע&quot;), עבור כל &quot;צלחת פגע&quot; להכין שלוש 96-גם צלחות של כל תאים יציבים CHP134-mycn3UTR וCHP134-CTRL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;היום 2: פנק את התאים עם ספריית תרכובות&quot;), להשתמש בכל צלחת להיט לטיפול בשלוש CHP134-mycn3UTR ושלוש צלחות CHP134-CTRL בשעה 2 מיקרומטר עובד ריכוז. הערה: בעוד דלפק המסך המתואר כאן מתבצע בtriplicates במנה אחת של 2 מיקרומטר, זה יכול להיות מועיל להחליף משכפל הסטנדרטי ולבדוק את הלהיטים ב 3 ריכוזים כפי 10 דילולים הנעים בין 2 מיקרומטר עד 20 ננומטר. יישום גישה זו לא יאפשר רק כדי לאשר את הנתונים של המסך הראשי, אלא גם לקבל נתונים מנה-תגובה ראשוניות על הלהיטים העיקריים, מזעור שיעורים חיוביים שגויים. במקרה זה, צינור ניתוח שונה צריך להיות applied לעבד את נתוני הניסוי ולאשר את הלהיטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;יום 3: בצע בלוציפראז Assay&quot;), למדוד את הפעילות בלוציפראז בכל צלחות CHP134-mycn3UTR וCHP134-CTRL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;יום 4: ניתוח נתונים&quot;), לנרמל את הנתונים ניסיוניים מבארות שטופלו לממוצע של בקרות רכב שטופל על-צלחת ולחשב את הממוצע וSD על משכפל. עבור כל מתחם שנבדק, לחשב את שינוי הקיפול של פעילות לוציפראז בCHP134-mycn3UTR לעומת תאי CHP134-CTRL. בחר שינוי קיפול שרירותי לחתוך מחיקות של&gt; 1.5 ומשמעות p-ערכים של &lt;0.01. שים לב: בהגדרות assay תיארו את הפרמטר הקובע ללהיט סגוליות הוא שינוי משמעותי של פי פעילות לוציפראז בCHP134-mycn3UTR לעומת תאי CHP134-CTRL. אם יש צורך, אפשר גם להעריך רעילות מתחם על ידי ביצוע במקביל assay כדאיות תא על seתרכובות lected. זה עשוי להיות מועיל במיוחד אם הלהיטים הראשוניים-הוקרנו דלפק בניתוח תגובת מינון. למנה אחת, הניסיון שלנו מצביע על מתאם חזק של פעילות לוציפראז המופחתת לירידה בכדאיויות תא 6. לכן, ירידה בפעילות בלוציפראז בתאי מטרה, כמו גם תאי שליטה יכולה להיחשב כמדד לרעילות מתחם בריכוז נבדק. </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220(2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%E2%80%99+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3%E2%80%99+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li>
<li>Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+developmental+biology%2C+cancer+genomics+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Techn%22%5BJournal%5D)">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li>
<li>van Olst, E. S. iebring-, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li>
<li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li>
<li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3%E2%80%99+UTRs+of+human+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li>
<li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%E2%80%99+untranslated+region+of+messenger+RNA%3A+A+molecular+%E2%80%9Chotspot%E2%80%9D+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li>
<li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability%3A+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li>
<li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms%3A+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases%3F+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li>
<li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3%E2%80%99+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li>
<li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר בדיקת גן מדווח מבוססת תאים שמטרתה לזהות מודולטורים המכוונים לתהליכים פוסט-שעתוק תלויי UTR. הוא מקיף את הבדיקה הראשונית ואת המסך הנגדי ובמידת הצורך יכול להיות מלווה בבדיקת ציטוטוקסיות. התוצאה של הסינון הראשוני היא מספר תרכובות מועמדות יקרות ערך, שיכולת השחזור והספציפיות שלהן מאומתות עוד יותר בסינון הנגדי.
זיהוי הפגיעות הראשוניות מבוסס על וריאציות של פעילות לוציפראז בטיפול בתאים המבטאים תעתיק כימרי מדווח-3' UTR. בדיקה חוזרת של הפגיעות בתאים הנושאים את אותו פלסמיד מדווח ללא ה-3' ...

