ניתוח גנטי משופר של Bioparticles האדם יחיד ששוחזרו על ידי פשוטה מיקרומניפולציה מהראיות משפטית "Touch DNA"

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשחזר תאים בודדים או מצטברים המכונים חלקיקים ביולוגיים משוערים מראיות DNA מגע פורנזי ולקבל פרופיל DNA של התורם. במהלך ביצוע פשע אלים, מספר קטן של תאים מועברים מאדם לאדם אחר, כמו למשל כאשר תוקף תופס את פרק כף היד של הקורבן. על מנת לשחזר תחילה את מספר התאים הקטן, השתמש בסרט ג'ל בעל הידבקות נמוכה המחובר לשקופית מיקרוסקופ כדי לדגום את אזור המגע.

השלב השני הוא צביעת חלקיקי הביו המועברים לצפייה קלה יותר במיקרוסקופ. לאחר מכן, בודד את חלקיקי הביו מסרט הג'ל באמצעות מיקרומניפולציה. אסוף את הדבק המסיס במים בקצה מחט טונגסטן והשתמש בו כדי להסיר חלקיקים ביולוגיים מעניינים משטח סרט הג'ל.

השלב האחרון הוא להעביר בזהירות את החלקיקים הביולוגיים שנאספו בנפרד לתערובת הגברת PCR בתחתית אוסף PCR כדי שבסופו של דבר נעשה שימוש בשיטות הקלדת DNA משופרות להשגת פרופיל DNA של התורם של עקבות ראיות DNA. אוקיי, במעבדה שלי אנו מתמקדים בניתוח גנטי של מספר קטן של תאים המועברים במהלך ביצוע פשע אלים נגד אדם בין אדם אחד לאדם אחר, או בין אדם לאובייקט. שיטות מסורתיות לרוב לא מצליחות לשחזר את פרופיל ה-DNA ממספר כה קטן של תאים.

כאן פיתחנו שיטה פשוטה לשחזור פיזי וניתוח גנטי של מספר כה קטן של תאים, תאים בודדים או אגרומרטים של תאים שניתן לשלב בכל מעבדה משפטית. מי שתדגים את ההליך תהיה קייטי פייריש, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את סרט הג'ל שישמש לאיסוף חלקיקי ביו

חותכים את סרט הג'ל לגודל הרצוי המתאים לשקופית מיקרוסקופ הזכוכית המשמשת כתמיכה מוצקה. לדוגמה, עבור מגלשת זכוכית של שלושה אינץ' על אינץ' אחד, השתמש בגודל סרט הג'ל של שני אינץ' על 0.75 אינץ'. הסר את הגב הלבן מסרט הג'ל והצמד את סרט הג'ל לשקופית המיקרוסקופ ולחץ כלפי מטה בחוזקה כדי להבטיח חיבור מלא.

שימו לב שקיימת שכבת מגן עליונה ברורה שאסור להסיר כדי לאפשר הפעלת לחץ לאורך פיסת סרט הג'ל מבלי לזהם את משטח סרט הג'ל ניתן לאחסן שקופיות סרט ג'ל מוכנות עם שכבת המגן המחוברת בטמפרטורת החדר עד הצורך. כאשר אתה מוכן להשתמש בסרט הג'ל, השתמש בפינצטה סטרילית כדי להסיר את שכבת ההגנה העליונה השקופה הנח את משטח סרט הג'ל במגע ישיר עם חפץ או משטח רצוי שנגעו בו.

לדוגמא, עור אנושי מפרק כף היד. הפעל כמות קטנה של לחץ כדי להבטיח העברה יעילה של חלקיקי ביו לסרט הג'ל. אל תפעיל לחץ רב מדי מכיוון שמגלשת הזכוכית עלולה לשבור דגימות מרובות מאותו חפץ או שניתן לאסוף משטח על אותה פיסת סרט ג'ל באותו אופן, ניתן לאסוף חלקיקי ביו מחפצים ופריטי לבוש כגון צווארון חולצה.

