Name: ניתוח של Autophagy ב Chrysogenum Penicillium על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: למדו לחקור אוטופאגיה בפטריית Penicillium chrysogenum באמצעות רפידות רעב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השיטה מאפשרת מעקב אחר תנועת סמנים פלואורסצנטיים לוואקואולות וזיהוי תרכובות המשפיעות על התהליך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CQS מקבל מלגה מאשכול המצוינות של LOEWE למחקר פטרייתי אינטגרטיבי (IPF). המחבר רוצה להודות לאידה ג'יי ואן דר קליי על זני P. chrysogenum ששימשו בעבודה זו ולאנדראס ס. רייכרט על מתנת הרפמיצין.

1. הכנת P. chrysogenum לניסויי הרעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על אורז (&quot;אורז ירוק&quot;), מקום 2-3 גרגרי אורז מכוסים המתנבג תפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מלא אותו בYGG 500 μl (10 גר &#39;/ ליטר KCl, 20 גר&#39; / גלוקוז l, 10 גר &#39;/ בסיס חנקן שמרי l, 5 גר&#39; / ליטר K 2 HPO תמצית שמרי 4, 20 גר &#39;/ ליטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור למשך 30 שניות כדי שנבגים יכולים להתנתק מהאורז ביעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור ליום 1 בטמפרטורת חדר (למשל, בין 20 ל 25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1/50 של השעיה נבג זה במים ברז סטרילי, ומערבב היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על צלחת אגר (למשל, צלחת אגר YGG), להעביר חתיכות קטנות של התפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 400 μl מים ברז סטרילי וכ GL 100 מ&quot;גחרוזים התחת באמצעות איסוף שן סטרילי או פיפטה קצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור למשך 2 דקות, כך שהתפטיר הופך מקוטעת. השתמש בתוכן של הצינור באופן מיידי. </li></ol></li></ol> 2. שלבי הכנה לטיפוח P. chrysogenum על רפידות רעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על צלחת חימום ולהגדיר אותו כ 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 2 גרם של agarose ב100 מ&quot;ל מי ברז על ידי בישול הפתרון במיקרוגל. תשמור על עצמך כי פתרון זה הוא ברור לחלוטין לאחר חימום. אם זה לא, לבשל אותו שוב עד agarose הוא נמס לגמרי. תן פתרון agarose להתקרר כ 60 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (2-4, תלוי במספר דגימות) במים ברז 400 μl סטרילי כל אחת (לא תרכובות נוספות הוסיפו) או 400 x μl (תוספת של x μl של פתרון מתחם בשלב 2.5) ולמקם אותם לצלחת חימום דקות לפחות 1, כך שהוואטאה בתוך מתחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי לצלחת חימום דקות לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl 2% agarose לפתרון בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge ובקצרה מערבולת. לאחר שלב זה אם תרצה בכך, להוסיף תרכובות נוספות (כלומר, rapamycin 1 מיקרומטר). אם זה נעשה, מערבולת בקצרה לאחר כל חומר נוסף הוא pipetted לצינור. שים את הצינורות בחזרה על שולחן החימום כדי למנוע התמצקות מוקדמת. הערה: הנפח הכולל של צינור microcentrifuge צריך להיות 800 μl. </li></ol> 3. הכנת שקופיות מיקרוסקופ המכילה רפידות רעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 140 μl פיפטה של ​​פתרון agarose לתוך החלל של שקופיות מיקרוסקופ (שעדיין נמצא על צלחת החימום). נסה להימנע מבועות במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד במקום להחליק כיסוי על פתרון agarose. הערה: זה יגרום משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מיקרושקופית היקף על ספסל המעבדה לכ -4 דקות, כדי לאפשר את כרית agarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את coverslip מפנקס agarose ידי הזזה אותו בעזרת אצבע אגודל או מדד (ללבוש כפפות, כדי למנוע זיהום!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקופית מיקרוסקופ עם הכרית לחדר רטוב כדי למנוע התייבשות. המלצה: השתמש בתיבת קצה ריקה שעדיין יש להכניס להחזקת הטיפים פיפטה. מוסיף מים סטריליים לתיבה, כך שהחלק התחתון מכוסה. מניחים את שקופיות מיקרוסקופ על ההוספה ולסגור את התיבה. </li></ol> 4. ייחס רפידות הרעב עם פ chrysogenum ודגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 μl פיפטה של ​​דילול 1/50 הנבג (אם התרבויות גדלו על אורז) או 5 μl של הפתרון חי מכיל שברי תפטיר (אם התרבויות גדלו על צלחת אגר) על מרכז כרית הרעב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את התא הרטוב ולעטוף אותו בשקית ניילון (זה משמש כהגנה נוספת מפני התייבשות של רפידות הרעב). היזהר שלא להזיז את הקופסה יותר מדי כי אחר טיפות החיסון יהיו מוטרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את התיבה העטופה בRT לפחות 20 שעות לפני ניתוח הדגימות. </li></ol> 5. ניתוח מיקרוסקופי של הדגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 שעות של דגירה הדגימות מוכנות לניתוח מיקרוסקופי; לשים שקופית מיקרוסקופ על נייר טישו יבש (התחתון נוטה להיות רטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח קטן של מים (בערך 50 μl) על כרית הרעב. שים coverslip על הכרית ולסחוט את מים עודפים. הסר את עודפי מים עם נייר טישו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את שקופיות מיקרוסקופ על שולחן ההתבוננות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לקבל סקירה כללית של צמיחת תפטיר, להשתמש אובייקטיבי 20X. מטרות השימוש 63X או 100X ללימוד הלוקליזציה של ה- GFP בעובש. על מנת למנוע התייבשות הדרגתית של המדגם לא לנתח דגימות ליותר מ -15 דקות לפני שמכניס אותם בחזרה לתוך החדר הרטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 5.3 במרווחי זמן קבועים (לדוגמא, לאחר 40 שעות ו -60 שעות של צמיחה). הערה: המדגם ניתן להחזיר לתא הרטוב. אין צורך להסיר את coverslip כפי שהוא אינו משפיע על צמיחת תפטיר. </li></ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li>
<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
<li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li>
<li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li>
<li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li>
<li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding%2C+improving+and+using+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li>
<li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li>
<li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).</li>
</ol>