לרגולצית תעתיק תקופה ארוכה של ביטוי גנים שחשבו לשחק עיקרי אם לא בלעדי תפקיד בשליטה על ייצור חלבון. צבירת ראיות, לעומת זאת, מצביע על כך שרגולציה לאחר תעתיק תורמת באותה מידה, אם לא יותר מ, רגולציה תעתיק לקבוע שפע חלבון תאי 1,2. שליטה לאחר תעתיק של ביטוי גנים היא הרבה יותר מורכב ומשוכלל יותר מהייתה במחשבה ראשונה. למעשה, את כל השלבים השונים של בקרה לאחר תעתיק צמחו להיות מוסדרים, כוללים עיבוד mRNA, לוקליזציה, מחזור, תרגום 3, כמו גם מתילציה RNA הפיכה תיארה זה עתה 4. ממספר תהליכי רגולציה לאחר תעתיק מושפע באופן פוטנציאלי, assay מתואר להלן מתמקד באלה הקשורים &#39;האזור מתורגם (3&#39; mRNA 3 UTR). 3 &#39;UTR רחב משפיע גורל mRNA בעיקר באמצעות אינטראקציה ספציפית של יחסי ציבור מחייב RNAoteins וRNAs ללא קידוד רצפיה רגולציה ו / או מבנים משניים 5. לכן, מולקולות קטנות המשנות אינטראקציות אלה או להפריע למסלולי העברת אותות במעלה הזרם תעבור את האיזון שמסדיר שפע חלבון. גישה טיפולית זו היא בעלת חשיבות מיוחדת לפתולוגיות אדם שלראיות מראים כי קיימות גנים של מחלות-רלוונטי נתונות לרגולציה שלאחר תעתיק, אשר מייצגת אפוא יעד פוטנציאלי להתערבות תרופתית. לכן, מערכות המאפשרות להקרנה של מאפננים &#39;רמות ה- mRNA באמצעות התערבות במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק בפורמט תפוקה גבוהה יכולות להיות כלי רב ערך בזיהוי של טיפולי רומן פוטנציאליים. Assay גן הכתב מבוסס התאים המתוארים מאפשר לזיהוי תרכובות מסוגלת לווסת את גורל mRNA באמצעות מנגנונים תלויים בה 3 &#39;UTR. הוא מורכב מכמה ג העיקריomponents (איור 1) ודורש כמה צעדים ראשוניים כדי לאמת את הכדאיות של assay. קודם כל, לבנות הכתב נועד כולל UTR &#39;3 מגן של עניין. 3 &#39;UTR הוא התמזגו בסופו של גן כתב כגון לוציפראז גחלילית (איור 1). כל שינוי במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעל באמצעות 3 &#39;UTR הוכנס ישנה את היציבות ו / או יעילות תרגום של תמליל chimeric זה, וכתוצאה מכך רמות לוציפראז מגוונות. לכן, שינויים בפעילות לוציפראז לשמש אמצעי עקיף של תקנה לאחר תעתיק המושפע של הגן של עניין. המרכיב השני של המערכת הוא לבנות כתב שליטה, פלסמיד ביטוי זהה המבטא את אותו גן הכתב אך אינו מכיל &#39;UTR 3. יכולים להיות מתוכנן שני פלסמידים הכתב במעבדה תוך שימוש בפרוטוקולי ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליים או שנרכשו ממקורות מסחריים. הבחירה של קו תא מתאים היא קריטית לבניית assay. איזה קו התא הוא המודל האופטימלי תלוי בגורמים רבים, החל מדרישות קליניות כמו דמיון מקסימאלי לפתולוגיה לסוגיות מעשיות רק כמו מאפיינים זמינות, transfectability, וצמיחה. חשוב לציין, לפני להמשיך יש לוודא כי שילוב של 3 &#39;UTR לגן הכתב יש השפעה צפויה על הרמה של תמליל chimeric. היעדר ההבדל משמעותי באות בלוציפראז מן 3 &#39;UTR כתב נושאות ושליטה בונת transfected זמני בתאים שנבחרו היה מציין כי 3&#39; UTR הוא לא פונקציונלי במודל סלולארי זה, מה שגרם לחיפוש של חלופה אלה. לפורמט התפוקה הגבוהה, בונה כתב 3 נושאות UTR &#39;ולוציפראז השליטה צריכה להיות משולבת ביציבות בקו התא הנבחר. שימוש משולב על יציבות זמנית transfectedשורת תאים עדיפה מכמה