Name: כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: למד פרוטוקול סטנדרטי להכנת כתמי דם מיובשים לשימוש באימונואסייז ובטכניקות מולקולריות. השיטה מאפשרת זיהוי אמין של נגיפי הפטיטיס B, C ו-HIV מדגימות קפילריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תקשורת זו מבוססת על התוצאות שפורסמו קודם לכן וירולוגיה יומן17 במצב גישה פתוחה תחת תנאי Creative Commons רישיון (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) עם אחראית המרכזי בתור ברישיון. המחברים בהכרת תודה לאשר שיתוף פעולה פורה במסגרת של מטיס המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות" ("מחקר דרוק") עם מרקוס בארצות הברית, וו קאי, ג'אנג ו ר צימרמן של רוברט קוך-המכון (ברלין, גרמניה), הם אסירי תודה על Moyrer ס' עבור מצלם את התאספו איור 1 גם באשר ד פ Whybrew, ph. d., (גטינגן, גרמניה) לתיקון כתב היד. הם גם לבטא את ההערכה שלהם לקבלת סיוע טכני מיומן כדי ג'יי אקרמן, Bayrambasi א, U. Büttner, Dziubek ס', אני Jakobsche, B. Krellenberg, קרון ה, עמ' Kusimski, א מטקלף, ג'יי Piejek, סער ס', מסיה שרטר, ק' סיידל. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק של משרד הבריאות, הפניה למרכז הלאומי הגרמני עבור הפטיטיס c.

מאז הפרוטוקול מיועד לשימוש בתוכנית האבחון הרפואי, היישום שלה לציית לעקרונות הצהרת הלסינקי19. את החלק הראשון של התוצאות שהוצגו תקשורת זו, הן הסכם נפרד על ידי המטופלים והן אישור על-ידי ועדת האתיקה שנראה שניתן לוויתור משתי סיבות: (1) "עם הקבלה" לבית חולים אוניברסיטת אסן, "כל מטופל מספק הסכמה בכתב כל צורך לחקירות הביוכימי בקטריולוגית, virological." 17 (2) "כל דוגמאות בשימוש בכל רחבי הערכת DBS בדיקות נשלחו המכון של וירולוגיה בתהליך אבחון קליני שגרתי. לפיכך, אף אחת מהדוגמאות נאסף במיוחד לצורך המחקר, venipuncture נוספים לא בוצעה, אף אחד מהחומרים נבדקה עבור כל פרמטר מאלה הנדרש על-ידי הרופאים במהלך רגיל אבחון עבודה-up". 17 המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות" (דרוק ללמוד")18, בו DBS בדיקות סוף סוף שימש את הערים הגרמניות של ברלין, אסן להעריך אנשים אשר פעיל להזריק סמים, אושרה על ידי הנציב הפדראלי עבור נתונים הגנה וחופש המידע (ברלין, גרמניה), כמו גם על ידי ועדת האתיקה של צ'אריטה באוניברסיטה הרפואית, (ברלין, גרמניה).
1. אוסף של דם
<ol><li>Venipuncture14, 15, 20, 21<ol>
<li>ללבוש כפפות גומי לטקס חד פעמיות, ולנקות את האזור המיועד החדירה (רצוי את החציון cubital הווריד ב הפוסות antecubital) חומר חיטוי מתאים, למשל, אלכוהול איזופרופיל 70%.</li>
		<li>החל עורקים 4-6 ס מ מעל החדירה בשם כדי distend הורידים. להנחות את המחט לתוך הווריד החולה ולמלא, ברגע זה במקום, בעדינות את הצינור מחובר דם, המכילה EDTA בתור נוגדת קרישה.</li>
		<li>ברגע venipuncture תושלם, לשחרר את חוסם העורקים ולסגת את המחט. לאחר מכן, הקש כרית יבשה גאזה על החדירה, אשר לאחר מכן ניתן לקיים במקום על ידי תחבושת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניקוב עור (איור 1 א')13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>לשים על זוג כפפות גומי לטקס חד פעמיות.</li>
		<li>לפני ניקוב עור, המטופל צריך לחמם את הידיים שלו. האצבע הוא המטופל anterogradely enrich לדם לזרום לכיוון ניקוב באתר.</li>
		<li>לנקות את העור של הצד פאלמאר של פלנקס דיסטלי הקצה של האצבע השלישית או הרביעית של היד סטן עם חומר חיטוי מתאים, למשל, אלכוהול איזופרופיל 70%. לנקב את העור על ידי מנתחים בטיחות לשימוש יחיד. האצבע יוחזקו במצב כזה כי כוח המשיכה מקלה על האוסף של דם על קצה האצבע.</li>
		<li>השלמת אוסף של נימי דם על ידי ניקוב עור, להניח תחבושת על קצה האצבע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת כתמי דם
<ol><li>הכנה של הדם הנאסף על-ידי venipuncture15<ol>
<li>במקום (EDTA) שנאספו התקרש נגד דם ורידי לגמרי על הקלפים מסנן בהקדם האפשרי. לא להכין כתמי דם יבשים יותר מ- 24 שעות לאחר venipuncture.</li>
		<li>את כל המידע הדרוש לצורך הזיהוי של המטופל על הכרטיס מסנן. כרטיס אחד צריך הבחין רק עם הדם של אדם יחיד.</li>
		<li>. תלבש כפפות חד פעמיות גומי לייטקס</li>
		<li>היפוך בעדינות את הצינור אוסף דם 2 – 4 פעמים, לאחר מכן לפתוח את הפקק בזהירות.</li>
		<li>האחות µl 50 של דם ורידי שלם באמצעות פיפטה עם טיפ חד פעמיות. להעביר את הדם במרכז מעגל אחד בלי לגעת נייר הסינון ישירות עם קצה פיפטה. מנסה באופן מלא להרוות את המעגל.</li>
		<li>חזור על הליך זה כדי למלא את כל הנדרש עיגולים של הכרטיס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של הדם הנאסף על ידי העור לנקב (דמויות 1B ו- 1 C)13-16, 23<ol>
