כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק פרוטוקול סטנדרטי להכנה ועיבוד של כתמי דם מיובשים שישמשו לאחר מכן בבדיקות אימונולוגיות ובטכניקות מולקולריות. זה מושג על ידי לקיחת דם נימי והעברתו לכרטיס פילטר. השלב השני הוא לייבש כתמי דם למשך הלילה ולהשיג אגרופים של שישה מילימטר מתוך עיגולי כרטיס המסנן.

לאחר מכן, איאן הדם המיובש מהאגרופים מושג על ידי טבילה במאגר על שייקר למשך ארבע שעות לפחות. לאחר מכן, ה-EITs המוליטיים משוחררים מפסולת על ידי צנטריפוגה. השלב האחרון הוא לנתח את ה-EITs שאושרו עבור סמנים סרולוגיים ומולקולריים של זיהומים בהפטיטיס B, הפטיטיס C ונגיפי כשל חיסוני אנושי על ידי בדיקות אימונולוגיות וטכניקות מולקולריות זמינות מסחרית.

הרעיון להשתמש בחלקה שנאספה על כרטיס סינון עשוי סלולרי מקורו לפני מאה שנה. עם זאת, אנשים המשתמשים בשיטה זו בפעם הראשונה יתקשו לעתים קרובות גם היום מכיוון שכל השלב הקדם-אנליטי, הכולל הכנה ועיבוד של כתמי דם יבשים לניתוח הסופי שלהם, לא תוקנן כמעט לכל היישומים של בדיקת כתמי דם מיובשים. בהתחשב ברקע זה, אנו מציעים פרוטוקול סטנדרטי מקיף צעד אחר צעד להכנה ועיבוד של כתמי דם מיובשים שישמשו לאחר מכן בבדיקות חיסוניות וטכניקות מולקולריות.

הדגמה חזותית של מתודולוגיה זו נראית חיונית מכיוון שמספר שלבים כמו הורדת דם נימי. זה נכון. העברה לכרטיסי הסינון או הכנת אגרופים מתאימים מהקהל אינם קלים ללמידה, וכתוצאה מכך, אנשים המשתמשים בטכניקה בפעם הראשונה ללא ספק ייהנו מייצוג חזותי.

דם נימי יילקח מאצבעו של ניקו על ידי טכנאי מהמעבדה שלנו המדגים את הליך העיבוד. כתמי הדם שיתקבלו יהיו על ידי הטכנאי ko, שעובד כבר שנים רבות במעבדה שלנו לאבחון ביולוגי מולקולרי לניקוב העור. תחילה לבשו זוג כפפות גומי לטקס חד פעמיות.

לפני ניקוב העור, על המטופל לחמם את ידיו. האצבע עוברת עיסוי רב כדי להעשיר את זרימת הדם לכיוון מקום הניקוב העליון. לאחר מכן נקו את העור של צד פאלמר של הפלנקס הדיסטלי של האצבע השלישית או הרביעית של היד שאינה כותבת עם חומר חיטוי מתאים לנקב את העור על ידי רומח בטיחות לשימוש חד פעמי.

יש להחזיק את האצבעות במצב כזה שכוח הכבידה יקל על איסוף הדם על קצה האצבע. נגב את טיפת הדם הראשונה עם פד גזה מכיוון שהיא עלולה להכיל עודף נוזלי רקמות. לאחר עיסוי האצבע שוב כדי להגביר את זרימת הדם במקום הניקוב, העבירו את הטיפה הבאה לאחד העיגולים של כרטיס סינון מבלי לגעת ישירות במשטח עם קצה האצבע.

תנו לטיפה הגדולה הבאה של דם נימי להיווצר על קצה האצבע ואספו אותה במעגל הבא. המשך בהליך זה עד למילוי כל המעגלים הדרושים או להפסקת זרימת הדם במהלך האיסוף. אפשר לדם להיספג במרקם המסנן על ידי כוחות נימיים בלבד.

אין לסחוט או לחלוב את האצבע יתר על המידה אם זרימת הדם אינה מספיקה כדי למלא את כל העיגולים הנדרשים של כרטיס המסנן. אם זרימת הדם נפסקת, הניחו תחבושת על קצה האצבע, בצעו ניקוב עור שני באצבע אחרת אם יש צורך בדם נוסף לבדיקה לייבוש כתמי הדם, הניחו את כרטיסי הסינון על מגבת נייר נקייה בארון בטיחות ביולוגי ותנו להם להתייבש, רצוי לילה בטמפרטורת החדר. בהיעדר מקור חום חיצוני כלשהו, כאשר תהליך הייבוש הושלם, כתמי הדם הם בעלי צבע חום כהה אחיד ולא נראים עוד אזורים אדומים לאחסון.

הכניסו את כרטיס נייר הסינון לשקית רוכסן אטומה לגז אחת המכילה שקית ייבוש אחת עד שתיים כדי להגן על הדגימות מפני לחות. העבירו את השקית למקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס ומטה בהקדם האפשרי. אם מקפיאים אינם זמינים בתנאי שטח, אחסון במינוס ארבע מעלות צלזיוס או אפילו בטמפרטורת הסביבה אפשרי עד 14 יום.