סיבות. זה ירחיב את הבחירה של מודל סלולארי כולל שורות תאים שקשה transfect, להקטין את השונות בנתונים נובעים מתנודות ביעילות transfection, חולף עלויות. יתר על כן, על תאי transfection חולפים הם לעתים קרובות מאוד עמוסים עם פלסמיד דנ&quot;א המוביל לרוויה של המערכת. בהגדרות אלה עלייה נוספת בביטוי העיתונאי עשויה להיות מאתגרת, וכתוצאה מכך ירידה ברגישות כלפי תרכובות upregulating פוטנציאליות. לבסוף, כאשר כל רכיבי assay מוגדרים, זה קריטי, לפני שעבר לפורמט התפוקה הגבוהה כדי לקבוע את הכדאיות של assay, כלומר, אם פעילות לוציפראז יכול להיות אכן למעלה ובמיוחד באמצעות הוכנס 3 &#39;למטה מוסדר UTR. הפקדים הטובים ביותר יהיו מולקולות קטנות דיווחו לווסת את היציבות או translatability של mRNA באמצעות UTR &#39;3 של עניין. אם יש אלה הואלא ניתן, בקרות פונדקאיות מחקה את האפקט הרצוי מתקבלות. אלה יכולים להיות miRNAs או מחייב חלבוני RNA הידועים להפעיל האפקטים שלהם באמצעות קשירה ל&#39;UTR 3 של עניין. הערכת בקרות כגון לפני ההקרנה הראשונית מצביעה לא רק את הפונקציונליות של assay פיתח, אלא גם מאפשרת להערכת הטווח, הרגישות שלה הדינמית וביצועים בפורמט התפוקה גבוהה. באמצעות הפרוטוקול המתואר הוקרן ספריית 2,000 מתחם 6. נוירובלסטומה, הגידולים מוצקים extracranial הנפוצים ביותר של גיל הינקות, שימשה כמודל ביולוגי ו&#39;UTR 3 של אונקוגן MYCN, הגברה שמאוד מנבא תוצאות שליליות של נוירובלסטומה, כגן מטרה 7. איור 2 מתארים את הפריסה הניסיונית. ההקרנה הייתה מחולקת בשלוש ריצות עם גודל אצווה של 27 צלחות הוקרנו בטווח אחד. הקבוצה של 27 צלחות כלולות ספריית ספקטרום אוסףצלחות הערת 1-N.8 + n.25 (הפעלה ראשונה), n.9-n.16 + n.25 (ריצה שנייה) וn.16-n.24 + n.25 (סיבוב שלישי), כל אחד צלחת הוקרנה בשלושה עותקים. כך, צלחת אחת ספרייה (n.25) הייתה assayed בתוך כל שלוש הריצות עושים השוואה בין-טווח אפשרי. הפרוטוקול להלן מתאר ריצה אחת של 9 צלחות ספרייה נבדקו בשלושה עותקים.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבות 96 באר לבנה</td><td>PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96 באר תחתית U (צלחת דילול)</td> <td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>שוקת חד פעמית 100 מ"ל לריאגנטים</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 מ"ל מאגר רובוטי חד פעמי</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לרובוט DITI 50&nbsp; &mu; l</td> טיפים לרובוט <td>30038607</td><td></td><td>טקאן</td> סטרילי</tr><tr><td>DITI 200&nbsp; &mu; l</td> מטריצת <td>30038617</td><td></td><td>טקאן</td> סטרילית</tr><tr><td>1.4 מ"ל ברקוד דו-ממדי w, צינורות תחתונים שטוחים</td><td>Thermo Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo Luciferase Assay System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200&nbsp; mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>אוסף הספקטרום (ספרייה מורכבת)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO200 רובוט&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan F200 קורא רב-צלחות &nbsp;</td><td>טקאן</td><td>לא ישים</td><td></td></tr></tbody></table>