כדי לאשר את העברת חלקיקי הביו לסרט הג'ל, בדוק את השקופית במיקרוסקופ סטריאו באמצעות תאורת טרנס או אפי. הגדלה של כ-20x היא הטובה ביותר לצפייה באזורים גדולים יותר של סרט הג'ל, בעוד שהגדלה של כ-200x היא הטובה ביותר לצפייה בחלקיקים ביולוגיים בודדים. אחסן את שקופית הדגימה של סרט הג'ל בטמפרטורת החדר בקופסת שקופיות מכוסה.

עד שהם מוכנים לצביעה ו/או לאיסוף חלקיקי ביו, ניתן לצבוע חלקיקי ביו כדי לסייע בהדמיה. כדי להשיג זאת במקום הראשון שקופית הדגימה של סרט הג'ל שהוכנה כפי שהוצג קודם לכן על מתלה צביעת שקופיות מעל כיור. בעזרת פיפטת העברה חד פעמית מכסים את כל משטח סרט הג'ל עם דגירה של כתם כחול טריאן בטמפרטורת החדר למשך דקה עד שתיים.

הסר כתם עודף על ידי הטיית השקופית כדי לאפשר לכתם להתנקז לכיור במידת הצורך. ניתן לשטוף את המגלשה על ידי הצפה עדינה במים סטריליים באמצעות פיפטת העברה חד פעמית. לאחר שהמגלשה אווררה מיובשת, צפה בשקופית באמצעות מיקרוסקופ סטריאו כדי להבטיח צביעה נכונה.

ניתן לאחסן את השקופית המוכתמת בטמפרטורת החדר בקופסת שקופיות מכוסה. התחל הליך זה על ידי הנחת המספר המתאים של צינורות PCR של 0.2 מיליליטר במתלה ותיוג הצינורות בהתאם. הכן נפח מתאים של תערובת הגברה STR למספר הדגימות הרצוי.

מערבולת ומאסטר מתערבבים היטב ובקצרה צנטריפוגה בנתיב PI מיני צנטריפוגה. 3.5 מיקרוליטר הגברה. יש לערבב לתוך כל שפופרת של 0.2 מיליליטר, לכסות כל שפופרת באופן רופף.

הניחו פיסת סרט דביק דו צדדי ישירות על גוש זכוכית. זה ישמש כדי להחזיק את צינור ה-0.2 מיליליטר במקומו במהלך איסוף הדגימה. הניחו חתיכה נוספת של סרט דביק דו צדדי על שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה.

לאחר מכן הניחו חתיכת סרט כתף גל מסיס במים על גבי הסרט הדביק הדו-צדדי. אבטח את הסרט במקומו על ידי הפעלת לחץ לאורך הסרט. לאחר מכן ניתן להסיר את השכבה הלבנה העליונה המגנה.

לאחר מכן, הניחו את הצינור הראשון של 0.2 מיליליטר על הסרט הדביק הדו-צדדי על גוש הזכוכית. הנח את הצינור הזה בצד עד לאיסוף הדגימה. הנח את שקופית סרט חייל הגל המסיס במים מתחת למיקרוסקופ תוך כדי צפייה בהגדלה נמוכה.

השתמש בקצה מחט מעמד לשונות כדי לגרד בעדינות את פני הסרט על מנת לאסוף את הכמות הקטנה או כדור הדבק בקצה המחט. גודל כדור הדבק יהיה תלוי במספר חלקיקי הביו שיש לאסוף בזהירות. הסר את הלשונות.

העמידו מחט עם דבק מתחת למיקרוסקופ מבלי להפריע לקצה המחט. הנח את המחט במתלה במידת הצורך. ההיבט הקריטי ביותר של ההליך הוא איסוף והעברת החלקיקים הביולוגיים.

