Name: Lepr Db עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למדו בידוד איי לנגרהנס מעכברי Lepr Db לסוכרת מסוג 2 והדמיית פליטת אינסולין בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית שני-פוטון. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הפרשת האינסולין בתאי בטא בחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של מועצת המחקר האוסטרלית DP110100642 (ל-PT) ומענקי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי APP1002520 ו-APP1059426 (ל-PT ו-HYG).

הערה: כל הניסויים הנוכחיים בוצעו על פי נהלים המקומיים אתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת קווינסלנד (שאושרו על ידי אוניברסיטת קווינסלנד, ועדת האתיקה Biosciences אנטומי). 1. בידוד איילט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת של אנזימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעיכול הלבלב, להשתמש בתערובת של הסוג IV liberase וcollagenase. לדלל TL liberase (thermolysin הנמוך) בקבוקון 1 של 5 מ&quot;ג עם 26 מיליליטר של DMEM (הנשר בינוני השתנה Dulbecco). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סוג IV collagenase במאגר של האנק בריכוז של 0.5mg / מיליליטר, בתוספת 5 מ&quot;מ HEPES, 0.5mm CaCl 2, 0.1mg / מיליליטר DNAse ו1mg / אלבומין בסרום שור מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את TL liberase ופתרונות collagenase ביחס של 4: 1 (לפי נפח), כלומר, 4 מיליליטר liberase collagenase מיליליטר TL + 1. Aliquot התערובת של אנזימים ל2.5ml כל חנות ב -20 ° C. הערה: הפעמים הדגירה רקמת vארי קצת בין קבוצות של אנזים (הבדל דק &#39;30 שניות ל1). לכן, ייתכן שתידרש בדיקה אצווה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה בידוד RPMI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר בקבוקון אחד של אבקת RPMI 1640 ב1 ליטר של מים בRT ולהשלים עם 2 גרם NaHCO 3, 4.02 HEPES ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תקשורת בידוד RPMI בבקבוק חרוטי גדול, לערבב עם בוחש מגנטי, להסתגל לpH 7.4 עם NaOH, המסנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI תרבות מדיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקשורת תרבות RPMI, עם 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה 1% (כלומר, פניצילין 100 U / ml, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד וCulturing איון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורבן של בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברי נקע בצוואר רחם או מחנק CO 2 על פי נהלי האתיקה של המוסד המקומי. לרסס את גוף העכבר ביסודיות עם אתנול 70%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף לבלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uקיצוצי se 2 ארוכים רוחבי דרך העור וצפק הבטן לעשות דש בצורת V. משוך את הדש של העור עד כדי לחשוף את חלל הבטן כולו, לשים בצד את המעי ולשמור על הכבד במקום על ידי נייר טישו מקופל כדי לחשוף את צינור מרה המשותף (איורים 1 ו -2). שים את בעלי החיים, כך שהראש כלפי המנתח והזנב מהמנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהדק כלי דם בampulla על קיר תריסריון לחסום אנזימים המוזרקים מלהיכנס לתריסריון (איור 1). הערה: זהו צעד חשוב כפי שקובע אם האנזימים הזריקו ייכנסו לצינור הלבלב וינקבו הלבלב או רפלוקס לאתר ההזרקה (מעל מהדק) או ללכת לתריסריון (תחת מהדק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate צינור מרה המשותף עם מחט G 31 בסמוך לצומת של צינור הכבד הנפוץ וצינור פיברוזיס (איור 1) ולהשאיר מקום לזריקה שנייה, אם הלבלב הדואר אינו ינקב בפעם הראשונה. לאט לאט (מעל ~ 10 שניות) להזריק כ -2 מיליליטר של תערובת אנזים קרה לתוך צינור המרה משותפת העכבר. הערה: הלבלב יהיה perfused במהירות אם המהדק נמצא במצב תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את מיקום המהדק אם המחט נמצאת בתוך צינור המרה המשותף, אבל לא יכולה perfuse הלבלב (כלומר., להעביר את המהדק קצת מהכבד אם על מהודק או להעביר אותו קצת בכבד אם תחת מהודק). הערה: המחט לפעמים הולכת לכמוסה המקיפה במקום לומן של הצינור. סימן שימושי כדי לבדוק אם המחט נמצאת בתוך צינור המרה המשותף היא ההתרחבות של הצינור כאשר הזרקה. אם הלבלב אינו ינקב, אלטרנטיבה היא תערובת האנזים יכולה להיות מוזרקת לאתרים מרובים של הלבלב עם תשואה נמוכה הצפויה. טפטוף של אתר השמאל של הלבלב (אונת הטחול) הוא חשוב למקסום תשואת