למחבר אין מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת מחקר והנוח לשחזור של autophagy בפ chrysogenum. לדוגמא, ניתן להשתמש בו לסינון היעילות של תרכובות שונות אם הם מסוגלים ויסות תגובת autophagy של פטרייה זו או לא. התוצאות עם rapamycin להוכיח כי עיכוב של איתות TOR מוביל לאינדוקציה בולטת של autophagy בפ chrysogenum שגם הודגם עבור אורגניזמים אחרים 11. ניתן להשתמש mycelia גדלה על רפידות רעב לניתוח במיקרוסקופים מתוחכמים ...

פטריות פילמנטיות הן מערכות מודל מצוינות לחקר תהליכים התפתחותיים. הם מציעים מספר יתרונות ניסיוניים כמו טיפוח זול, מספרים גבוהים של צאצאים ונגישות גנטית. הנקודה האחרונה היא רלוונטית במיוחד לבניית transformants המאפשרים לחקור את החשיבות של גנים, עד כה, uncharacterized למנגנונים תאיים שונים. פטריות פילמנטיות כבר סייעו להבהרה של מספר גורמים ומנגנונים של מסלולי בקרת איכות סלולריות כמו פעילות פרוטאז לפירוק של חלבונים חריגים, דינמיקה של המיטוכונדריה לשמירה על השלמות וautophagy המיטוכונדריה להסרת עודפים ו / או רכיבי תא מתפקדים ולשמירה כדאיות תא בזמנים של 1,2,3 רעב. ישנן מספר שיטות ניסיוניות זמינות ללימוד autophagy בפילמנטיות פטריות 2: חקירה (i) של vacuoles if הם מכילים גופי autophagic צפופים כאשר פרוטאזות מעוכבת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים 4, (ii) להדמיה של autophagosomes על ידי ניטור מוקדי GFP-Atg8 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 5,6 וכן (iii) זיהוי של מבני autophagosomal acidified באמצעות קדברין monodansyl צבע פלואורסצנטי 7. כאן, שיטה חדשה של גובר chrysogenum Penicillium ללימודי autophagy מוצגת. האלמנט העיקרי הוא &#39;פנקס הרעב&#39;, שפשוט מורכב של 1% מומסים agarose במים ברז מעוקר. תרכובות נוספות (למשל, לחצים, אוכלי נבלות, מאפנני autophagy) ניתן להוסיף לפנקס כל עוד הם לא להציג אוטומטי הקרינה. הכרית ממוקמת בשקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי רדוד. פנקס זה במחוסן או עם השעיה נבג או עם שברי תפטיר קטנים. האחרון הוא מומלץ אם המתח של עניין אינו sporulatדואר יעילות (למשל, זני atg1 Δ 8). השקופיות ממוקמות בתאים רטובים (ניתן לבנות האלה בקלות על ידי שימוש בתיבות קצה פיפטה ריקות) כדי למנוע התייבשות של המדגם וטופחו בטמפרטורת חדר. P. chrysogenum הוא מסוגל לגדול לכמה ימים בתנאים אלה. Autophagy ניתן לצפות מיקרוסקופי על ידי הגדלת vacuolar אשר מהווה סמן חיובי לפטריית autophagy. בתרומה זו, P. זן chrysogenum (Wisconsin 54-1255) משמש המהווה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא ממוקד לperoxisomes על ידי הרצף &#39;SKL&#39; C-המסוף שלה 9. לכן ניתן לעקוב אחר השפלה של peroxisomes. זה אפשרי לתייג גם תאים אחרים של התא (לדוגמא, מיטוכונדריה) באמצעות אותות לוקליזציה מתאימים ולנתח שפלתם. למרות נתונים מפ chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) מוצג כאן, זה בהחלט אפשרילהשתמש בשיטת &#39;פנקס רעב &quot;גם לפטריות פילמנטיות אחרות (למשל, crassa Neurospora, macrospora Sordaria, מיני Aspergillus, וכו&#39;).

<table><tbody><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ עם חלל מרכזי</td><td>Carl Roth GmbH, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>H884.1</td><td>ניתן להשתמש בהם מספר פעמים לאחר הניקוי.</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>Carl Roth GmbH, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>A553.1</td><td>קוטר: 0.25 - 0.50 מ"מ</td></tr></tbody></table>

ניתוח של autophagy ב<em&gt; chrysogenum penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

חקר מערכות בקרת איכות תאיות התגלה כתחום דינמי ורלוונטי ביותר למחקר עכשווי. התברר כי לתאים יש מספר קווי הגנה מפני נזק למולקולות רלוונטיות מבחינה ביולוגית כמו חומצות גרעין, שומנים וחלבונים. בנוסף לדינמיקה של אברונים (היתוך/ביקוע/תנועתיות/תורשה) ופעילות פרוטאז מבוקרת היטב, פירוק של אברונים עודפים, פגומים או פגומים על ידי אוטופגיה ('אכילה עצמית' תאית) זכה לתשומת לב רבה מהקהילה המדעית. הרגולציה של אוטופגיה היא מורכבת למדי ותלויה בגורמים גנטיים וסביבתיים, שרבים מהם לא הובהרו עד כה. כאן מוצגת שיטה חדשנית המאפשרת מחקר נוח של אוטופגיה בפטרייה החוטית Penicillium chrysogenum. הוא מבוסס על גידול הפטרייה על מה שמכונה 'רפידות רעב' לגירוי אוטופגיה באופן הניתן לשחזור. הדגימות נבדקות ישירות על ידי מיקרוסקופיה ומוערכות לאינדוקציה / התקדמות אוטופגיה. הפרוטוקול המוצג כאן אינו מוגבל לשימוש עם P. chrysogenum וניתן להתאים אותו בקלות לשימוש בפטריות חוטיות אחרות.