<li>תנגב את טיפת הדם עם כרית גזה הראשון כי זה עשוי להכיל רקמת עודף נוזלים. עיסוי את האצבע שוב כדי להגביר את זרימת הדם החדירה. העברת הטיפה הבאה לאחד החוגים של כרטיס מסנן מבלי לגעת במשטח ישירות עם קצה האצבע. לאפשר לדם להיות שנספג לתוך המרקם של המסנן על-ידי כוחות נימי בלבד.</li>
		<li>תן משלוח גדול הבאה של נימי דם טופס בקצה האצבע ולאסוף אותו במעגל הבא. המשך הליך זה עד כל החוגים הדרושים מלאים או מפסיקה זרימת הדם.</li>
		<li>אל תלחץ או "לחלוב" את האצבע יתר על המידה אם זרימת הדם אינה מספיקה כדי למלא את כל העיגולים הנדרש של הכרטיס מסנן. אם זרימת הדם נפסק להניח תחבושת על קצה האצבע. לבצע ניקוב העור השני על אצבע נוספת אם עוד דם יש צורך בבדיקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ייבוש של כתמי דם
<ol><li>כדי לייבש את כתמי דם, לשים את המסנן כרטיסים על נייר נקי המגבת בארון הבטיחות הביולוגי ולתת להם יבשה, רצוי O/N (אבל לפחות 4 שעות), ב- RT, בהעדר כל מקור חיצוני של חום. כאשר תהליך הייבוש, כתמי דם יש צבע חום כהה אחיד אין אזורים אדומים גלויים יותר (איור 1D)13, 15, 16.</li>
</ol>4. אחסון והובלה של כתמי דם מיובשים (DBS)
הערה: עיבוד של הדם יכול להיות מופרע לאחר הייבוש. הקלפים מסנן עכשיו יכול להיות מאוחסנת13-16, 23.
<ol><li>לאחסון, לשים את כרטיס נייר סינון בשקית רוכסן גז-אטום בודד, המכיל 1-2 שקיות סופג לחות כדי להגן על דגימות מפני לחות (איור 1E). לחלופין, הוסף כרטיס אינדיקטור לחות.</li>
	<li>להעביר את התיק הזה מקפיא עם טמפרטורת-20 ° C או נמוך ככל האפשר. אם מקפיאים אינם זמינים תחת תנאי המגרש, אחסון ב-4 ° C או אפילו בטמפרטורת החדר הוא ריאלי עד 14 ימים.</li>
	<li>תחבורה דגימות DBS קפוא בקרח יבש. עבור כרטיסי מסנן בתחילה לשמור בטמפרטורת החדר, השתמש מערכת אריזה משולשת, אשר מורכב של רוכסן bag(s) את container(s) הפנימית, וכן הפנימית של מעטפה החיצוני. ללא סימונים תוכן נדרש על המעטפה החיצונית למשלוח בדואר רגיל, אבל חייב להיות מוצמדת הסמל הבינלאומי הביולוגי המיכל הפנימי הראשי16.</li>
	<li>אל תכלול את הקלפים מסנן עיבוד נוסף אם את ערכות סופג לחות ו/או את הכרטיס אינדיקטור לחות נוספים משתנה צבע ורוד.</li>
</ol>5. • תנאי של דם יבש יבחין13, 15, 16, 23
<ol><li>אגרוף החוצה במקום אחד עם התקן לשימוש יחיד 6 מ מ מ כל מעגל צמאת דם של הכרטיס מסנן 903 כיתה (איור 1F). העברת כל אגרוף כתמי דם מיובשים מחולה בודד כדי באר אחת של צלחת 12-. טוב.</li>
	<li>למלא את הבאר עם תמיסת מלח באגירה פוספט המכילה 0.05% Tween 20 ו- 0.08% אזיד הנתרן (איור 1 ג'י). להתאים את עוצמת הקול של מאגר נוסף לדרישות המתאימות מינימלי של וזמינותו משמש לאחר מכן ניתוח של eluates נקודות דם יבש.</li>
	<li>חזור על שלבים אלה כדי לקבל סדרה שניה של eluates ספוט דם יבש על מנת לבצע ניתוח מולקולרית.</li>
	<li>לשים את הצלחת תרבות תא מטרף מעבדה ולתת את כתמי דם מיובשים מנוקב בעדינות elute לקבוצות של 4 שעה או, עדיף, O/N (איור 1 H).</li>
	<li>למחרת, המקומות הם כמעט ללא דם, supernatants היילוד יצרו (איור 1I). להעביר את eluates האלה microcentrifuge צינורות. לאחר מכן, מעמיד אותם בפני צנטריפוגה למשך 2 דקות ב g 10,500 x (איור 1J) כדי לשחרר את supernatants מפני כל פסולת שנפער במהלך • תנאי (איור 1 K).</li>
</ol>6. ניתוח של Eluates
<ol><li>Centrifuged eluates מוכנים כעת לשמש עבור הניתוחים המיועד. לחקור את eluates עבור סמנים של וירוס הפטיטיס B, הפטיטיס C וירוס הידבקות ב- HIV באמצעות ערכות זמינים מסחרית ובצע את ההוראות היצרנים המתאימים היטב (איור 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> איור 1. סיכום גרפי של הפרוטוקול המוצע תקשורת זו הכנה ועיבוד של כתמי דם מיובשים לשמש immunoassays ועל ידי טכניקות מולקולריות. דם כל ורידים, נימי דם מתקבל על-ידי venipuncture או ניקוב של העור על ידי מנתחים (א) עשויה לשמש דגימות לבדיקה ספוט דם יבש. לאחר העברת הדם החוגים של כרטיס מסנן 903 כיתה (B, C), הדגימות צריך להיות מיובש רצוי O/N בטמפרטורת הסביבה בבטיחות הביולוגי בארון כדי טופס כתמים של צבע חום אחיד ללא כל interspersion של אדום אזורים (D). בעת הייבוש של הדם מציע, אחסון הצורך, הקלפים מסנן יכול להיות ארוז בתוך שקיות רוכסן גז-אטום המכיל 1-2 שקיות סופג לחות (E). עיבוד מעבדה נוספות DBS מהווים את הדור של אגרופים על ידי מכשיר אחד 6 מ מ מן המרכז של העיגולים (F, G), • תנאי של העקיצות ב מאגר מבוסס-PBS לקבוצות של 4 שעה או, עדיף, O/N במטרף (H ), ההתאוששות של eluates (אני), ולבסוף צנטריפוגה גביעים מעבדה (J) כדי לשחרר את eluates DBS מפני כל פסולת שמקורה עלול במהלך התהליך • תנאי (K). לאחר מכן, eluates DBS מוכנים עבור ניתוחים, אשר נערכו על ידי פלטפורמה אוטומטית לחלוטין (L) על מנת לזהות סמנים סרולוגית של HBV, בזכות ו- HIV זיהומים, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

