בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ"א

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים שלוש שיטות PCR שונות מבוססות בדיקה בזמן אמת המשמשות לכימות מיקרו RNA בדגימות פלזמה וסרום. PCR מבוסס בדיקה בזמן אמת מושג על ידי הידרוליזה וזיהוי של הגשושית המתויגת פלואורסצנטית, המכילה מדווח פלואורסצנטי ומרווה. כאשר הפולימראז הנדבק משתרע מהפריימר במעלה הזרם ומגיע לקצה החמישי של הגשושית, הוא מוביל לדיסוציאציה פיזית של הפולט הפלואורסצנטי מהמרווה.

לאחר מכן, משתחררת מולקולה בודדת של פלואורו ארבע, אשר נרשמת על ידי הגלאי ומוצגת כעלייה מצטברת באות הפלואורסצנטי מאותה תגובה. בסופו של דבר, ניתן למדוד את כמות תוצר ה-PCR שנוצר על סמך העלייה בקרינה, מה שמאפשר כימות מדויק של מגבר המטרה המוגבר. שיטה זו מסתמנת כשיטה מבטיחה לגילוי סמנים ביולוגיים חדשים לסוגי סרטן שונים ומחלות אחרות כגון סוכרת.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שפע המיקרו-RNA בסרום ובפלזמה, ניתן ליישם אותה גם על דגימות אחרות כגון תאים ורקמות היקפיות. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית מכיוון שחלק מהשלבים הכרוכים באיטום שקופית מערך הננו-נוזלים יכולים להיות קשים ללמידה פשוט על ידי קריאת הפרוטוקול לזיהוי מיקרו RNA בוגר PCR כמותי מבוסס בדיקה בזמן אמת ב-4.2 מיקרוליטר של ריאגנט QPCR בודד מתערבב לכל באר של צלחת אופטית של 96 בארות, ואחריו 0.8 מיקרוליטר של תמיסת תגובת ה- CDNA הטרייה המתאימה. אטום את הצלחת עם המכסה האופטי המתאים ולאחר מכן הפעל את ה-QPCR במערכת ה-PCR בזמן אמת.

כדי להכין כרטיס מערך מיקרופלואידיקה עם אחד עד 1000 ננוגרם של קלט התחלתי RNA כולל, יש להפשיר תחילה את מאגר הפריימרים A ו-B, פוספטים נוקלאוטידים דאוקסי, מגנזיום כלוריד ומעכב RNA על קרח. לאחר מכן, כדי לבצע שעתוק הפוך, יש להוציא 100 ננוגרם מכל דגימת RNA לתוך צינור בריכה A או בריכה B, ולאחר מכן להוסיף את הנפח המתאים של מים נטולי נוקלאז כדי להביא את הנפח הכולל בכל צינור לשלושה מיקרוליטר. לאחר מכן, 4.5 מיקרוליטר של מגיב השעתוק ההפוך המתאים מתערבבים לתוך הצינורות המתאימים.

לאחר מכן הכניסו את הדגימות לתוך התרמו-סייקלר והתחילו בתמלול הפוך. בזמן שעתוק הפוך מתקדם. עבור סך כניסות דגימת RNA בין 1 ל-350 ננוגרם מפשירים את המאגר המוגדר מראש של פריימרים להגברה מראש על קרח כאשר הדגימות מוכנות, כולל 22.5 מיקרוליטר של מגיב הקדם-מגבר המתאים.

מערבבים לתוך צינורות הבריכה A ובריכה B ומוסיפים 2.5 מיקרוליטר מדגימת ה-CDNA המתועתקת ההפוכה לכל אחד. לאחר מכן טען את הדגימות לתוך התרמו-סייקלר והתחל את מחזור הקדם-מגבר. בסוף המחזור, הוסף 75 מיקרוליטר של 0.1 x tris EDTA מאגר ל-CDNA המוגבר מראש כדי לטעון את כרטיס המיקרופלואידיקה.

לאחר מכן, הוסף 450 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים QPCR לתשעה מיקרוליטר של ה-CDNA המוגבר המדולל PREPL עבור כרטיס A, השתמש במוצר המוגבר PREPL שהוכן באמצעות מאגר הפריימר A והוסף 441 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז לנפח סופי של 900 מיקרוליטר. לאחר מכן, ברגע שהוא מגיע לטמפרטורת החדר, הסר את כרטיס המערך בצפיפות נמוכה של איש ההדבקה מאריזתו והנח אותו עם נייר הכסף כלפי מטה על שטח נקי. הוסף 100 מיקרוליטר של תגובת PCR.

יש לערבב בכל אחת משמונה יציאות המילוי בכרטיס. סובב את הכרטיס למשך דקה אחת ב-331 GS וטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בתנועה איטית, יציבה ואחידה אחת, דחף את הכרכרה על פני הכרטיס עד שתגיע לנקודת הקצה של הסילר.

הסר את כרטיס המערך האטום וחתך את המאגרים. לאחר מכן ודא שהמכסה המחומם הנכון ומנשא הדגימה מותקנים במערכת PCR בזמן אמת של מערך המיקרופלואידיקה. כדי לטעון את מערכי הננו נוזלים, יש להפשיר את ה-prepl המדולל, ה-CDNA המוגבר ולתפוס את מגיב ה-QPCR בזמן אמת.