כדי להבטיח הצלחה, יש לתרגל את הטכניקות עד שהאנליסט בקיא בהן. הנח דגימת סרט ג'ל שהוכנה בעבר על שלב המיקרוסקופ באמצעות גוש זכוכית לתמיכה בשקופית. התאם את המיקוד וההגדלה עד שניתן יהיה לצפות בקלות בחלקיקי הביו

זהה את החלקיקים הביולוגיים שייאספו. אחזר את מחט הטונגסטן עם כדור הדבק והנח את המחט על משטח סרט הג'ל שבו נמצאים חלקיקי הביו המעניינים. לחץ על קצה המחט כלפי מטה כך שיהיה במגע עם החלקיק הביולוגי.

הרם את המחט כלפי מעלה כדי לוודא שהחלקיק הביולוגי נאסף. חזור על תהליך זה עד לאיסוף המספר הרצוי של חלקיקי ביו. הנח צינור PCR מוכן של 0.2 מיליליטר על במת המיקרוסקופ.

כוונן את ההגדלה כך שתחתית הצינור המכיל את תערובת ההגברה תהיה בפוקוס. תוך כדי צפייה דרך המיקרוסקופ, הכנס בזהירות את מחט הטונגסטן לתוך צינור ה-PCR של 0.2 מיליליטר עד שקצה המחט נמצא בתערובת ההגברה. החזק את המחט בתערובת ההגברה עד שהדבק נמס ונצפה שחרור של חלקיקי ביו לתמיסה.

הסר את המחט. הנח את צינור ה-0.2 מיליליטר זקוף וכסה אותו באופן רופף. נקה את מחט הטונגסטן עם מגבון אלכוהול לח מראש וחזור על הליך איסוף זה לדוגמאות נוספות.

כדי להתחיל בפרוטוקול ההגברה המשופר לפרופיל STR אוטוזומלי של חלקיקי הביו שנאספו, הוסף 1.5 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל צינור של 0.2 מיליליטר המכיל תערובת הגברה והחלקיקים הביולוגיים סוגרים היטב את מכסי הצינורות. הנח את הדגימות במחזור התרמי והגביר את הדגימות באמצעות תנאי הרכיבה המתוארים בטקסט הפרוטוקול לאחר השלמת ההגברה אחסן את מוצרי ההגברה בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לגילוי על ידי אלקטרופורזה נימית.

לא מוצגות תמונות מייצגות של חלקיקים ביולוגיים בודדים בדגימת צווארון חולצה. חלקיקי הביו שנאספו מוקפים בעיגול. עיגולים אדומים מצביעים על כך שנמצא פרופיל.

אחוז התאוששות האלל כלול. עיגולים שחורים מצביעים על כך שפרופיל לא נמצא. באופן דומה, תמונות אלה הן של חלקיקי ביו גושים בדגימת צווארון חולצה המוצגת כאן פרופיל STR המתקבל מאחת מדגימות החלקיקים הביולוגיים הבודדים מצווארון החולצה.

הדיוק שלו נקבע על ידי השוואה לפרופיל ייחוס. מספרי האללים מסומנים מתחת לכל פסגה בכל לוקוס. ציר ה-x מייצג את גודל השבר וציר ה-Y מייצג את עוצמת האות.

פרופיל זה הוא באיכות גבוהה עם גבהי שיא מאוזנים למדי וללא נשירה אללית. הפרופיל הבא הוא פרופיל STR מלא המתקבל מאחת מדגימות החלקיקים הביולוגיים הגושים מצווארון החולצה. לבסוף, איור זה מציג דוגמה לפרופיל DNA לא מוצלח של חלקיק ביולוגי בודד עם התאוששות אלל של 3%.

שיטה זו אמורה לקדם שחזור פרופילי DNA ממקור יחיד מתוקפים במקרים של תקיפה פיזית. לא נעלם מעינינו ששיטה זו גם מסירה חלק מהבעיות הקשורות לפירוש ודה-קונבולוציה של פרופילי DNA מעורבים.