בעבר, RSR קיבל מענק כבוד להעברת הרצאות, תמיכה כספית עבור עבודתו המדעית של אבוט אבחון. NG ואום מצהירים שאין להם שום אינטרסים סותרים.

DBS שימשו במשך 100 שנים2 , אבל, למרבה ההפתעה, יש עדיין אין הסכמה כללית לגבי הכנה ועיבוד שלהם. עד כה, האחדה מספיקות של שלב טרום אנליטי חשוב זה רק הושגה בתחום של היילוד ההקרנה14, ואילו במגוון של פרוטוקולים שונים קיימת עבור כל היישומים האחרים של DBS בדיקה5, 16, 23. כדי להתגבר על הטרוגניות המדהימה הזו, הוא הוראה צעד אחר צעד מקיפים להכנה של עיבוד DBS כדי להיות מנוצל immunoassays ועל ידי טכניקות מולקולריות שהוצגו בתקשורת זו, ביחס יעילותו זיהוי סמנים של HBV, בזכות דלקות HIV. מוקד הדיון הבא מושם בעיקר על השלבים השונים של הפרוטוקול המוצע.
בהיסטוריה של DBS בדיקות רבות נייר סינון שונות כרטיסי היו בשימוש2 אבל רק היום שני מקורות מסחריים אושרו על ידי ה-FDA כמו class II ומכשור רפואי עבור הדם אוסף5, 16. מערכות אלו כרטיס מסנן מאוד אחידה, יש מאפיינים דומים מאוד הקליטה כך התוצאות האנליטיות המתקבל נימי דם שהוכנו על אף אחד מהם לא שונות על ידי יותר מ- 4% – 5%28. באופן לא מפתיע, Masciotra ועמיתים29 ולכן זוהה RNA HIV-1 מידה עם assay איכותי לאחר • תנאי מן הדם אוסף קלפים ממקורות שונים. לאור נתונים אלה, זה יכול להיות כמעט לא נכלל כי כל אחד הסתירות הקיימות בעת בדיקות בשילוב סרום/DBS זוגות של סמני של HBV, בזכות, HIV זיהומים17 נגרם על ידי הבחירה של הכרטיס מסנן לבד. עם זאת, כאשר כימות מדויק של analyte הכרחי, וריאציית המקור-כדי-מקור עשויים להיות לא זניח וניקב טכניקות מתוחכמות יותר, למשל, DBS (PDBS) כשיטה microsampling30 או הכנה המקומות סרום מיובשים (DSS)31 ייתכן שתחול במקום DBS הקונבנציונלית בדיקות10.
מאז רק כמויות קטנות של דם משמשים DBS בדיקות (טיפה אחת של דם קפילרי מורכב µl כ-50)5, 16, וריאציות באמצעי האחסון מדגם מכריעים ובבית, אמנם, לפחות לחלק בין תוצאות סרולוגית של המשתתף דיווח עצמי HBV ומצב בזכות שנרשם במהלך הטיס "המחקר דרוק" הם לייחס משתנה זה. הגורם החשוב ביותר יחיד עבור מזעור "תנודות" של אמצעי האחסון מדגם הוא ללא ספק טכניקה נכונה של אוסף נימי דם, אשר יכולה להיות מושגת רק על ידי הכשרה זהיר ומתמשכת של הסגל הטכני22. יתרה מזאת, כאמצעי של בקרת איכות, כל המעבדות עובד עם DBS צריך כבר יזמו הנהלים לזיהוי, לאחר מכן למעט דגימות DBS צריך להיחשב חוקיים משביע רצון או16.
מחקרים שנערכו בעיקר בהקשר של HIV32 ו ההקרנה היילוד33 הראו כי לחות גבוהה עלולה להוביל הפירוק של analytes, אבל עד כה אין הסכמה הושגה לגבי שאלת כמה זמן DBS צריך להיות אוויר יבש . מרווח זמן לפחות 4 שעה או רצוי O/N מוצע זה תקשורת, שאימצו לכן את התנאים שבהם נהגו ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית32, 34 נתונים על אחסון של DBS, לאחר מכן ניתן להשתמש עבור HBV ו בזכות בדיקות מתנגשים. בשנת 1981, וילה ועמיתים35, מי שנרשם עכשוויים בשיטות אנליטיות, דיווחו כי אחסון ב- RT לא השפיע על התוצאות של HBV ניתוחים במהלך כל תצפית של 180 ימים אם היו נוגדנים titers > 1/1000, אבל זה DBS הפכה גבולי-חיובית או שלילית אפילו לאחר 15 ימים כאשר titers בנסיוב היו רק 1/100. אחסון-20 ° C או 4 ° C לא לגרום לשיפור משמעותי. לעומת זאת, במחקר שנערך שלושים שנה מאוחר יותר36 נבדק ושכפול של מדגם HBV חיובי, ומצא המחברים את anti-HBc כמו גם נוגדנים anti-HBs היו יציבים עד 183 ימים ב- RT, ואילו HBsAg מתחת לאותם התנאים הפך false-שלילי כבר אחרי 63 ימים. לגבי זיהוי HBV DNA מ- DBS eluates, ריכוז חומצות גרעין נגיפיות הייתה יציבה לפחות שבעה ימים ב- 37 ° C37 או הוכיח להיות "עמיד" אחסון ב- RT עד שלושה שבועות38. בדיקת נוגדנים בזכות באמצעות שני דור שלישי זמינים מסחרית immunoassays39 סיפק תוצאות מדויקות עבור תקופה של 117 ימים באמצעות דגימות DBS המאוחסנים ב-20 ° C, 2-8 ° C ו- 20 – 25 ° C, בהתאמה. אחסון ב-20 ° C, עם זאת, הביא הווריאציה הנמוך של צפיפות אופטית. החלת אנטי-בזכות של הדור הרביעי, אליסה, קרי, Monolisa בזכות-Ag-Ab-ULTRA, בהקשר של DBS בדיקות, Larrat. et al. 40 נצפתה ירידה חדה בירידה לפרטים אנליטי לאחר אחסון דגימות DBS במשך יותר משלושה ימים-RT. מצד שני, התקבלו תוצאות בדיקה מדויקת עם ערכת אותו ניצול דגימות שהופקדו למשך 60 ימים בתנאים שונים (-20 ° C, 2-8 ° C ו- 22 – 26 ° C) על ידי Brandao ועמיתים41. תצפיות על הירידה של RNA בזכות ריכוזים ב DBS בתנאים אחסון שונים בטווח של אין שינוי משמעותי ב RT עבור שנה אחת עד42 עד שינוי tenfold לאחר ארבעה שבועות-טמפרטורת הסביבה43. לוקחים את הנתונים הסותרים מעדיף על היציבות של HBV ו אנטיגנים בזכות, חומצות גרעין, נוגדנים בחשבון, נראה סביר לסגת בפרוטוקול המוצע להחלטה, אשר הוגדרה קודם לכן עבור האחסון של דגימות DBS שישמש עבור HIV בדיקות15, 30: עבור התצהיר לטווח קצר (עד שבועיים) אנטיגנים, חומצת גרעין נגיפיות, נוגדנים הם נחשבים יציבה-RT, ואילו האופטימלי אחסון לתקופות ארוכות על התנאים קפוא.
ככלל, שלושה פרמטרים שיש לשקול בעת תכנון פרוטוקול • תנאי: (1) המאגר • תנאי; (2) משך זמן וטמפרטורה של • תנאי; (3) • תנאי האחסון23. ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) שימש eluting DBS, והוסיף הסופרים חלבון, למשל, אלבומין שור (BSA) או Tween 20, חומרים פעילי, שטח-על מנת לשפר את האות assay על-ידי ייצוב חלבונים, כמו שהם הולכים לתוך פתרון, מחייב שאינם ספציפיים בו זמנית חסימת אתרים23. רק כמה דוחות, אשר ישירות להשוות מאגרים שונים • תנאי בהקשר של בדיקות DBS, הינם זמינים. Villar. et al. 36, למשל, נרשם כמעט שוות ערך • תנאי קיבולות למאגרי כל שימוש, אלא PBS/BSA 0.5%, גרמו ברמה הנמוכה ביותר של תגובתיות שאינם ספציפיים. אבחנה דומה מאוד נעשתה על ידי כרום ועמיתים44 בשעת החלת את diluent הדגימה של rLAV גנטיקה מערכות EIA עבור • תנאי של נוגדנים בזכות מ- DBS. מאז הסיכון של מדגם השפלה היא מאוד נמוכה בשעות הראשונות לאחר הכנת DBS (ראה לעיל), הוחלט דגירה המקומות O/N בטמפרטורת החדר, כדי לתמוך בתהליך • תנאי על ידי ערבוב מעל קצה-עדין. גישה זו יש יתרון כי דגימות אגרוף הקודם יום ישירות יועברו שגרתית אבחון מוקדם הבא בבוקר23. צריך להיות מותאם היקף המאגר • תנאי הדרישות המתאימות מינימלי של מבחני המשמש ניתוחים הבאים על מנת לשמור את הגורם לדילול נמוך ככל האפשר. עם זאת, אופטימיזציה זהירה של התנאים • תנאי עבור כל analyte יחיד איננה אפשרית בהערכה הקודמת כי תפוקה גבוהה לדוגמה היה צריך להיות מובטחות תוך זמן קצר יחסית במהלך ה "דרוק לימוד"17. כתוצאה מכך, נפח שלילי למדי של 1,000 µl של מאגר מבוסס-PBS שימש כדי להשלים את התהליך כולו • תנאי עבור כל הפרמטרים של שתי פעולות נפרדות.
גישה זו אחד מצד אחד נכשל "לחלוטין במערכת anti-HBc/anti-HBs עבור אותם אנשים נגועים בנגיף ה-HIV עקב ריכוז נוגדן נמוכה; . זה נדרש הליכים ביולוגית מולקולרית עם רגישות אנליטי אופטימלי ביחס HBV DNA ו RNA בזכות בדיקות. " 17 מצד שני, אמצעי האחסון גבוה • תנאי הוכיחה להיות בשום אופן חסרון מצפני HBsAg בזכות, נגד HIV על ידי ערכות בשימוש בכל רחבי ההערכה. "זיהוי HBsAg חומרים חיוביים של דם מלא eluates הצליח עם רגישות של 98.6% במידה גבוהה באופן דומה כמו מחקרים קודמים, אשר השתמשה באופן חלקי נפח • תנאי קטן בהרבה של 100 µl, 250 µl, או 600 µl או 500 µl"17 ,36, 45, 46. הרגישות של 97.8% נקבע בחקירת זוגות סרום/DBS 179 עבור בזכות נוגדנים תאמו התוצאות שכבר קיימים דוחות24, 44, 47, 48, 49, אשר עבד עם אמצעי אחסון • תנאי זה היה נמוך פי 5 עד 10. "בנוסף, הפרוטוקולים לגילוי בזכות היה כבר כראוי ממוטב. מאת הקובעת נקודות ניתוק משלהם"17, 24, 48, 49 "או על-ידי הגברת אמצעי האחסון מדגם של 20 µl כדי 100 µl" בן 17, 49 . סוף סוף, ירידה לפרטים אנליטי רגישות (100% כל אחת) הוקמה לגילוי HIV אנטי היו שווה או גבוהה ממנו מאפייני ביצועים של אחרים immunoassays המותאמים במיוחד DBS בדיקות50, 51 "או של stepwise נוהל עם השימוש בשילוב של מספר בדיקות האיידס"17,52. "הם, אכן, גם חריגה תיעוד ביצועים assay זה היה מיוחד פותחה, ממוטב עבור זיהוי נוגדנים נגד HIV ב DBS eluates (Q-למנוע HIV 1 + 2 מקיט DBS)." 17, 53  
יחדיו, את הפרוטוקול צעד אחר צעד מקיף שהוצגו בתקשורת זו התבררה כלי ידידותי למשתמש ריאלי הכנה ועיבוד DBS ואת, לכן, ניתן להשתמש בצורה אמינה וירולוגיה אבחון. זה מאפשר גישות באמצעות אוטומציה 54 , בשל מאפייניו ביצועים מצוינים יש פוטנציאל לשמש סוג של אבן-היסוד עבור פרוטוקול בעתיד הסכמה כללית מקובלת בתחום הגלובלי DBS בדיקות מעבדה הרפואה.

