שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין אינטראקציות ביופילם עם הסביבה הסובבת באמצעות שיטות משולבות לשם כך. מערכת תאי זרימה מיקרופלואידית עם כניסה כפולה בנויה בה נשאבים מדיה המכילה גלוקוז ונטולת גלוקוז על פני תא זרימה היוצר שיפוע גלוקוז. חיידקים מתווספים למערכת ומאפשרים לביופילם להתפתח במהלך מספר ימים.

לאחר מכן הביופילמים מצולמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת מימדית כדי לאפיין את הובלת הסולו. בתוך ביופילמים, עוקבים פלואורסצנטיים מוזרקים למערכת הזרימה ומבוצעת הדמיית זמן-lapse כדי לאפיין את שדה הזרימה סביב מושבות ביופילם, מוזרקים מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים ומבוצעת הדמיית זמן-lapse. הובלת מומסים וניתוח מעקב אחר חלקיקים של הנתונים המתקבלים מדגימים את התועלת של שיטה זו בהערכת תהליכי ביופילם בסביבות כימיות שונות בתוך מכשיר יחיד ובסט אחד של ניסויים.

היתרון העיקרי של שיטות אלה הוא שהן מאפשרות הערכה בו-זמנית של היבטים מרובים של אינטראקציות סביבתיות ביופילם. השיטות המדווחות כאן יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי היווצרות ביופילם בסביבות טבעיות או בזיהומים הקשורים לביופילם. עבודה במכסה זרימה למינארי מעבירה מושבה של posa PAO אחד GFP סוף מושבה של e coli DH חמש אלפא מצלחת LB לצינורות נפרדים המכילים שלושה מיליליטר מרק lb.

דגרו על התרביות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות ב-225 סל"ד. מערכת זרימה זו מבוססת על תא מיקרופלואידית עם כניסה כפולה המאפשרת תצפית על צמיחת ביופילם תחת שיפוע כימי מוגדר היטב שנוצר על ידי ערבוב שתי תמיסות בתוך תא הזרימה. במהלך הזרימה נוצר שיפוע ריכוז חלק בכיוון הרוחבי.

כתוצאה מהדיפוזיה, פרופיל הריכוז תלול ליד הכניסה ורגוע יותר במורד הזרם. ביום הניסוי, הרכיבו בזהירות את מערכת הזרימה. ראשית, מהדקים את הצינור לתוך המשאבה הפריסטלטית, ואז מחברים קצה אחד של הצינור לבקבוק בינוני המכיל 900 מיליליטר של מדיום FAB עם גלוקוז, ואת הקצה השני למלכודת בועות.

חזור על תהליך זה כדי לחבר בקבוק בינוני שני המכיל 900 מיליליטר של פאב ללא גלוקוז למלכודת בועות שנייה. לאחר מכן, הכנס שסתומים תלת-כיווניים ממש לפני כניסות תא הזרימה וחבר כל אחת ממלכודות הבועות לתא הזרימה. לבסוף, חבר את יציאת תא הזרימה לבקבוק פסולת.

ודא שתא הזרימה ממוקם כשצד החלקת הכיסוי כלפי מטה כדי לאפשר לתאים תלויים להתיישב על החלקת הכיסוי. לאחר הרכבת מערכת הזרימה, הפעל את המשאבה הפריסטלטית בקצב זרימה של 10 מיליליטר לשעה עבור כל כניסה למילוי המערכת עם המדיום הבינוני מוכנס לשני הכניסות עם גלוקוז המסופק רק בכניסה אחת. לאחר מכן, בעבודה במכסה המנוע, יש לדלל את שתי תרביות החיידקים ליחס של אחד לאחד במיליליטר אחד של מים סטריליים עם OD שווה ערך של 600 של 0.01 לכל חיידק כדי לחסן את תא הזרימה, השתמש במזרק פלסטיק סטרילי כדי להזריק 500 מיקרוליטר של החיסון לכל אחד מכניסות תאי הזרימה דרך השסתום התלת-כיווני.

לאחר ההזרקה, עצרו את המשאבה ואפשרו לתאי החיידקים להיצמד לזכוכית המכסה למשך שעה לאחר חיבור התאים, כוונו את המשאבה ל-0.03 מיליליטר לדקה עבור כל כניסה ואפשרו למערכת לזרום במשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר שבמהלכם מתפתח ביופילם תחת שיפוע של חשיפה לגלוקוז. לאחר שעברו שלושה ימים. השתמש בטוש ובסרגל כדי לצייר רשת בצד זכוכית הכיסוי של תא הזרימה כהכנה להדמיה.

זה יסייע באיתור אזורי ההדמיה כדי להתמודד עם כתמים לצפייה ב-e coli. ראשית, כבה את האורות כדי להחשיך את אזור העבודה מכיוון שכתם הדלפק רגיש לאור. השתמש במזרק כדי להזריק לאט מיליליטר אחד של כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית אדום מדולל לתוך השסתום התלת-כיווני במעלה הזרם של תא הזרימה.

עצרו את הזרם. שמור על תא הזרימה עומד בחושך למשך 30 דקות. לאחר שחלפו 30 דקות.