איון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הלבלב הוא perfused, להסיר במהירות את הלבלב, הכניס אותו לתוך בקבוקון (~ 20 מיליליטר, זכוכית) ודגירה ~ 19 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: זמן הדגירה יכול להשתנות קצת בהתאם לזן העכבר וגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן הדגירה, לעצור את תהליך העיכול על ידי הוספה ~ 20 מיליליטר של תקשורת בידוד הקרה. לנער את הבקבוקון בעדינות כדי לשבש את הלבלב ולשפוך אותו דרך מסננת רגיל תה (קוטר נקבובית של 1 מ&quot;מ) לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי. למעלה למעלה הצינור עם תקשורת בידוד וצנטריפוגות ב 400 XG דקות 1 ב 4 ° C עם בלם משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה בתקשורת הבידוד שוב ולהעביר לשני צינורות 15 מיליליטר, אז צנטריפוגות ב 400 XG דקות 1 ב 4 ° C עם בלם משם. לאחר שאיפת supernatant, לערבב את שני כדורים היטב עם 6 מיליליטר של תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות (פתרון Histopaque 1,077) לכל צינור על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה. ואז בעדינות להוסיף ~ 6 מיליליטר של תקשורת הבידוד לצד של הצינור על גביתקשורת שיפוע צפיפות ההפרדה וצנטריפוגות בבמשך 15 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס עם בלם משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant ב( תקשורת בידוד) העליונה, שכבה (תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות) אמצע והנמוך ב 3 מנות נפרדות. בוחר ידני את האיים ב 3 מנות אלה, באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ לנתח. הערה: השכבה האמצעית מכילה את רוב האיים. איים מוכרים כמבנים קומפקטיים של ~ 50 ל 500 מיקרומטר בגודל (איור 3). אנו משיגים ~ 200 איים בעכברי WT ו300 &lt;100 בעכברי db / db איים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Culturing איון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעזור לאיים להתאושש מעיכול האנזים, קבוצות התרבות של 40 איים בצלחת פטרי 25 סנטימטר עם 6ml תקשורת תרבות RPMI (גלוקוז 10 מ&quot;מ) על 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 / O 2 עבור 2 ימים לפני שידור חי -cell הדמיה 2-פוטון. לשנות את התקשורת והתרבות יומית. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. תא חי 2-פוטון הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ תאי נתרן עשיר עבור assay 2-הפוטון עם 140 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 5 מ&quot;מ NaHCO 3 ו -10 מ&quot;מ HEPES. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay 2-הפוטון, להכין SRB המניה 8 מ&quot;מ במאגר תאי, aliquot לתוך צינורות קטנים וחנות ב -20 ° C. לדלל את מניות SRB 1:10 ב חיץ תאי טרי כדי לקבל ריכוז עבודה של 0.8 מ&quot;מ. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה פוטון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לפני דגירה איים תרבותיים 2 ימים במאגר תאי גלוקוז 3 מ&quot;מ למשך 30 דקות. הערה: אנו משתמשים באיים בין 2 ל 5 ימים בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, במקום שקופיות זכוכית על התא תרמו-שליטה רכוב על הבמה מיקרוסקופ. השתמש גריז כדי למנוע הדליפה של פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את החדר עם 500 μl של extracellמאגר ular המכיל 0.8 מ&quot;מ SRB עם ריכוזים שונים של גלוקוז (3 מ&quot;מ, 6 מ&quot;מ, 15 מ&quot;מ ו -20 מ&quot;מ גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, למקם את איון מראש מודגרות לאמצע החדר ולהתמקד ב 3-4 שכבות תאים לאיון בי, באיי מכרסמים, immunostaining לאינסולין מראה כי רוב התאים בטא תאים. הערה: SRB מתאר את כל קרום התא של איון במהירות ובאיון מוכן תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ 2-פוטון עם מטרת 60x טבילת שמן (NA 1.42) ותוכנת הדמיה (למשל., ScanImage 11). איור 4 ממחישים הסדר מיקרוסקופיה טיפוסי. אירועי תמונה exocytic באמצעות SRB כקרום סמן תאי ניאון impermeant הנרגש פעימות לייזר פמטו-שניות ב880 ננומטר, עם הקרינה שזוהו ב550-650 ננומטר. רשום את תגובות איון לגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות אירועי exocytic אחת על ידי הופעתו הפתאומית של נקודת ניאון קטנה (רזולוציה של 10 פיקסלים /1; מ &#39;) ולאשר על ידי השלב המהיר העולה של אות הניאון מעל אזור של עניין (~ 0.78 מיקרומטר 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