מערבבים ומערבבים את בקבוק המגיב QPCR על ידי מערבולת. לאחר מכן, הוסף 22.5 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים QPCR ל-22.5 מיקרוליטר של CDNA מדולל ומוגבר. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר מכל דגימה לשמונה בארות של זרימת העבודה של מערך הננו-נוזלים 384 צלחת דגימת באר תוך הקפדה על מיקום הבריכה A ובריכה B של כל דגימה.

בשמונה גושי באר סמוכים כאשר כל הדגימות הועברו, כסו כל חלק של הצלחת בחתיכות של אוטם צלחת דגימה של מערך פתוח. לאחר מכן הפשירו את החלקה הראשונה של מערך הננו-נוזלים לטמפרטורת החדר לאחר כ-15 דקות. אישר כי מכסה עריכת הבלוק הנכון ומנשא הדגימה מותקנים במערכת מערך הננו-נוזלים, ולאחר מכן שחרר את הבוכנה של מזרק נוזל הטבילה במשיכה עדינה.

הסר את המכסה, הניח את הקצה במקומו ושטוף את האוויר מהקצה. לאחר מכן הנח את קצות מערכת הטעינה בתוך מערכת הטעינה. פתח את המכסה והנח את לוחית הדגימה למערכת הטעינה.

עכשיו לבש זוג כפפות מתאימות היטב. פתח בזהירות את אריזת השקופיות והטה לאט את השקופית החוצה מהאריזה מבלי לגעת בחלק העליון. הנח את המגלשה לתוך מערכת הטעינה עם הברקוד משמאל.

לאחר מכן הסר את הסילר מהחלק של לוחית הדגימה המיועדת לטעינה, והשתמש בתוכנת מערכת הטעינה כדי להזין את מיקום שקופית ברקוד השקופיות, מיקום הדגימה ותצורת הקצה. בזמן שהמגלשה נטענת, הסר את הפלסטיק השקוף והאדום מתחתית מכסה השקופיות. לאחר מכן הסר ואטום בזהירות את השקופית תוך 90 שניות מסיום תהליך הטעינה.

הנח את השקופית בתוך הצלחת clamp ואת מכסה ההחלקה על המגלשה למשך 30 שניות וודא שהמכסה ממוקם כך שהברקוד מוצג כהלכה. לאחר מכן מקם את מזרק נוזל הטבילה בתוך המגלשה כך שהקצה לוחץ על המכסה ומלא לאט את השקופית בנוזל טבילה תוך הקפדה שהנוזל יעבור לאורך המכסה. לאחר שהמגלשה מלאה, אטום אותה עם התקע, סובב את הבורג עד שהידית מתנתקת.

לבסוף, הסר את מכסה הפלסטיק בחלק העליון של מכסה השקופיות והנח בזהירות את השקופית לתוך מנשא השקופיות של מערכת ה-PCR בזמן אמת. הקפד לתמוך בתחתית המגלשה בזמן שהיא מונמכת מבלי לגעת בחלק העליון של המגלשה. לאחר מכן אתחל את מערכת ה-PCR והתחל את תוכנית ה-PCR הכמותית תוך שעה מטעינת הדגימות.

באמצעות הליך זה, נפח תגובה של חמישה מיקרוליטר יכול לייצר תוצאות דומות לאלו שהושגו באמצעות נפח של 20 מיקרוליטר עם מתאם חזק. עד 39 מחזורים כאן, אלטמן תפל ותרשימי מתאם מוצגים עבור כל 754 המיקרו-RN שנבדקו באותה דגימה באמצעות כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה, שכן מיקרו-רנ"א שהודגמו זה עתה שיש להם ערכי CT בין אפס ל-19.99 בשני המסלולים מציגים גם ביטויים דומים עם מקדם קביעה של 98%יתר על כן, מספר המיקרו-רנ"א עם הבדלים משמעותיים שנצפו בין הניסויים גדל כאשר בוחרים ערכי CT בין 30 ל-40. בגרף זה מוצגים נתוני פלטפורמת מערך הננו-פלואידיקה עבור כל 754 המיקרו-רנ"א.

חשוב לבחון את עקומות ההגברה כדי לוודא שהתוצאות מעידות על הגברה אמיתית. יש לבחון גם מיקרו-רנ"א של משק בית, כגון U 6, לשונות. לדוגמה, בגרף זה, מוצג אשכול טיפוסי של U שש שכפולים המציגים סטיית תקן נמוכה המציין את מהימנות הנתונים.

לבסוף, נתונים אלה ממחישים את השונות המוגברת של U 6 שכפולים בדגימה שנייה. טכנולוגיות מבוססות בדיקה בתפוקה גבוהה כגון מערכי המיקרופלואידיקה ו-Nana fluidics מציעות את הקלות לזהות באופן שחזורי ויעיל את השפע של מיקרו-RNAs מרובים במספר רב של דגימות בזמן קצר מאוד. כל אחד מתהליכי העבודה נועד לתת מענה לתפוקות שונות בהתבסס על מספר מטרות המיקרו-RNA ומספר הדגימות שיש לנתח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע טכניקות PCR שונות המבוססות על בדיקה בזמן אמת עבור התמחות בשפע מיקרו NA.