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני post-תעתיק מוסדר

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

תעתיק ורגולציה לאחר תעתיק לשניהם יש השפעה עמוקה על ביטוי גנים. עם זאת, מבחני סינון מבוסס תאים נפוצים אימצו להתמקד ברגולצית תעתיק, שנועדו במהותו בזיהוי של מולקולות מיקוד אמרגן. כתוצאה מכך, מנגנונים שלאחר תעתיק נחשפים במידה רבה על ידי פיתוח תרופות ממוקדות ביטוי גנים. כאן אנו מתארים assay מבוסס תאים שנועד לבחון את התפקיד של &#39;האזור מתורגם (3&#39; 3 UTR) באפנון של הגורל של mRNA שלה, ובזיהוי תרכובות יוכלו לשנות אותה. Assay מבוסס על השימוש במבנה כתב בלוציפראז המכיל &#39;UTR 3 של גן של עניין המשולב ביציבות לקו תא מחלה-רלוונטית. הפרוטוקול מחולק לשני חלקים, עם ההתמקדות הראשונית על ההקרנה הראשונית שמטרתו זיהוי של מולקולות המשפיעות על הפעילות בלוציפראז לאחר 24 שעות של טיפול. החלק השני של הפרוטוקולמתאר את הצורך להפלות תרכובות ויסות פעילות לוציפראז במיוחד דרך UTR &#39;3 הקרנה ללא מרשם. בנוסף לפרוטוקול מפורט ותוצאות נציג, אנו מספקים שיקולים חשובים על פיתוח assay והאימות של הלהיט (ים) על יעד אנדוגני. Assay הגן המתואר מבוסס תאי הכתב יאפשר למדענים לזהות מולקולות ויסות רמות חלבון באמצעות מנגנונים שלאחר תעתיק תלויים ב&#39;UTR 3.

שימוש בגישה המתוארת, אנו הוקרנו ספריית 2,000 מתחם למאפנני פוטנציאל של מנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעלים באמצעות &#39;UTR 3 של גן MYCN. איור 3 מתארים את התוצאות של בדיקות הסקר הראשוניים שהודגמה על ידי צלחת ספרייה אחת. אות בלוציפראז מוצגת כאחוז מפקדי רכב שטופל הייתה מתקבלת על ידי מדידת פעילות לוציפראז בצלחות בשלושה עותקים של תאי CHP134-mycn3UTR טופלו בתרכובות של צלחת ספרייה אחת. כצפוי, רוב התרכובות לא הייתה השפעה על פעילות בלוציפראז כפי שצוין על ידי ערכים קר...