<html> הגורם הקריטי ביותר בבידוד איון הוא זלוף הראשוני של הלבלב; תחת perfused תוצאות לבלב בתשואת איון נמוך משמעותי. גורמים אחרים משפיעים גם על איכות הבידוד כגון זמן העיכול והרמה של טלטול שיכול לפצות באופן חלקי לרמה של זלוף. לדוגמא, לבלב perfused באופן מלא יהיה צורך טופח על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 שניות 18 דקות בזמן שלוחץ בעדינות, בניגוד תחת מתעכל לבלב עשוי לדרוש ~ 20 דקות עם רעד עיכול קשה יותר. התערובת של שני אנזימי עיכול בידיים שלנו מספקת בידוד איון טוב יותר מאשר כל אחד לבד. לco...

התפקיד של תפקוד לקוי של בטא-תא במחלה הוכר נרחב 3,4. שורות תאים כגון MIN6 ואח&quot;י-1 הן כלים שימושיים כדי להבין את הביולוגיה של תאי הבטא התנהגות. עם זאת, השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין מתרחשת בתוך האיים לנגרהנס. איים אלה מכילים אלפי תאי הבטא צפופים, כמו גם כלי דם וסוגי תאים אנדוקריניות אחרים. סביבה זו באיון משפיעה הפרשת אינסולין ועשויה להיות חשוב בסוכרת. לכן, כדי להבין את השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין, והפתופיזיולוגיה של מחלה, חשוב ללמוד איים שלמים. בידוד איון איים חיים אדם ו, באיים מסוימים, אדם מחולי סוכרת מסוג 2 הם קשים להשגה. בנוסף, יש לי איים אנושיים אפשרויות מוגבלות למניפולציה מולקולרית ניסיונית. חוקרים לכן מועסקים הואמאפשר מבעלי חיים ומודלים של בעלי חיים של סוכרת מהסוג 2. מודל מחלה אחת כזו הוא עכבר db / db. זוהי מוטציה ספונטנית שמודלי סוכרת מסוג 2 עם התקדמות הפנוטיפ שמקבילה מחלה אנושית 5,6 מקרוב. יש הפרוטוקול המובא כאן לבידוד איון מעכברי db / db סוכרת שלבים רבים במשותף עם קבוצות אחרות עם כמה חידודים לתשואה טובה יותר, טיהור והישרדות איון משופרת. הדמיה 2 פוטון Assay 2-הפוטון לחיות התאים המתוארים כאן מאפשר לחוקרים לכמת את המספר ולהעריך את המאפיינים של גרגרים המכיל אינסולין אחת מהתאים רבים של 7 סוכרת והסוג בר על האיים קטנטנים 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 מ"ג</td><td>Roche-5401020001</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>קולגנאז מסוג IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 מ"ל</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>להכנת מדיה מבודדת</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 מ"ל</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>להכנת מדיה מתורבתת</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין 100 מ"ל</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>להכנת מדיה מתורבתת &nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי 500 מ"ל</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>להכנת מדיה מתורבתת</td></tr><tr><td>DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>לדילול תוכנית המטמורף של liberase</td></tr><tr><td></td><td>מכשירים מולקולריים, ארה"ב</td><td></td><td>לניתוח תמונות 2 פוטונים</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וlive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

סוכרת מסוג 2 היא מחלה כרונית המשפיעה על 382 מיליון אנשים בשנת 2013, והוא צפוי לעלות ל 592 מיליון על ידי 2035 1. במהלך 2 העשורים האחרונים, את התפקיד של בעיות בתפקוד התא בטא בסוכרת מהסוג 2 כבר נקבע 2 באופן ברור. התקדמות מחקר נדרשת שיטות לבידוד של איי לבלב. הפרוטוקול של בידוד איון מוצג כאן מניות רבות צעדים משותפים עם פרוטוקולים מקבוצות אחרות, עם כמה שינויים כדי לשפר את התפוקה ואיכות של איים מבודדים משני הסוג בר וdb Lepr סוכרת עכברים (DB / DB). שיטת הדמיה 2-פוטון לחיות תאים מכן הציגה שיכול לשמש כדי לחקור את השליטה בהפרשת אינסולין באיים.