נקב נקודה אחת עם מכשיר חד פעמי של שישה מילימטר מכל עיגול ספוג בדם של העברת כרטיס סינון דרגה 9 0 3, כל כתמי הדם המיובשים מנוקבים מחולה יחיד לבאר אחת מתוך 12. צלחת באר מלאו את הבאר במי מלח חוצצים פוספט המכילים 0.05% טווין 20 ו-0.08% נתרן אזיד. חזור על שלבים אלה כדי להשיג סדרה שנייה של EITs מיובשים בדם על מנת לבצע ניתוחים מולקולריים.

לאחר מכן הניחו את צלחת תרבית התאים על שייקר מעבדה ותנו לכתמי הדם המיובשים לנקב בעדינות למשך ארבע שעות לפחות או רצוי למשך הלילה. למחרת, הכתמים כמעט נקיים מדם ונוצרו סופרנטנטים המוליטיים. העבירו את ה-EITs הללו לצינורות מיקרו צנטריפוגות, ואז הכניסו אותם לצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-10, 500 פעמים G לשחרור.

הסופרנטנטים מכל פסולת שנוצרה במהלך EITs צנטריפוגים של Ellucian מוכנים כעת לשימוש עבור הניתוחים המיועדים. הסדרה הראשונה של EITs מועברת לכוסות לבדיקה סרולוגית. הסדרה השנייה מועברת למיקרו צינורות לניתוח PCR.

חקור את ה-EITs לאיתור סמנים של נגיף הפטיטיס B, נגיף הפטיטיס C וזיהום HIV באמצעות בדיקות זמינות מסחריות ופעל לפי הוראות היצרן המתאים. לבסוף, תוצאות הבדיקה הסרולוגית על המנתח האוטומטי לחלוטין מוצגות על מסך המערכת. יעילות הפרוטוקול המוצע להכנה ועיבוד של כתמי דם מיובשים הוערכה לראשונה על ידי ניתוח 1,762 זוגות כתמי דם מיובשים בסרום ביחס לקביעות אנטיגן פני השטח של נגיף הפטיטיס B.

פרוטוקול הבדיקה שונה מכיוון שעם ערך חתך של 0.05 יחידות בינלאומיות למיליליטר, 56.2% מה-EITs היו תגובתיים בהשוואה לתוצאות שהתקבלו משרה. זה תואם לשיעור חיובי כוזב של 14.7% בבדיקת אנטיגן פני השטח של נגיף הפטיטיס B. ניתוח מאפיינים תפעוליים של הנתונים הצביע על כך שהעלאת הסף ל-0.15 יחידות בינלאומיות למיליליטר תביא להפרדה אידיאלית של אנטיגן פני השטח של נגיף הפטיטיס B מאנטיגן פני השטח של נגיף הפטיטיס B שלילי בעת חקירת זוגות כתמי דם מיובשים בסרום לנוכחות אנטיגן פני השטח של נגיף הפטיטיס B, התקבלו רק שני סתירות.

שתי השליליות השגויות שרה מקורן בחולים שקיבלו טיפול אנטי-ויראלי. הקביעה האיכותית של H-B-V-D-N-A על ידי PCR בזמן אמת מ-EIT בדם מלא הניבה רגישות של 93% ולכן לא זוהו שבע דגימות עם ריכוזי H-B-V-D-N-A נמוכים בסרום. רק ארבע תוצאות שליליות כוזבות נגד HCV נקבעו מ-EITs מיובשים בדם.

סביר מאוד להניח שה-C המתאים נלקח מחולים שהזיהומים שלהם נפתרו מזמן. הרגישות האנליטית של 100% לקביעות H-C-V-R-N-A מ-EITs של כתמי דם מיובשים הצביעה על הרגישות המצוינת של גישת ההגברה בתיווך שעתוק איזותרמי, ששימשה להגברת H-C-V-R-N-A. איתור נוגדנים נגד HIV בכתמי דם מיובשים עם מערכת אוטומטית לחלוטין הביא גם לרגישות אנליטית של 100%סרטון זה מראה כי כיום ניתן לזהות באופן אמין סמנים סרולוגיים ומולקולריים של זיהומי הפטיטיס B, הפטיטיס C ו- HIV בכל כתמי הדם ההדוקים, גם כאשר נעשה שימוש בנפח פליטה גבוה יחסית ושינויים בפרוטוקולי החיבור שנקבעו לחקירות סרום או פלזמה הם לא השתנה באופן משמעותי.

עם זאת, התוצאות שהועברו אישרו גם את המגבלות האינהרנטיות של טכניקת כתמי הדם המיובשים. במקרים מסוימים. הפרוטוקול המתואר נבדק גם בתנאי שטח על 534 משתמשי סמים פעילים בערים הגרמניות ברלין ואסן במהלך שלב הפיילוט של המחקר על תרופות ומחלות זיהומיות כרוניות.

התוצאות שהתקבלו הובילו לשינוי קל באלגוריתם הבדיקה לשלב העיקרי של מחקר התרופה בשש ערים גדולות נוספות בגרמניה.