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

ניסוי זה סורק ספריות כימיות לאיתור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-טרנסקריפציונליים באמצעות האזור הבלתי מתורגם של ה-3' (3' UTR) של תמלילים. ראשית, זהו את ה-3' UTR הרלוונטי בגן המטרה. שבט את ה-3' UTR הזה אל תוך פלסמיד דגלן (reporter) של El luciferase כדי ליצור תמליל כימרי של El luciferase הכולל את ה-3' UTR.לאחר מכן, בצעו אינטגרציה יציבה של שני הפלסמידים לתוך שורת תאים רלוונטית למחלה. זרעו את התאים הנושאים את התמליל הכימרי בלוחות 96 בארות, טפלו בהם בספריית תרכובות למשך 24 שעות, ולאחר מכן זהו את המולקולות המשפיעות על פעילות הלוציפראז.בחרו את המולקולות הנבחרות לבדיקת תיקוף נוספת, ולאחר מכן, טפלו הן בתאי הביקורת והן בתאים הנושאים תמליל כימרי של ה-UTR' של לוקיפראז באמצעות תת-ספרייה נבחרת של המולקולות. התוצאות יבדילו אם השפעת התרכובת מתווכת באמצעות האזור הבלתי מתורגם של ה-3' או באמצעות רצפי וקטור אחרים, בניגוד למסכי בדיקה המבוססים על רפורטרים בלבד.בדיקות המתמקדות בבקרת תעתוק; דיווח זה על בדיקה מבוססת תאים מתמקד בזיהוי תרכובות המווסתות את רמות תמלילי ה-mRNA באמצעות האזור הלא-מתורגם של הקצה ' 3. קצרו את תאי הנוירובלסטומה שעברו טרנספקציה יציבה באמצעות טריפסינציה. דללו את התאים לריכוז של 2×10⁵ תאים למילליליטר.במדיום RPMI המכיל 10%FBS ו-1%L-glutamine עבור 27 פלטות. הכין לפחות 250 milliliters של תרחיף תאים, תוך התחשבות בטיפול בנוזלים, בנפח מת שנותר בתעלות ובשלבי פיפוט חוזרים. לאחר מכן, שפוך את תרחיף התאים לתוך מיכל סטרילי והנח אותו על שולחן הרובוט.הטעינו על שולחן הרובוט תשע פלטות לבנות בעלות תחתית שטוחה עם ברקוד ב-96 בארות, וקופסה של טיפים סטריליים לפיפט בנפח 200 microliter. ערבבו את תרחיף התאים, ולאחר מכן העבירו 75 microliters של תאים לכל באר בתשע הפלטות.כסו את הפלטות והניחו לתאים לשקוע לתחתית הבאר למשך 30 דקות כדי למזער אפקטי פאשייה (edge effects). לאחר מכן, הניחו את כל תשע הפלטות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide והדגירו למשך 24 שעות. פעלו באופן דומה עם שאר הפלטות, בקבוצות של תשע בכל פעם.הפשיר את פלטות ספריית התרכובות בטמפרטורת החדר. מלא תעלה אחת ב-PBS סטרילי ותעלה שנייה בתמיסת 0.5%DMSO ב-PBS והנח אותן על שולחן הרובוט. עבור כל פלטת ספרייה.הכינו ותייתו בהתאם. פלטת דילול אחת. כעת מלאו כל באער בעמודות 2 עד 11 של פלטות הדילול ב-398 µL של PBS סטרילי.לאחר מכן, מלאו את עמודות 1 ו-12 ב-50 µL של 0.5% DMSO ב-PBS סטרילי. בשלב הבא, טענו את שתי פלטות הדילול. הניחו על שולחן הרובוט שתי פלטות ספרייה, שתי קופסאות של טיפים סטריליים בנפח 50 µL ושש פלטות תאים.כעת חשפו את לוחות התאים, העבירו בעזרת פיפט 2 µL של תמיסת המלאי בריכוז 10 mM מאחד משני לוחות הספריה אל לוח המיהול המתאים וערבבו היטב. באמצעות אותה קבוצת טיפים, העבירו 3 µL של המיהול בריכוז 50 µM לשלושת לוחות ה-96 בארות הלבנים והמקוודים המכילים את התאים.החליפו את כל מערכת הטיפים וחזרו על השראת התאים עבור לוחית הספריה השנייה. כסו את התרביות והדגירו למשך 24 שעות. לאחר מכן, חזרו על תהליך דילול התרכובת והשראת התאים עבור שאר לוחות הספריה.הביאו את ריאגנט הלוציפראז המשוחזר שנבחר לטמפרטורת החדר. הניחו את מאגר הלוציפראז על שולחן הרובוט ומזגו לתוכו את הריאגנט. הוציאו מהאינקובטור תשעה פלטות של תרביות שהושרצו.הנח אותם על שולחן הרובוט, הסר את הכיסוי והמתן להשגת שיווי משקל בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 50 µL של ריאגנט לוציפראז לכל באר בין המגשים. הוסף השהיה השווה לזמן קריאת הלומניסנציה של מגש אחד.לאחר דגירה של 30 דקות, רשמו תחילה את הברקוד של הפלטה על מנת לשייך אותה לקובץ הנתונים המתאים. לאחר מכן, הכניסו את הפלטה הראשונה ללומינומטר ומדדו את הלומינסנציה.