תשואה וטיהור איון לעכבר נורמלי סוג בר, כ -200 איים צפויים. איים בריאים נראים בהירים, בצורה עגולה ויש לי גבול חלק. אצווה בידוד מתעכל-על בדרך כלל יש איים קטנים ומטושטשים בזמן שיש אצווה-מתעכל תחת פחות איים ואיוני acinar תא מצורף (איור 3). לעכברי db / db סוכרת, תשואת איון וההופעה תלויה בהתקדמות המחלה עם עכברים גליקמי טובים יותר איים גדולים יותר, בהירים יותר ויותר (עד 300 איים) בהשוואה לעכברי גליקמי ג...

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג אילחקים (eyelets) חיים ובריאים מעכברים LEP R DB סוכרתיים, ולהעריך את הפרשת האינסולין מתאי בטא בתוך האילחקים באמצעות דימות פוטונים של תאים חיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ריאגנטים כגון תערובת האנזימים לעיכול הלבלב, מצעי תרבית לגידול האילחקים, והבופר החוץ-תאי לבדיקת הפוטונים הכפולים. לאחר מכן, פותחים את בטנו של עכבר שהורג (euthanized) ומזריקים את תערובת האנזימים לתוך הלבלב כדי לעכל את האיבר.לאחר מכן, מפרידים את האיליטים (eyelets) מהעיכול הלבלבי ומגדלים אותם בתרבית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי לדמות היתוכים של גרגירי אינסולין בודדים מתאי בטא בתוך האיליט. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יעזור לחוקרים להבין כיצד נשלטת הפרשת האינסולין במצב בריאותי ובמצב מחלה.השיפור המרכזי בטכניקת בידוד האיליים הוא השימוש באנזימים מעורבים לשיפור התוצאה וחיוניות האיליים. טכניקת דימוי הפוטון הכפול היא כעת השיטה היחידה להקלטת הפרשת אינסולין מתאים של תאים בתוך אילי שלם. כדי להכין את האנזימים לבידוד אילי הלבלב, השקף בקבוקון אחד של 5 mg של liase TL ב-26 ml של DM EM, והכן את ה-collagenase type four בבופר הנקס (Hank's buffer) בריכוז של 0.5 mg/ml, בתוספת של תמיסות ה-liase TL וה-collagenase המעורבות הבאות.ביחס של ארבעה לאחד לפי נפח, חלק את תערובת האנזימים למכסות של 2.5 milliliters כל אחת ואחסן בטמפרטורה של negative 20 degrees Celsius. להכנת מצע בידוד RPMI, בתוך מבחנה קונית גדולה המכילה ליטר אחד של מים, המס בקטורת אחת של אבקת RPMI 1 6 4 0 בטמפרטורת החדר והוסף שני גרם של sodium bicarbonate ו-4.02 גרם של HEPES. השתמש ב-sodium hydroxide כדי לכוון את ה-pH ל-7.4, לאחר מכן סנן, סטריליז וסנן, ואחסן בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.הכינו מצע גידול RPMI על ידי הוספת 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה למצע בידוד RPMI עבור דימות פוטונים כפולים. הכינו באפר חוץ-תאי עשיר בנתרן עם הרכיבים הבאים. להכנת צבע חוץ-תאי, הכינו תמיסת סטוק של SRB בריכוז שמונה מילימולר, חלקו את הבאפר החוץ-תאי למבחנות קטנות ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.כדי להגיע לריכוז עבודה, השתמש בבפר חוץ-תאי (extracellular buffer) טרי כדי לדלל את מלאי ה-SRB ביחס של 1:10. לאחר הקרבת העכבר וריסוס יסודי של גופו ב-70% ethanol בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מקם את בעל החיים כאשר הראש פונה לכיוון המנתח והזנב הרחק ממנו. בצע שני חיתוכים צדיים ארוכים דרך עור הבטן והפריטונאום כדי ליצור פתח בצורת V.משכו את מקרי העור כלפי מעלה כדי לחשוף את כל חלל הבטן. הזיזו הצידה את המעיים, ובאמצעות הרקמה המקופלת, החזיקו את הכבד במקומו כדי לחשוף את תעלת המרה המשותפת. לאחר מכן, הצמידו תסביך כלי דם (vascular clamp) באמבולה על דופן התריסריון כדי למנוע מהאנזימים המוזרקים להיכנס לתריסריון.זהו שלב חשוב הקובע אם האנזימים הלבלביים יחדרו אל רפלקס תעלת הלבלב, אל אתר ההזרקה או אל התריסריון. השתמש במחט בכילור (gauge) 31 כדי לבצע קנולציה של צינור המרה המשותף בקרבת נקודת החיבור של צינור הכבד המשותף וצינור כיס המרה, והשאר מקום להזרקה שנייה. אם הלבלב אינו מרווי (perfuse) בפעם הראשונה, הזריק באיטיות כ-two milliliters של תערובת אנזימים קרה אל צינור המרה המשותף של העכבר.