הרעיון של שימוש בדם הנאסף על כרטיס נייר המיוצר מצלולוזה המיוחס איוור הנוצרית באנג (1869 – 1918), אביו של microanalysis קליניים מודרניים1, 2. בשנת 1913, באנג נקבע גלוקוז מן eluates של דם יבש כתמים (DBS)3 , ולאחר מכן גם לבצע מדידות חנקן בשיטת סטריליזציה עם טכניקה זו נייר סינון2. כתוצאה מכך, מספר חוקרים דיווחו על שימוש DBS בדיקה סרולוגית לאבחון עגבת2. כפי מוקדם כמו 1924, צ'פמן לסכם את היתרונות של בדיקות DBS כאשר הוא במיוחד הדגיש ארבעה פריטים, אשר עדיין תקפות היום: (1) venipuncture בהשוואה לקונבנציונלי, פחות נפח הדם נדרש, עובדה זו היה חשוב ביותר ברפואת ילדים אבחון; (2) איסוף דם הוא פשוט, שאינו פולשני, וזולה; (3) את הסיכון של זיהום חיידקי או המוליזה הוא מינימלי; DBS (4) יכול להישמר במשך תקופות ארוכות עם כמעט ללא התדרדרות של analytes2, 4. מלבד השימוש בו בדיקות לסיפיליס, יישומים מוקדם נוסף של הטכניקה DBS כלול, למשל, זיהוי נוגדנים נגד חצבת, חזרת, poliovirus, parainfluenza וירוס, וירוס נשימתי syncytial (RSV) 19532, זיהוי שיגלה בצואה יבש על גבי נייר סינון ונשלח בדואר רגיל מאינדונזיה ליידן בהולנד, כמו גם את הזיהוי של נוגדנים עלקת הבילהרציה ב DBS שצולמו באזורים אנדמיים וניתח יותר משלושה חודשים מאוחר יותר5 . בשנת 1963, כחמישים שנה לאחר באנג של המקורי תקשורת2, 6, גאת'רי סוף סוף לאור השיטה המפורסמת שלו לאבחון של פנילקטונוריה מ- DBS מתקבל על ידי שמוק העקב ילודים7, 8.
אמנם מאותו זמן ואילך, DBS נחשבו כמו שיטה ישימה כלל איסוף, אחסון, שינוע, וניתוח מגוון של נוזלי הגוף האנושי5, השימוש בתוכנית האבחון עדיין נותרה התמקדו בעיקר האבחנה של דלקות במיוחד הגדרות משאב מוגבל של ההקרנה שיטתית של ילודים עבור הפרעות מטבוליות תורשתיות במשך עשרות שנים9, 10. מאז 2005, עם זאת, מגוון יישומים DBS חדשים וחדשניים החלו להסתמן. כתוצאה מכך גידול מעריכי כמעט מספר בהתאמה פרסומים מדעיים-DBS מ כ-50 450-כמעט מדי שנה בזמן הנוכחי. בין היישומים המתעוררים הם בתחומים מגוונים כגון: toxico - ו לימודי פרמוקוקינטיים, פרופיל מטבולי, סמים טיפולית ניטור, טוקסיקולוגיה משפטית או זיהום סביבתי שליטה10, 11.
DBS בדיקות, ובכך, הפך מצעד הניצחון דרך לאבחון קליני מעבדתי במהלך 100 שנים2. כמו כימיה קלינית, רפואית12, עם זאת, במהלך חודש מרץ הזה משתנים מראש אנליטית לא שלמאחה נחשבו במשך שנים רבות. אכן, אפילו היום, לאחר פעילויות כגון הנודע של ה-CDC נייר סינון הערכת פרויקט13 או ניסוח ברמה הלאומית לאיסוף דם על נייר סינון במסגרת של היילוד הקרנת14, שלב טרום אנליטית הוא עדיין במידה רבה שאינטליגנציה רוב השדות האחרים, בהם בדיקות DBS הוא יישומית5, 10.
לאור רקע זה, פרוטוקולים מקיפה שלב אחר שלב14-16 עבור שימוש ב- immunoassays וב -טכניקות מולקולריות, אשר מכסה את כל השלבים החיוניים, הוא הציע הכנה ועיבוד DBS בתקשורת הבאות: (1) אוסף של דם; (2) הכנת כתמי דם; (3) ייבוש של כתמי דם; (4) אחסון והובלה (5) • תנאי של DBS; סוף סוף (6) ניתוחים של DBS eluates. היעילות של הפרוטוקול הוערך קודם עם זוגות 1,762 בשילוב סרום/DBS לזיהוי צהבת B וירוס (HBV) האנטיגנים (HBsAg), נוגדנים ל- HBV core אנטיגן (anti-HBc) נוגדנים אנטיגן פני השטח HBV (anti-HBs), HBV DNA, נוגדנים לנגיף הפטיטיס C (בזכות) (בזכות), בזכות RNA, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 1-p24-אנטיגן/אנטי-HIV 1/2 באמצעות פלטפורמה אוטומטית לחלוטין או חומצת גרעין איכותי רגיש בדיקות. 17. בשלב השני, הפרוטוקול היה מנוצל מחקר פיילוט "סמים, כרונית המחלות הזיהומיות" ("מחקר דרוק") אשר נערך על ידי רוברט קוך-המכון בשיתוף פעולה הדוק עם המרכז הארצי בהפניה הפטיטיס c על פעיל משתמשי סמים בערים גרמניות של ברלין, אסן18.