כדי להדגים את התועלת של הפרוטוקול המפורט לעיל השפלה peroxisome בפ זן chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) נותח. בזן זה GFP-SKL בדרך כלל מיובא לperoxisomes 9. התוצאה היא ההופעה של צורות כדוריות מרובות כאשר המדגם מנותח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם autophagy מתרחש, vacuoles להגדיל. GFP-SKL הופך שולב vacuoles ידי autophagy (pexophagy). בשל העובדה שGFP הוא עמיד בפני פירוק על ידי פרוטאזות vacuole זה תוויות אברונים אלה 10. לכן שני הפרמטרים להתבוננו...

מוצגת כאן שיטה נוחה וחזקה לחקר אוטופגיה ב-Penicillium chrysogenum באמצעות רפידות הרעבה (תערובות של אגרוז ומי ברז בשקופית מיקרוסקופ המכילה חלל מרכזי).

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

מטרת הליך זה היא להשרות ולבחון אוטופגיה בפטרייה חוטית. הדבר משיג תחילה על ידי החדרה של נבגים או חתיכות מיצליום קטנות לנפחים קטנים של מצע המכיל חומרי הזנה. בשלב השני, מכינים רפידות הרעבה בחללי השקופיות של מיקרוסקופ זכוכית, ולאחר מכן מעבירים את התרבית המהודר על הרפידות.בשלב הסופי, פדי ההרעבה מדגגרים בתא רטוב כדי להשרות אוטופגיה. לבסוף, ניתן לעקוב אחר האוטופגיה על ידי ניטור translocation של חלבוני סמן פלואורסצנטיים רלוונטיים אל הוואקואולות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לסייע בחקר סוגיות מרכזיות בתחום הביולוגיה של התא, כגון זיהוי תרכובות חדשות המודולות את תהליך האוטופגיה.כדי להכין את הניסוי לרעב, אם זן ה-P cresa genum הרלוונטי נשמר על אורז ירוק, ראשית יש להניח שתי עד שלוש גרגירי אורז המכוסים במיצליום בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.5 µL, ולמלא את המבחנה ב-500 µL של מצע גידול תמצית שמרים וגלוקוז או מצע GG. לאחר מכן, יש לערבל את המבחנה בוורטקס למשך 30 שניות כדי שהנבגים יdetached מהאורז, ולהדגיר את המבחנה למשך יום אחד בטמפרטורת החדר. למחרת, יש לדלל את תרחיף הנבגים לריכוז של 1:50 במי ברז סטריליים ולערבב היטב; אם ה-p cryogen נשמר על אגר.השתמשו בטיפ של פיפט כדי להעביר חתיכות קטנות של המייסליום למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מילליטר המכילה 400 µL של מי ברז סטריליים וכ-100 mg של כדורי זכוכית. לאחר מכן, ערבבו את המבחנה במכשיר וורטקס למשך שתי דקות כדי שהמייסליום יתפרק. כדי לגדל את ה-PCE genum על מצע הרעבה (starvation pad), חממו תחילה את לוח החימום לכ-60 °C.