ניתוח של Autophagy ב

מטרת הליך זה היא להשרות ולבחון אוטופגיה בפטרייה חוטית. הדבר משיג תחילה על ידי החדרה של נבגים או חתיכות מיצליום קטנות לנפחים קטנים של מצע המכיל חומרי הזנה. בשלב השני, מכינים רפידות הרעבה בחללי השקופיות של מיקרוסקופ זכוכית, ולאחר מכן מעבירים את התרבית המהודר על הרפידות.

בשלב הסופי, פדי ההרעבה מדגגרים בתא רטוב כדי להשרות אוטופגיה. לבסוף, ניתן לעקוב אחר האוטופגיה על ידי ניטור translocation של חלבוני סמן פלואורסצנטיים רלוונטיים אל הוואקואולות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לסייע בחקר סוגיות מרכזיות בתחום הביולוגיה של התא, כגון זיהוי תרכובות חדשות המודולות את תהליך האוטופגיה.

כדי להכין את הניסוי לרעב, אם זן ה-P cresa genum הרלוונטי נשמר על אורז ירוק, ראשית יש להניח שתי עד שלוש גרגירי אורז המכוסים במיצליום בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.5 µL, ולמלא את המבחנה ב-500 µL של מצע גידול תמצית שמרים וגלוקוז או מצע GG. לאחר מכן, יש לערבל את המבחנה בוורטקס למשך 30 שניות כדי שהנבגים יdetached מהאורז, ולהדגיר את המבחנה למשך יום אחד בטמפרטורת החדר. למחרת, יש לדלל את תרחיף הנבגים לריכוז של 1:50 במי ברז סטריליים ולערבב היטב; אם ה-p cryogen נשמר על אגר.

השתמשו בטיפ של פיפט כדי להעביר חתיכות קטנות של המייסליום למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מילליטר המכילה 400 µL של מי ברז סטריליים וכ-100 mg של כדורי זכוכית. לאחר מכן, ערבבו את המבחנה במכשיר וורטקס למשך שתי דקות כדי שהמייסליום יתפרק. כדי לגדל את ה-PCE genum על מצע הרעבה (starvation pad), חממו תחילה את לוח החימום לכ-60 °C.

בשלב הבא, חממו שני גרמים של aros ב-100 milliliters של מי ברז במיקרוגל עד שהתמיסה המתקבלת תהיה צלולה לחלוטין, בעוד ה-aros מתקרר לכש 60 degrees Celsius. מלאו micro centri tube של 1.5 milliliter עבור כל דגימה ב-400 microliters של מי ברז סטריליים או תמיסת תרכובת. לאחר מכן, חממו את המבחנות ואת השקופיות למיקרוסקופ על פלטת החימום למשך 60 שניות לפחות.

העבירו 400 µL של aros בטמפרטורה של 60 °C לכל אחת מהמבחנות, כך שהנפח הכולל בכל מבחנה יהיה 800 µL, וערבבו קצרה במכשיר vortex, ולאחר מכן החזירו את המבחנות ללוחית החימום כדי למנוע התמצקות מוקדמת. כעת, פפלו 140 µL של תמיסת aros המתאימה לתוך השקע של כל זכוכית מיקרוסקופ. תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות, השטיחו מיד את ה-aros באמצעות זכוכיות כיסוי, והמתינו כארבע דקות.

בטמפרטורת החדר, כאשר פדי ה-aros התמצקו, השתמשו בבוהן או באצבע המורה כדי להחליק בזהירות את לוחות הכיסוי ולהעביר את סממייד המיקרוסקופ והפדים לתא לח. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפטה 5 µL של P er genum שהוכן מראש למרכז פד ההרעבה, ועטפו את התא הלח בשקית פלסטיק להגנה נוספת מפני התייבשות, תוך הקפדה לא להזיז את הקופסה יותר מדי או להפריע לתרביות. לאחר מכן, אחסנו את התרביות בטמפרטורת החדר למשך 20 שעות לפחות לפני ניתוח הדגימות.

ביום למחרת, העבירו את השקופיות לנייר סופג יבש ולאחר מכן תקרו 50 µL של מים על כל פד הרעבה. השתמשו בכיסוי זכוכית (cover slip) כדי לסחוט את עודפי המים ולהסירם באמצעות נייר סופג נקי. לאחר מכן, עבור כל שקופית, השתמשו בעדשה עם הגדלה של 20x כדי לקבל סקירה כללית של צמיחת המיסליום.

כדי להעריך את מיקומו של ה-GFP ב-Hy-Fi, פתחו את התמונות בעזרת עדשה של 63x או 100x. לבסוף, החזירו את השקופיות לתא הלחות לאחר כל בדיקה עד למועד הניסוי הבא.

בתמונות אלו, נעשה שימוש בזן ה-G-F-P-S-K-L-P Creo Genum כדי להעריך את פירוק הפרוקסיזומים לאחר 20 שעות של דגירה. לא נצפה GFP בוואקואולות, ואלו לא היו מוגדלות. עם זאת, לאחר 40 שעות של צמיחה, ניתן היה להבחין בוואקואולות מסומנות ב-GFP בחלק מההיפים, מה שמעיד על הפעלת אוטופגיה, כאשר ב-60 שעות נצפו פלואורסצנציית GFP וואקואולות מוגדלות.

בניסוי זה, נעשה שימוש במוטציה delta 80 G של p caressa Genum כבקרה שלילית. שימו לב להיעדרה של התרחבות הוואקואולות ושל GFP, אפילו לאחר 60 שעות צמיחה. כבקרה חיובית, נעשה שימוש בתרופה rapamycin המגרה אוטופגיה, כפי שנצפה במאסטר G-F-P-S-K-L שלא טופל. ואקואולות המסומנות ב-GFP הפכו לנראות לאחר 40 שעות צמיחה, כאשר ה-Hy-Fi התמלא לחלוטין בוואקואולות ענקיות המכילות GFP עד לשעה ה-60.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה של אופן ניתוח האוטופגיה בפטריות מנטיס.