<table><tbody><tr><td>כפפות גומי לטקס</td><td>הרטמן</td><td>#4049500041515</td><td></td></tr><tr><td>70% אלכוהול איזופרופיל</td><td>Bode Chemie</td><td>#9768050</td><td></td></tr><tr><td>צינורית בטיחות Mulifly</td><td>Sarstedt</td><td>#85.1638</td><td></td></tr><tr><td>צינור איסוף דם EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>#02.1066.001</td><td></td></tr><tr><td>תחבושת דבק</td><td>הרטמן</td><td>#2994163</td><td></td></tr><tr><td>כרית גזה יבשה</td><td>הרטמן</td><td>#143213</td><td></td></tr><tr><td>לנצט בטיחות לשימוש בסינגל</td><td>אוון ממפורד</td><td>#3802421</td><td></td></tr><tr><td>כרטיס נייר סינון</td><td>Whatman/sigmaaldrich</td><td>#10534612</td><td>כרטיס נייר סינון כיתה 903</td></tr><tr><td>קצות פיפטה חד פעמיות</td><td>Starlab</td><td>#S1126-7810, #S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>שקית רוכסן</td><td>Flexico</td><td>#20219</td><td></td></tr><tr><td>שקית ייבוש מיני</td><td>Tropack</td><td>#-</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף חד פעמי</td><td>pfmmedical</td><td>#48601</td><td>6.0 מ"מ ביופסיה חד פעמית אגרוף</td></tr><tr><td>מלקחיים חד פעמיים</td><td>סרוופרקס</td><td>#H7301</td><td></td></tr><tr><td>12 באר צלחת תרבית תאים</td><td>גריינר</td> <td>#665180</td><td></td></tr><tr><td>PBS מאגר</td><td>Gibco</td><td>#14190-136</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>Applichem</td><td>#A1389.0500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Merck</td><td>#66880250</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילת כספה, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>#30120086</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT HBsAg (כמותי)</td><td>Abbott</td><td>#6C3642</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT נגד HBc II</td><td>Abbott</td><td>#8L4425</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT נגד HBs</td><td>Abbott</td><td>#7C1825</td> ARCHITECT נגד HCV Abbott#6C3725 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארכיטקט HIV Ag / AB משולב</td><td>אבוט</td><td>#4J2727</td><td></td></tr><tr><td>MagNA טהור 96 DNA וויראלי NA ערכת נפח גדול</td><td>Roche</td><td>#6374891001</td><td></td></tr><tr><td>ארטוס HBV LC PCR KIT</td><td>Qiagen</td> <td>#4506063 (24 בדיקות), #4506065 (96 בדיקות)</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td><td>Siemens Healthcare</td><td>#2554311</td><td></td></tr></tbody></table>

כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- immunoassays וב -טכניקות מולקולריות

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

הרעיון של איסוף דם על כרטיס נייר ולאחר מכן באמצעות נקודות דם יבש (DBS) למטרות אבחון מקורו לפני מאה שנה. מאז, DBS בדיקות במשך עשרות שנים התאפיין בעיקר ממוקדת על האבחון של מחלות זיהומיות במיוחד בהגדרות משאב מוגבל או שיטתית ההקרנה של ילודים עבור הפרעות מטבוליות תורשתיות ורק לאחרונה יש מגוון רחב של חדשים וחדשניים DBS יישומים החלה להסתמן. במשך שנים רבות, משתנים מראש אנליטי נחשבו רק באופן בלתי הולם בתחום של בדיקות DBS, אפילו היום, למעט היילוד הקרנה, שלב טרום אנליטי כולו, אשר כוללת ההכנה ועיבוד של DBS עבור שלהם ניתוח סופי אינה אחידה. לאור רקע זה, פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, אשר מכסה al השלבים החיוניים, הוא הציע, קרי, אוסף של דם; הכנת כתמי דם; ייבוש של כתמי דם; אחסון והובלה של DBS; • תנאי של DBS, ולבסוף ניתוח של DBS eluates. היעילות של פרוטוקול זה הוערך קודם עם זוגות 1,762 בשילוב סרום/DBS לזיהוי סמנים של וירוס הפטיטיס B, הפטיטיס C וירוס זיהומים וירוס הכשל החיסוני האנושי על פלטפורמת אנליטי אוטומטית. בשלב השני, הפרוטוקול היה מנוצל במהלך מחקר פיילוט, אשר נערך על המשתמשים פעילים בערים הגרמנית ברלין, אסן.