בשלב הבא, חממו שני גרמים של aros ב-100 milliliters של מי ברז במיקרוגל עד שהתמיסה המתקבלת תהיה צלולה לחלוטין, בעוד ה-aros מתקרר לכש 60 degrees Celsius. מלאו micro centri tube של 1.5 milliliter עבור כל דגימה ב-400 microliters של מי ברז סטריליים או תמיסת תרכובת. לאחר מכן, חממו את המבחנות ואת השקופיות למיקרוסקופ על פלטת החימום למשך 60 שניות לפחות.העבירו 400 µL של aros בטמפרטורה של 60 °C לכל אחת מהמבחנות, כך שהנפח הכולל בכל מבחנה יהיה 800 µL, וערבבו קצרה במכשיר vortex, ולאחר מכן החזירו את המבחנות ללוחית החימום כדי למנוע התמצקות מוקדמת. כעת, פפלו 140 µL של תמיסת aros המתאימה לתוך השקע של כל זכוכית מיקרוסקופ. תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות, השטיחו מיד את ה-aros באמצעות זכוכיות כיסוי, והמתינו כארבע דקות.בטמפרטורת החדר, כאשר פדי ה-aros התמצקו, השתמשו בבוהן או באצבע המורה כדי להחליק בזהירות את לוחות הכיסוי ולהעביר את סממייד המיקרוסקופ והפדים לתא לח. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפטה 5 µL של P er genum שהוכן מראש למרכז פד ההרעבה, ועטפו את התא הלח בשקית פלסטיק להגנה נוספת מפני התייבשות, תוך הקפדה לא להזיז את הקופסה יותר מדי או להפריע לתרביות. לאחר מכן, אחסנו את התרביות בטמפרטורת החדר למשך 20 שעות לפחות לפני ניתוח הדגימות.ביום למחרת, העבירו את השקופיות לנייר סופג יבש ולאחר מכן תקרו 50 µL של מים על כל פד הרעבה. השתמשו בכיסוי זכוכית (cover slip) כדי לסחוט את עודפי המים ולהסירם באמצעות נייר סופג נקי. לאחר מכן, עבור כל שקופית, השתמשו בעדשה עם הגדלה של 20x כדי לקבל סקירה כללית של צמיחת המיסליום.כדי להעריך את מיקומו של ה-GFP ב-Hy-Fi, פתחו את התמונות בעזרת עדשה של 63x או 100x. לבסוף, החזירו את השקופיות לתא הלחות לאחר כל בדיקה עד למועד הניסוי הבא.בתמונות אלו, נעשה שימוש בזן ה-G-F-P-S-K-L-P Creo Genum כדי להעריך את פירוק הפרוקסיזומים לאחר 20 שעות של דגירה. לא נצפה GFP בוואקואולות, ואלו לא היו מוגדלות. עם זאת, לאחר 40 שעות של צמיחה, ניתן היה להבחין בוואקואולות מסומנות ב-GFP בחלק מההיפים, מה שמעיד על הפעלת אוטופגיה, כאשר ב-60 שעות נצפו פלואורסצנציית GFP וואקואולות מוגדלות.בניסוי זה, נעשה שימוש במוטציה delta 80 G של p caressa Genum כבקרה שלילית. שימו לב להיעדרה של התרחבות הוואקואולות ושל GFP, אפילו לאחר 60 שעות צמיחה. כבקרה חיובית, נעשה שימוש בתרופה rapamycin המגרה אוטופגיה, כפי שנצפה במאסטר G-F-P-S-K-L שלא טופל. ואקואולות המסומנות ב-GFP הפכו לנראות לאחר 40 שעות צמיחה, כאשר ה-Hy-Fi התמלא לחלוטין בוואקואולות ענקיות המכילות GFP עד לשעה ה-60.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה של אופן ניתוח האוטופגיה בפטריות מנטיס.