אם התסמיך נמצא במיקום הנכון, הלבלב יעבור פרפוזיה מהירה. ברגע שהלבלב עבר פרפוזיה, הוצא את האיבר במהירות, הנח אותו בתוך מבחנה מזכוכית והדגר אותו במקלחת מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כ-19 דקות. לאחר ההדגרה, עצור את תהליך העיכול על ידי הוספה של כ-20 milliliters של מדיום בידוד קר.נער את המבחנה בעדינות כדי לפרק את הלבלב ושפוך אותה דרך נפה T סטנדרטית עם גודל נקבים של 1 mm לתוך מבחנה סטרילית של 50 mL. השתמש במדיום הבידוד כדי למלא את המבחנה עד למעלה וסבב בצנטריפוגה ב-400 G ובטמפרטורה של 4°C למשך דקה אחת. כאשר הצנטריפוגה נעצרת, הוסף מדיום בידוד למשקע והמס אותו.לאחר מכן, העבירו את התרחופה לשתי פרוטות של 15 מיליליטר וסבבו שנית. לאחר שאיבת העל-נוזל, הוסיפו שש מיליליטרים של מדיום להפרדת תאים במדרג צפיפות לכל פרוטה, וערבבו באמצעות פיפטה או וורטקס לשחזור התרחופה. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות מצד הפרוטות כשישה מיליליטרים של מדיום בידוד מעל המדיום להפרדת תאים במדרג צפיפות, וסבבו בצנטריפוגה ב-100 G ובטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.עם ההפרדה, אספו את השכבות העליונה, האמצעית והתחתונה לשלוש צלחות נפרדות. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמשו בפיפטה כדי לבחור ידנית את ה-eyelets משלוש הצלחות. רובם יימצאו בשכבה האמצעית, כדי לסייע ל-eyelets להתאושש מעיכול האנזימים.הכינו קבוצות של 40 איילטים (eyelets) בצלחות פטרי של 25 סנטימטר עם שישה מיליליטר של מצע גידול RPMI המכיל 10 millimolar גלוקוז, וגודלו במשך יומיים. החליפו את המצע מדי יום כדי לבצע דימות פוטון כפול כבדיקה עקיפה למדידת הפרשת אינסולין. התחילו בשימוש ב-three millimolar גלוקוז בבופר חוץ-תאי כדי להדגיר מראש את האיילטים שגודלו במשך יומיים.במשך 30 דקות, מרחו גריז עלבמת המיקרוסקופ כדי למנוע דליפה של התמיסה, והתקינו עלבמת המיקרוסקופ תא בקרת טמפרטורה המכיל סלייד זכוכית. לאחר מכן, כסו את התא ב-500 µL של באפר חוץ-תאי המכיל 0.8 mM SRB וריכוזים שונים של גלוקוז. לאחר מכן, הניחו את ה-eyelet שעבר אינקובציה מוקדמת במרכז התא ובצעו פוקוס לעומק של שלושה עד ארבעה שכבות תאים בתוך ה-eyelet.באיים של מכרסמים, צביעה אימונוהיסטוכימית לאינסולין מראה שרוב התאים הם תאי בטא. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני ועדשת שמן 60 x, זהו אירועי אקסוציטוזה בודדים על ידי הופעה פתאומית של נקודה פלואורסצנטית קטנה. לבסוף, בתוכנת תמונת הסריקה, אשר את האירוע על ידי השלב העולה המהיר של האות הפלואורסצנטי מעל אזור עניין עבור עכבר מסוג wild type.בשימוש בפרוטוקול המוצג בסרטון זה, צפוי להתקבלו כ-200 eyelets. eyelets בריאים נראים בהירים, בעלי צורה עגולה וגבול חלק. לעומת זאת, סבב בידוד עם עיכול חסר כולל בדרך כלל eyelets קטנים ובעלי מראה מעורפל, וכן eyelets עם תאי asar צמודים אליהם.בעוד שסדרה שעברה עיכול יתר מראה פחות נקודות עיגון (eyelets) במבחן הדו-פוטון בתגובה לגירויים כגון גלוקוז או ריכוז גבוה של אשלגן, גרנולות אינסולין המתמזגות עם ממברנת הפלזמה גורמות לכך ש-SRB חודר אל הגרנולות, מה שמוביל להופעת נקודה פלורסצנטית פתאומית, בקוטר של כ-400 nanometers. במהלך הזמן שנמדד, כל אירועי האקסוציטוזה בתגובה לגירוי מזוהים, וכן מיקום האירועים, זמן ההופעה, המשך וסוג ההיתוך. אירועים כגון KISS ו-Run או היתוך מלא מאופיינים ומהווים ערך להערכת כל פגם בהיתוך הגרנולות במודלים של סוכרת מסוג 2.שיטה זו שימשה כדי להראות שהפגם באיים של עכברי DB DB סוכרתיים הוא אובדן המיזוג המלא של הגרנולות ולא שינוי בקינטיקה של מיזוג גרנולות בודדות. יתרה מכך, הגורם המשפיע ביותר על הירידה בהפרשת האינסולין במחלה הוא הפחתה במספר התאים המגיבים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של פרפוזיה של הלבלב והפעלה של איים מעכברי RDB, ותהיו מסוגלים לבצע את שני מבחני השפה להערכת התגובות ההפרשתיות בתוך איים שלמים.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה, אנו מתארים הדמיה תוך-חיונית של לבלב עכבר דרך חלון מיוצב להדמיה ארוכת טווח של דינמיקה תאית.