היעילות של הפרוטוקול הציע הכנה, עיבוד של DBS הוערך לראשונה על-ידי ניתוח 1,762 בשילוב סרום/DBS זוגות עבור סמני דלקת HBV, בזכות ו- HIV. 17. למטרה זו, DBS הוכנו מ 100 µl דם מהוורידים לגמרי (cf. נקודות 2.1.1 – 2.1.6 בפרוטוקול הקודם), היו eluted עם 1,000 µl של PBS מבוססי מאגר, כל אחד, (cf. נקודות 5.1 – 5.5 לפרוטוקול הנ ל) כדי להשלים את התהליך עבור כל הפרמטרים שבע שתי פעולות נפרדות. גישה כזו בלי אופטימיזציה זהירה של התנאים • תנאי עבור כל analyte יחיד נראה בלתי נמנע כי תפוקה גבוהה למדי מדגם היה צפוי תוך זמן קצר יחסית במהלך המחקר השדה הקרובה "סמים, כרונית מחלות זיהומיות"("מחקר דרוק").
כל המדידות דבקה המלצות היצרן במהלך ניתוח DBS, אבל היה צריך להיות שונה ביחס האישושים HBsAg ו- anti-HBs לפצות גם את ההשפעה של המוליזה או התוצאה של דילול. עם ערך ניתוק של 0.05 IU/ml, HBsAg בדיקה של eluates DBS להוביל בשיעור של false-תוצאות חיוביות של 14.7% (52 מתוך 354) בהשוואה ל הסרום דגימות (איור 2 א). מקלט ההפעלה אופיינית (ROC) ניתוח25, 26 של הנתונים ציינו כי גידול של הסף כדי 0.15 IU/ml כתוצאה פרידה אידיאלי של תוצאות חיוביות-HBsAg HBsAg שלילי (פרטית 0.986 [רגישות], 0.000 [1-ירידה לפרטים], איור 2B). מצד שני, עם ניתוק של 10 IU/l על כימות של anti-HBs נוגדנים שיעור של מדידות שווא-שלילי של 14.2% (47 מתוך 331) היה מוקלט (איור 2C). לפיכך, בעקבות ניתוח ROC שוב, זה ניתוק הונמך אל 1.5 IU/l כדי להשיג על אפליה אופטימלית של ערכים (0.917 [רגישות], 0.007 [1-ירידה לפרטים], איור דו-ממדי).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> איור 2- HBsAg ו anti-HBs בדיקות eluates DBS (שונה מ-17). העלייה מונחה ROC של הערך ניתוק על כימות HBsAg מ 0.05 IU/ml (א) כדי 0.15 IU/ml (ב) מופחת הקצב של תוצאות חיוביות שגויות של 14.7% ל- 0%. באופן דומה, ROC ניתוח של anti-HBs ריכוזים הציע ירידה של סף בהתאמה מ 10 IU/l (C) ל 1.5 IU/l (D), ובכך לחלוטין סילוק חסימות יתר, אשר היוו בתחילה 14.2% האישושים כל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
התוצאות של הבדיקות בשילוב סרום/DBS מסוכמים בטבלה 117. אין ללא ירידה לפרטים הוקלט במהלך DBS בדיקה עבור כל אחד analytes 7.
כאשר DBS eluates נחקרו לנוכחות של HBsAg, א א הפרמטר מפתח סרולוגית לזיהום אקוטי וכרוני עם HBV, רגישות אנליטית של 98.6% נקבע. HBsAg ריכוזים ב sera שקרית-שלילי שני היו 749 IU/ml ו 6 IU/ml, בהתאמה. נוגדנים anti-HBc אותרו בהצלחה 176 מתוך 204 (א e 86.3%) DBS eluates. . עשרים ושתיים מתוך 28 דגימות אשר לא אותרו על ידי המדידות שמקורם יחידים שיתוף נגועים בנגיף ה-HIV לפיכך, אם אנשים HIV חיובי לא נכללו בחישוב, רגישות של 97.1% הושג לאחזור נוגדנים anti-HBc מדם ורידי לגמרי יבש eluted. דומות תצפיות שנערך לגבי הקביעה של נוגדנים anti-HBs. אפילו לאחר השינוי של הערך ניתוק של וזמינותו כדי 1.5 IU/l, 9 תוצאות DBS סרום discrepant אירעה. החולים לא שותף נגוע ב- HIV, נמצאו ריכוזים anti-HBs סרום של 11-26 IU/l אשר היו נמוך מדי כדי לאפשר זיהוי לאחר • תנאי של הדם היבש.
בזכות נוגדנים מעידים על או זיהום אקוטי או כרוני או נפתרה. רק ארבע תוצאות בזכות התחזות-שלילי (א א 2.2%) נקבעו מ- DBS eluates והפגינו עוד ניתוחים סרולוגית ומולקולרית בבירור sera המתאימים מאוד בטח צולמו מחולים, זיהומים אשר היה מזמן נפתר.
זיהוי נוגדנים נגד HIV ב DBS eluates עם מערכת אוטומטית לחלוטין היה תהליך חלקים לחלוטין אשר הניב של רגישות אנליטית של 100%.
"רשע HBV DNA ריכוז של דם מלא eluates בוצעה 100 דגימות (כלומר DNA ריכוז: 1,573,898 IU/ml, טווח: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) ונכנעתי ערך של 93.0%. לפיכך, שבע דגימות עם סרום נמוך ריכוזים HBV DNA בין 409 3,643 IU/ml לא זוהו ע DBS בדיקות. של sera 100 אשר הוכיחה להיות בזכות RNA חיוביות (כלומר RNA בזכות ריכוז: 1,415,944 IU/ml, טווח: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml), המקביל aliquots דם היו זמינות. החקירה השוואתי כתוצאה רגישות אנליטית של 100% עבור בזכות RNA האישושים מ- DBS eluates." 17
כדי לבדוק פרוטוקול מחולקת לרמות עבור הכנת ועיבוד DBS בתנאי שדה, היא שימשה בשיתוף פעולה הדוק עם רוברט קוך-המכון (ברלין, גרמניה) במהלך שלב פיילוט של המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות", אשר היה ניצח על המשתמשים פעילים בערים גרמניות של ברלין, אסן18. כל 534 המשתתפים נרשם (433 גברים ונשים 101) עברה נימי דם הדגימה כמתואר בפירוט בסעיפים 2.2.1 – 2.2.3 של פרוטוקול הקודמים, ו DBS היו, eluted שוב, על ידי תוספת של 1,000 µl של מאגר מבוסס-PBS.
שני אנשים אובחנו באופן כרוני נגוע HBV, 39 הראה את התבנית סרולוגית לזיהום HBV נפתרה. יתר על כן, משתתפים 15 היו חיוביים עבור anti-HBs (מעמד לאחר החיסון), שמונה נמצאו חיוביים עבור anti-HBc לבד. בזכות השכיחות בין המשתתפים היה 57.3% (N = 193) בברלין וב 73.0% (N = 144) ב Essen. מ. יבויחה הנוגדן דגימות 65% (N = 125), 62% (N = 89) היו גם viremic. עשרים וחמש אנשים 534 חיובית ל- HIV אנטי. 19 של דלקות כבר היו ידועות, 24 אנשים אלה היו שיתוף נגועים בזכות.
התוצאות המתקבלות על-ידי בדיקת DBS הושוו בזהירות עם נתונים anamnestic של המשתתפים במחקר לגבי המצב HBV ו בזכות דיווח עצמי. השוואה זו בשילוב עם תוצאות בדיקות בשילוב סרום/DBS זוגות הוביל שינויים מזעריים של אלגוריתם הבדיקה עבור השלב העיקרי של "דרוק המחקר", אשר יכולים? להכליל את משתמשי סמים פעילים שש ערים גרמניות גדולות נוספות: "יחידים נגוע ב- HIV ייבדק תמיד נוכחות של HBV DNA. המשתתפים אשר eluates DBS הן חיוביות anti-HBc או anti-HBs צריך יהיה נתון venipuncture בפגישת ייעוץ השני להבהרת בהחלט מצב anti-HBc/anti-HBs שלהם, בסופו של דבר, כל eluates DBS יוקרן עבור בזכות RNA משנה התוצאות של בדיקות בזכות". 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>פרמטרים</td>
			<td>סרה בשילוב/DBS eluates (N)</td>
			<td>תוצאות discrepant (N)</td>
			<td>סיבת אי-ההתאמות בין בדיקת סרום ו DBS eluates</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>שני חולים עם דלקת כרונית של HBV. שניהם היו תחת טיפול אנטי-ויראלי, אחד מהם היה שיתוף נגועים ב- HIV. ריכוזי HBsAg בסרום: 749 IU/ml ו- 6 IU/ml, בהתאמה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>בנסיוב, עשרים ושתיים חולים היה זיהום HBV נפתרה. שישה הוכיחו את מציאת סרולוגית "anti-HBc לבד". עשרים ושתיים של המטופלים היו שיתוף נגועים ב- HIV. מ- "מפענחים HBV," עשרים היו העריך כמו "anti-HBs חיובי לבד' על-ידי בדיקת DBS ו, לכן, באופן כוזב סווגו"מצב לאחר החיסון".</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBs.</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>ארבעת המטופלים לא שותף נגוע ב- HIV היה סרום anti-HBs ריכוזי אלקטרוני 11 26 IU/l, אשר היו נמוך מדי כדי לאפשר זיהוי נוגדנים לאחר • תנאי נקודות דם יבש.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>שרה בהתאמה היה הושגו מן שבעה חולים עם ריכוזים HBV DNA בסרום נמוכה ועד 409 IU/ml 3,643 IU/ml.</td>
		</tr>
<tr>
<td>בזכות</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>בזכות</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>אלה ארבעה סרה שנלקח חולים, עם זמן מאז נפתרה בזכות זיהומים.</td>
		</tr>
<tr>
<td>בזכות ה-RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/HIV נגד 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: התוצאות המתקבלות מ- DBS 1,762, אשר היו מוכנים ומעובדים מפני הבאות דם ורידי כל הפרוטוקול המוצע תקשורת זו, לעומת הממצאים בדגימות בשילוב סרום כנקודת התייחסות.

הכנת ועיבוד של כתמי דם מיובשים (DBS) לניתוח הסופי שלהם מתוקננים עדיין גרוע עבור מרבית היישומים אבחון. כדי להתגבר על זה חסרון, פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף הציע, לאחר מכן הערכה לגבי יעילותו לזיהוי סמנים של זיהומים וירליים.

כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק פרוטוקול סטנדרטי להכנה ועיבוד של נקודות דם מיובשות לשימוש עתידי במבדקים אימונולוגיים ובטכניקות מולקולריות. פעולה זו מתבצעת תחילה על ידי לקיחת דם קפילרי והעברתו לכרטיס מסנן. השלב השני כולל ייבוש של נקודות הדם במהלך הלילה והוצאת דגימות (punches) בקוטר ששה מילימטרים מתוך עיגולי כרטיס המסנן.בשלב הבא, השגת ה-ian של דם מיובש מהניקובים מתבצעת על ידי טבילה בבופר במכשיר ניעור למשך ארבע שעות לפחות. לאחר מכן, ה-EITs ההמוליטיים משוחררים משאריות באמצעות סנטריפוגציה. השלב הסופי הוא ניתוח ה-EITs המזוקקים לאיתור סממנים סרולוגיים ומולקולריים של זיהומים בנגיפי Hepatitis B, hepatitis C ונגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) באמצעות בדיקות אימונו-סבס (immunoassays) וטכניקות מולקולריות זמינות מסחרית.הרעיון של שימוש בכתמי דם שנאספו על כרטיס מסנן העשוי מצלולוז נוצר לפני מאה שנים. למרות זאת, אנשים המשתמשים בשיטה זו בפעם הראשונה יתקשו לעיתים קרובות גם כיום, מכיוון שהשלב הפרה-אנליטי כולו, הכולל את ההכנה והעיבוד של כתמי דם מיובשים לצורך הניתוח הסופי שלהם, לא עבר סטנדרטיזציה עבור כמעט כל היישומים של בדיקות כתמי דם מיובשים. על רקע זה, אנו מציעים פרוטוקול סטנדרטי מקיף ומפורט, שלב אחר שלב, להכנה ולעיבוד של כתמי דם מיובשים לשימוש עתידי בבדיקות אימונולוגיות ובטכניקות מולקולריות.הדגמה חזותית של מתודולוגיה זו נראית חיונית, שכן מספר שלבים, כגון לקיחת דם קפילרי, העברתו לכרטיסי מסננת או הכנת דגימות (punches) מתאימות מהכרטיסים, אינם קלים ללמידה; כתוצאה מכך, אנשים המשתמשים בטכניקה זו בפעם הראשונה יפיקו ללא ספק תועלת מייצוג חזותי.טכנאי מהמעבדה שלנו יגבה דם קפילרי מאצבעו של ניקו, תוך הדגמת הליך העיבוד. כתמי הדם שהתקבלו יעובדו על ידי הטכנאי ko, העובד כבר שנים רבות במעבדתנו לאבחון ביולוגיה מולקולרית. לצורך פנצירה של העור, ראשית יש להلبיש זוג כפפות גומי לטקס חד-פעמיות.לפני דקירת העור, על המטופל לחמם את ידיו. יש לעסות את האצבע באופן נמרץ כדי להעשיר את זרימת הדם לעבר אתר הדקירה העליון. לאחר מכן, נקה את העור בצד הכפי (Palmer side) של קצה הפלנגה הדיסטלית של האצבע השלישית או הרביעית ביד שאינה משמשת לכתיבה באמצעות חומר חיטוי מתאים, ודקור את העור באמצעות לנסט בטיחות לשימוש חד-פעמי.יש להחזיק את האצבעות במנח שבו כוח המשיכה מסייע לאיסוף הדם על קצה האצבע. יש לנגב את טיפת הדם הראשונה בעזרת פד גזה, מכיוון שייתכנו בה נוזלי רקמה עודפים. לאחר עיסוי חוזר של האצבע להגברת זרימת הדם באתר הדקירה, יש להעביר את הטיפה הבאה לאחד מהעיגולים שעל כרטיס סינון, מבלי לגעת עם קצה האצבע ישירות במשטח.הנח לטיפת דם קפילרית גדולה הבאה להיווצר על קצה האצבע ואסוף אותה לתוך העיגול הבא. המשך בפעולה זו עד שכל העיגולים הדרושים יתמלאו או עד להפסקת זרימת הדם במהלך האיסוף. אפשר לדם להיספג במרקם המסנן באמצעות כוחות קפילריים בלבד.אין לסחוט או למעוך את האצבע באופן מוגזם אם זרימת הדם אינה מספיקה כדי למלא את כל העיגולים הנדרשים בכרטיס הסינון. אם זרימת הדם פסקה, יש להניח תחבושת על קצה האצבע ולבצע דקירה שנייה באצבע אחרת אם נדרש דם נוסף לבדיקה. כדי לייבש את נקודות הדם, הניחו את כרטיסי הסינון על נייר סופג נקי בתוך מCבטחה ביולוגית (biohazard safety cabinet) והניחו להם להתייבש, רצוי למשך הלילה בטמפרטורת החדר. בהיעדר מקור חימום חיצוני, כאשר תהליך הייבוש הושלם, נקודות הדם יהיו בעלות צבע חום כהה אחיד ולא ייראו עוד אזורים אדומים, וניתן יהיה להעבירן לאחסון.הניחו את כרטיס נייר המסנן בשקית זיפר אחת בלתי חדירה לגז, המכילה שקיק סופח לחות אחד או שניים, כדי להגן על הדגימות מלחות. העבירו שקית זו למקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או פחות מהרב ככל האפשר. אם אין מקפיאים זמינים בתנאי השטח, אחסון בטמפרטורה של 4- מעלות צלזיוס או אפילו בטמפרטורת הסביבה הוא אפשרי למשך עד 14 ימים.נקב נקודה אחת באמצעות מכשיר חד-פעמי של 6 מילימטר מכל עיגול ספוג בדם של כרטיס הסינון מסוג grade 9 0 3; העבר את כל נקודות הדם המיובשות שננקבו מאותו פציינט לבאר אחת של פלטה בעלת 12 בארות; מלא את הבאר בתמיסת סליין עם בופר פוספט המכילה 0.05% tween 20 ו-0.08% Sodium azide. חזור על שלבים אלו כדי להשיג סדרה שנייה של EITs מנקודות דם מיובשות לצורך ביצוע אנליזות מולקולריות.לאחר מכן, הניחו את צלחת תרבית התאים על מנער מעבדה והניחו לנקודות הדם המיובשות (punch dried blood spots) להישטף בעדינות למשך ארבע שעות לפחות, או רצוי למשך הלילה. למחרת, הנקודות יהיו כמעט נקיות מדם, ונוצרו על-עלים המוליכים המוליזין (hemolytic supernatants). העבירו את ה-EITs הללו למבחנות מיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 10,500 ×g כדי לשחרר.העלונות (supernatants) מכל השקיעים שנוצרו במהלך סבבי הצנטריפוגה של ה-EITs במכשיר Ellucian מוכנות כעת לשימוש בניתוחים המיועדים. הסדרה הראשונה של ה-EITs מועברת לכוסות לבדיקות סרולוגיות. הסדרה השנייה מועברת למבובות מיקרו (micro tubes) לצורך ניתוח PCR.בדקו את ה-EITs למסמנים של נגיפי צהבת B, צהבת C וזיהום ב-HIV באמצעות בדיקות זמינות מסחרית, ופעלו בקפידה לפי הוראות היצרן הרלוונטיות. לבסוף, תוצאות הבדיקה הסרולוגית באנלייזר האוטומטי המלא מוצגות על גבי מסך המערכת. יעילותו של הפרוטוקול המוצע להכנה ולעיבוד של נקודות דם יבשות הוערכה תחילה על ידי ניתוח של 1,762 זוגות של נקודות דם יבשות של סרום מצומד, ביחס לקביעת אנטיגן פני השטח של נגיף צהבת B.פרוטוקול הבדיקה שונה מכיוון שעם ערך סף של 0.05 יחידות בינלאומיות למיליליטר, 56.2% מה-EITs היו ריאקטיביים בהשוואה לתוצאות שהתקבלו מ-Sarah. דבר זה תאם לשיעור חיוביים כוזבים של 14.7% בבדיקה של אנטיגן פני השטח של נגיף ההפטיטיס B. ניתוח ROC (Receiver operating characteristic) של הנתונים העיד כי העלאת הסף ל-0.15 יחידות בינלאומיות למיליליטר תביא להפרדה אידיאלית בין דגימות חיוביות לאנטיגן פני השטח של נגיף ההפטיטיס B לדגימות שליליות לאנטיגן פני השטח של נגיף ההפטיטיס B; כאשר נבדקו זוגות של סרום ונקודות דם יבשות לנוכחות של אנטיגן פני השטח של נגיף ההפטיטיס B, התקבלו רק שתי תוצאות סותרות.שתי התוצאות השליליות השגויות עבור Sarah מקורן בחולים תחת טיפול אנטי-ויראלי. הקביעה האיכותית של H-B-V-D-N-A באמצעות real-time PCR מדגימות EIT של דם מלא הניבה רגישות של 93% ולכן שבע דגימות עם ריכוזי H-B-V-D-N-A נמוכים בסרום לא זוהו. רק ארבע תוצאות שליליות שגויות עבור anti HCV נקבעו מדגימות EIT של טיפות דם מיובשות.סביר מאוד שה-C הרלוונטיים נלקחו ממטופלים שהזיהומים שלהם נרפאו מזמן. הרגישות האנליטית של 100% לקביעת H-C-V-R-N-A מ-EITs של נקודות דם יבשות העידה על הרגישות המצוינת של גישת ה-isothermal transcription mediated amplification, ששימשה להגברת H-C-V-R-N-A. גילוי נוגדנים ל-HIV ב-EITs של נקודות דם יבשות באמצעות מערכת אוטומטית מלאה הוביל אף הוא לרגישות אנליטית של 100%. סרטון זה מראה כי כיום ניתן לזהות באופן מהימן סמנים סרולוגיים ומולקולריים של זיהומי הפטיטיס B, הפטיטיס C ו-HIV בנקודות דם יבשות, גם כאשר נעשה שימוש בנפח אלואציה גבוה יחסית ושינויים בפרוטוקולי הבדיקה שנקבעו לבדיקות סרום או פלזמה אינם משמעותיים.עם זאת, התוצאות שדווחו אישרו גם את המגבלות המובנות של טכניקת נקודות דם יבשות. במקרים מסוימים. הפרוטוקול שפורט נבחן גם בתנאי שטח בקרב 534 משתמשי סמים פעילים בערים הגרמניות ברלין ואסן במהלך שלב הפיילוט של המחקר סמים ומחלות זיהומיות כרוניות.התוצאות שהתקבלו הובילו לשינוי מינורי באלגוריתם הבדיקה עבור השלב המרכזי של מחקר התרופה בשישה ערים גדולות נוספות בגרמניה.