לאחר שלב ניעור קצר, חזור על קריאות הלומינסנציה עבור כל לוחות ההשראות. לאחר מכן, אסוף את שארית ריאגנט ה-Lucifer race ואחסן אותה בטמפרטורה של 20°C- . ברגע שנתוני הניסוי של הסריקה הראשונית יעובדו, בחר את הפגיעות (hits) כדי לאשר את ספציפיות התרכובת באמצעות סריקת נגד (counter screening) של cherry.בחרו את הפגיעות (hits) שנבחרו וצרו תכנית פריסה (layout) עבור לוחית הסריקה החדשה, כולל מיקומים עבור ביקורות. לאחר מכן, מהמנות המאוחסנות במבחנות בודדות עם ברקוד דו-ממדי (2D), צרו לוחות HIIT חדשים. לאחר מכן, עקבו אחר אותו פרוטוקול עבור הסריקה.הכינו 3 פלטות של 96 בארות עבור כל שורת תאים יציבה לכל פלטת hi. למחרת, טפלו בתאים בתרכובות מהספרייה. השתמשו בכל פלטת hi כדי לטפל בשלוש פלטות של CHP 1 34 micken, שלוש פלטות של prime UTR ושלוש פלטות עם תאי ביקורת בריכוז עבודה של 2 µM למשך 24 שעות.מדוד את פעילות הלוסיפראז בכל לוחות ה-CHP 1 34, שלושת סטים של ה-prime הבלתי מתורגמים והביקורות. בדומה לניתוח הנתונים בסריקה הראשונית, נרמל את הנתונים הניסויים מבארות מטופלות לממוצע של ביקורות מטופלות ברכב (vehicle) באותו לוח. לאחר מכן, חשב את הממוצע ואת סטיית התקן על פני החזרות עבור כל תרכובת שנבדקה.שינוי הקיפול (fold change) של פעילות לוקיפראז ב-CHP 1 34 McIn three prime UTR לעומת CHP 1 34. תאי ביקורת נבחרו על סמך סף שינוי קיפול שרירותי הגבוה מ-1.5 וערכי מובהקות P הנמוכים מ-0.01. ניסוי זה סרק ספריית תרכובות של 2000 עבור מודולטורים פוטנציאליים של מנגנוני בקרה פוסט-טרנסקריפציונליים המופעלים דרך ה-three prime UTR של ה-mic והאונקוגן; תוצאות אותות הלוקיפראז של פלטה מייצגת אחת מתוך 25 מהספרייה מוצגות כאחוז ביחס לטיפול ב-vehicle.הבקרות מראות כי מרבית התרכובות לא גרמו לאפקט ניכר ב-three prime UTR. הפגיעות (hits) נבחרו כאשר הערך הממוצע וסטיית התקן חושבו על פני כל ערכי הבדיקה; תרכובות המפחיתות את פעילות הלוקיפראז מתחת ל-20% מעידות ככל הנראה על רעילות תאית בולטת של התרכובת. גרף זה מציג תוצאות מייצגות של סינון נגדי (counter screening) עבור ארבע תרכובות נבחרות המסומנות כ-W, X, Y ו-Z. שתי התרכובות W ו-X גורמות להגברת ביטוי הלוקיפראז מה-reporter של ה-three prime UTR של האונקוגן, כפי שמעידים הפרש ה-fold change ומבחן T. שים לב שבעוד שההשפעות של שתי התרכובות W ו-X תלויות אכן ב-three prime UTR, לתרכובת W אין השפעה משמעותית על חיוניות התאים.בעוד שתרכובת X מראה פעילות ציטוטוקסית מסוימת כפי שמעיד אות הלוציפראז הנורמלי בתאי בקרה CHP 1 34, לא תרכובת Y ולא תרכובת Z בריכוז של 2 µM מראות השפעה תלויה ב-3' UTR על רמות הלוציפראז. הירידה בפעילות הלוציפראז שזוהתה בסריקה הראשונית בעקבות טיפול בתרכובת Y היא למעשה תוצאה של ציטוטוקסיות. במקרה של תרכובת Z, העלייה בפעילות הלוציפראז נובעת מהפעלה לא ספציפית של הפרומוטור הוויראלי, שאינה תלויה ב-3' UTR.מאחר שצפייה בעלייה שקולה נצפית הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצות הבלתי מתורגמות, זכרו שבבדיקה בעלת תפוקה גבוהה זו, תיקוף החום הראשוני בתאי הביקורת הוא קריטי להבחנה בין תרכובות הפועלות באמת דרך האזור הבלתי מתורגם של ה- 'prime three' לבין תרכובות הפועלות דרך הפרומוטור.

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטות לפיתוח והאימות של assay פלואורסצנטי כמוני למדידת פעילותם של אשלגן rectifier פנימה (קיר ') ערוצים להקרנת מתחם תפוקה גבוהה מוצגות.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לבצע siRNA ממוקד מסך "ubiquitome" לזהות היוביקוויטין רומן ורגולטורים כמו היוביקוויטין של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי שבו חזקה לקריאה מהפעילות העיתונאית היא זמינה.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.

בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית

למד סקרינינג כימי ברמת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המשנות ויסות לאחר תעתיק דרך אזור ה-3' UTR. השיטה משתמשת בדיווח לוקיפראז בתאים יציבים לגילוי מולקולות פעילות בבקרת גנים ובתגלית תרופות.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

גלה סרטונים נוספים