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP). פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם הנגרם CLP מוצגים כאן: פרוטוקול למדידת autophagy באמצעות עכברים (GFP)-LC3, ופרוטוקול למדידת היווצרות autophagosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

כדי לנטרל את הפצת הפתוגן, תאי מארח לארגן מחדש את שלד התא שלהם למדר חיידקים ולגרום autophagy. זיהום Shigella שימוש של תאי רקמת תרבות, מארח וגורמי הפתוגן שבבסיס תהליך זה זוהה ואופיין. תוך שימוש במודלי דג הזברה של זיהום Shigella, התפקיד של מולקולות ומנגנונים גילו נחקרים in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי אופטימלי על חתך המבוסס על תיוג אנדוגני פלואורסצנטי ככלי לחקר לוקליזציה של חלבונים נדירים ביחס לאולטרה-מבנה תאי. כוחה של גישה זו מודגם על ידי לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני בתאים מורעבים ללא טיפול Bafilomycin.

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

למדו לחקור אוטופאגיה בפטריית Penicillium chrysogenum באמצעות רפידות רעב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השיטה מאפשרת מעקב אחר תנועת סמנים פלואורסצנטיים לוואקואולות וזיהוי תרכובות המשפיעות על התהליך.

ניתוח של Autophagy ב

גלה סרטונים נוספים