הדמיה תוך-חיונית: שיטה לתצפית ברמה התאית על לבלב העכבר דרך חלון הדמיה מיוצב

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת הדמיה לדמיין תאי בטא מושתלים המבטאים לוציפראז בעכבר שאינו סובל מהשמנת יתר. הכנסת טחול מעכבר סוכרתי מובילה להרס מתקדם של תאי בטא, המאושר חזותית על ידי ירידה בעוצמת האור לאחר החדרת המצע.

הדמיה של תאי בטא טרנסגניים בעכבר מדוכא חיסון המאותגר בטחול סוכרתי

גישה חדשה המשלבת השתלת תוך עיני ומיקרוסקופיה confocal מאפשרת הדמית אורכית, לא פולשנית בזמן אמת עם רזולוצית תא בודד בתוך רקמות...

השתלה ללשכה הקדמית של העין לאורך, לא פולשני<em&gt; בחי</em&gt; הדמיה ברזולוצית תא בודד בזמן אמת

אנו מתארים פרוטוקול עבור ויזואליזציה של אינסולין אקסוציטוזה ב איים שלמים באמצעות pHluorin, חלבון פלואורסצנטי ירוק pH-רגיש. איים מבודדים נגועים עם אדנו קידוד pHluorin מצמידים את שלפוחית מטען neuropeptide Y. דבר זה מאפשר הזיהוי של אינסולין גרגר פיוז'ן אירועים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור דימות וכימות הדינמיקה סידן באוכלוסיות תאים הטרוגנית, כגון תאים איון הלבלב. כתבים פלורסנט מועברים לתוך שכבת היקפי של תאים בתוך איון, אשר לאחר מכן מאויית והתמונה, ועל ניתוח לתאים של הדינמיקה של עוצמת הניאון מבוצעת.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.

אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית

מחקר זה מציג את היישום של פרוסות רקמת לבלב חי לחקר פיזיולוגיה של איון ואינטראקציות תא חיסוני איון.

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

In vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלבלב היה קל עם חלון הדמיה תוך וינטלית הלבלב.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

למדו בידוד איי לנגרהנס מעכברי Lepr Db לסוכרת מסוג 2 והדמיית פליטת אינסולין בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית שני-פוטון. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הפרשת האינסולין בתאי בטא בחיים.

Lepr

גלה סרטונים נוספים