המשך את הזרימה במהירות של 0.03 מיליליטר לדקה ושטוף את הכתם הלא קשור למשך 15 דקות. לאחר מכן עצרו את הזרימה והתבוננו בביופילמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם מטרה של פי 63. מצאו שדה ראייה שמכיל כמות טובה של ביומסה עם מושבות ביופילם שמופרדות היטב כפי שמוצג כאן.

לאחר מכן לכוד ערימות תמונות תלת מימד בערוצים המתאימים כדי למפות את הדפוסים המרחביים של התפתחות הביופילם בתוך תמונת תא הזרימה, את הביופילמים בשלושה מרחקים אורכיים או X או יותר לאורך כניסת תא הזרימה, ובשלושה מיקומים רוחביים או Y ביחס לשיפוע התזונתי שנכפה. כדי לאפיין דפוסי הובלת סולו בתוך הביופילם, התחל בתא הזרימה. לאחר שלושה ימים של פיתוח ביופילם, שוב, עבודה בחושך.

עצור את המשאבה כדי להשהות את הזרימה, פתח את מלכודות הבועות כדי לשחרר את לחץ ההזרקה. לאחר מכן השתמש במזרק כדי להזריק מיליליטר אחד של תמיסת מעקב מדע בדיוני מדוללת לאחד מהשסתומים התלת-כיווניים במעלה הזרם של תא הזרימה. לאחר הזרקת תמיסת המדע הבדיוני, סגור את מלכודות הבועות.

כוונן את השסתום התלת-כיווני והפעל מחדש את המשאבה ב-0.03 מיליליטר לדקה כדי להעביר את תמיסת המדע הבדיוני לתא הזרימה. לאחר מכן, העבר את מצב ההדמיה הקונפוקלית ל-XYT עם קצב פריימים של 0.15 הרץ. רזולוציה זמנית גבוהה עדיפה לביטוי מילולי של חדירת הצבע, עם זאת, סריקה מהירה מפחיתה את איכות התמונה.

אז הגדר את מהירות הסריקה וממוצע הקו כדי לאזן את רזולוציית הזמן של התמונה ואיכות התמונה. לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, הפעל מחדש את המשאבה כדי לחדש את הזרימה. בקצב של 0.03 מיליליטר לדקה, מדע חמש יועבר לתא הזרימה בו זמנית.

התחל הדמיה קונפוקלית בהילוך מהיר. לאחר השלמת הדמיית הזמן-lapse. בוצע ניתוח דיפוזיה על פי ההוראות במסמך הנלווה.

כדי לאפיין את שדה הזרימה סביב ביופילמים, יש לדלל את המיקרו-חרוזים הפלואורסצנטיים של מיקרומטר אחד במים מעוקרים לריכוז מוצק סופי של 0.2% ונפח סופי של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן מערבולת כדי לוודא שהמיקרו-חרוזים מפוזרים היטב, עצרו את הזרימה ואז הזריקו והעבירו את המיקרו-חרוזים הפלואורסצנטיים המדוללים לתא הזרימה. כמו קודם, שנה את קצב הזרימה ל-0.01 מיליליטר לשעה.

קצב הזרימה הנמוך מאפשר מעקב מדויק אחר נתיב החלקיקים. העבר את ההגדרות הקונפוקליות למצב XYT והורה לתוכנה לעקוב אחר תנועת החלקיקים בפרוסת Z אחת. צלם תמונות סדרות זמן כמו קודם באמצעות קצב פריימים של הרץ אחד.

חזור על הליך הזרקת החלקיקים והתמונה במיקומי Z שונים. לאחר השלמת ההדמיה, עקוב אחר ההוראות במסמך הנלווה כדי לחשב וקטורי זרימה כדי לחקור אינטראקציות חיידקיות בביופילם תחת שיפוע גלוקוז. Posa GFP ו-E coli הובחנו בביופילמים של מינים כפולים באמצעות צביעה נגדית.

עם cyto נרכשו 62 תמונות בכל אחד מתשעת אזורי ההדמיה בתא הזרימה. בשכבות המוצגות כאן, posa GFP מופיע בירוק או צהוב, ו-e coli מופיע באדום. Posa שלט בביומסה של ביופילם באזורים עם ריכוזי גלוקוז גבוהים ואי קולי שלט באזורים עם ריכוזי גלוקוז נמוכים.

כך תפסו שני המינים נישות אקולוגיות נפרדות. תוצאות אלו מדגימות את התועלת של תא הזרימה המיקרופלואידית עם כניסה כפולה בחקר פעילות התפתחות ביופילם ואינטראקציות בסביבות מורכבות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתא זרימה מיקרו נוזלי עם כניסה כפולה לגידול ביופילמים תחת שיפועים כימיים וכיצד להשיג פרמטרים סביבתיים לפיתוח ביופילם באמצעות הזרקות של חלקיקים פלואורסצנטיים או צ'ייסרים לאחר הפיתוח.

שיטות אלה סללו את הדרך לחוקרים בתחומי המיקרוביולוגיה הסביבתית והקלינית לחקור אינטראקציות מורכבות בין קהילות מיקרוביאליות לסביבתן.