dried-blood-spots-preparing-processing-for-use-immunoassays-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זיהוי מטרות מיקרוביאלי של חסינות אדפטיבית במחלות אידיופטית ניתן להשיג על ידי שימוש assay האנזים צמוד immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

פרוטוקול פשוט להכנת תמציות של רקמה אנושית שתשמש כמקור לאנטיגנים במבחנים תפקודיים תא T מתואר. שיטה זו מאפשרת תגובות תא T לאנטיגנים המופקים מרקמות כדי...

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

אנחנו מתארים שיטה חדשה של בידוד הדנ"א הגנומי מכל הדם שנאסף לפלזמה / סרולוגיה. לאחר איסוף פלזמה, הדם הדחוס בדרך כלל מושלך. השיטה החדשה שלנו מהווה שיפור משמעותי על פני שיטות קיימות והופכת את ה-DNA ופלזמה זמינה מאוסף אחד, מבלי לבקש דם נוסף.

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

סמנים ביולוגיים הם אינדיקטורים ביולוגיים ישירות נמדדים של מחלה או בריאות. באוכלוסייה ובמדעי חברה, סמנים ביולוגיים צריכים להיות קל להשגה, תחבורה, ולנתח. אוסף ספוט דם יבש (DBS) עונה על צורך זה, יכול להיות שנאסף בתחום עם שיעורי תגובה גבוהים וניתח עבור מגוון רחב של סמנים ביולוגיים.

יבש של אוסף דם ספוט בריאות סמנים למקסם את ההשתתפות בלימודי אוכלוסייה

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

שיטה פשוטה אך יעילה המעסיקה חלקיקים מגנטיים כדי לזהות ולהעשיר תאי B-reactive אנטיגן לניתוח פונקציונלי פנוטיפי מתואר.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה שימושי לאחסון דם היקפיים, סרום/פלזמה עבור ניתוחים במורד הזרם כמו assay אליסה והערכת פולימורפיזם (הסנ פ) של נוקלאוטיד יחיד.

יבש הדם ולנקודות סרום ככלי שימושי עבור אחסון מדגם להעריך סמנים ביולוגיים לסרטן

פרוטוקול זה מפרט הכנה קלינית ליישום של דגימות PBMC ופלזמה באיכות גבוהה באתר הניסוי הקליני שניתן להשתמש בהן לניתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.

הכנת כדורי תאים מונונוקולריים בדם היקפי ופלזמה מהגרלת דם אחת באתרי ניסוי קליני לניתוח סמנים ביולוגיים

לכידת שינויים דינמיים בהפעלת החלבונים של תאי דם אדומים מעוררים אתגרים מתודולוגיים, כמו שימור שינויים דינמיים לגירויים חריפים לצורך הערכה מאוחרת יותר. הפרוטוקול המוצג מתאר טכניקות הכנת דגימה וצביעה המאפשרות שימור וניתוח של שינויי חלבון רלוונטיים וזיהוי לאחר מכן.

זיהוי מבוסס חיסונים של שינויים דינמיים בחלבוני תאי דם אדומים

בדיקות חיסוניות מבוססות דם מלא מספקות כלי קל וחסכוני במשאבים לניתוח חסינות ספציפית לאנטיגן למטרות אבחון ומחקר. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי מבוסס דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח מקיף של חסינות המאכסן לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים, כולל גרסה בנפח נמוך עבור חולים ילדים ובעלי חיים קטנים.

בדיקת דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח ספציפי לאנטיגן של חסינות המארח לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים

אנו מתארים פלטפורמת בדיקה חיסונית שפותחה לאחרונה המבוססת על עקרונות הביולוגיה הסינתטית נטולת התאים וטכניקת כתמי הנקודות לזיהוי מותאם אישית של תגובת נוגדנים בבני אדם ובעלי חיים.

כתם נקודות נטול תאים כפלטפורמת בדיקה חיסונית מעשית וניתנת להתאמה לזיהוי תגובת נוגדנים בסרום של בני אדם ובעלי חיים

למד פרוטוקול סטנדרטי להכנת כתמי דם מיובשים לשימוש באימונואסייז ובטכניקות מולקולריות. השיטה מאפשרת זיהוי אמין של נגיפי הפטיטיס B, C ו-HIV מדגימות קפילריות.

כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות

גלה סרטונים נוספים