Lepr
11 במאי 2015
אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג אילחקים (eyelets) חיים ובריאים מעכברים LEP R DB סוכרתיים, ולהעריך את הפרשת האינסולין מתאי בטא בתוך האילחקים באמצעות דימות פוטונים של תאים חיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ריאגנטים כגון תערובת האנזימים לעיכול הלבלב, מצעי תרבית לגידול האילחקים, והבופר החוץ-תאי לבדיקת הפוטונים הכפולים. לאחר מכן, פותחים את בטנו של עכבר שהורג (euthanized) ומזריקים את תערובת האנזימים לתוך הלבלב כדי לעכל את האיבר.
לאחר מכן, מפרידים את האיליטים (eyelets) מהעיכול הלבלבי ומגדלים אותם בתרבית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי לדמות היתוכים של גרגירי אינסולין בודדים מתאי בטא בתוך האיליט. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יעזור לחוקרים להבין כיצד נשלטת הפרשת האינסולין במצב בריאותי ובמצב מחלה.
השיפור המרכזי בטכניקת בידוד האיליים הוא השימוש באנזימים מעורבים לשיפור התוצאה וחיוניות האיליים. טכניקת דימוי הפוטון הכפול היא כעת השיטה היחידה להקלטת הפרשת אינסולין מתאים של תאים בתוך אילי שלם. כדי להכין את האנזימים לבידוד אילי הלבלב, השקף בקבוקון אחד של 5 mg של liase TL ב-26 ml של DM EM, והכן את ה-collagenase type four בבופר הנקס (Hank's buffer) בריכוז של 0.5 mg/ml, בתוספת של תמיסות ה-liase TL וה-collagenase המעורבות הבאות.
ביחס של ארבעה לאחד לפי נפח, חלק את תערובת האנזימים למכסות של 2.5 milliliters כל אחת ואחסן בטמפרטורה של negative 20 degrees Celsius. להכנת מצע בידוד RPMI, בתוך מבחנה קונית גדולה המכילה ליטר אחד של מים, המס בקטורת אחת של אבקת RPMI 1 6 4 0 בטמפרטורת החדר והוסף שני גרם של sodium bicarbonate ו-4.02 גרם של HEPES. השתמש ב-sodium hydroxide כדי לכוון את ה-pH ל-7.4, לאחר מכן סנן, סטריליז וסנן, ואחסן בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.
הכינו מצע גידול RPMI על ידי הוספת 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה למצע בידוד RPMI עבור דימות פוטונים כפולים. הכינו באפר חוץ-תאי עשיר בנתרן עם הרכיבים הבאים. להכנת צבע חוץ-תאי, הכינו תמיסת סטוק של SRB בריכוז שמונה מילימולר, חלקו את הבאפר החוץ-תאי למבחנות קטנות ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.
כדי להגיע לריכוז עבודה, השתמש בבפר חוץ-תאי (extracellular buffer) טרי כדי לדלל את מלאי ה-SRB ביחס של 1:10. לאחר הקרבת העכבר וריסוס יסודי של גופו ב-70% ethanol בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מקם את בעל החיים כאשר הראש פונה לכיוון המנתח והזנב הרחק ממנו. בצע שני חיתוכים צדיים ארוכים דרך עור הבטן והפריטונאום כדי ליצור פתח בצורת V.
משכו את מקרי העור כלפי מעלה כדי לחשוף את כל חלל הבטן. הזיזו הצידה את המעיים, ובאמצעות הרקמה המקופלת, החזיקו את הכבד במקומו כדי לחשוף את תעלת המרה המשותפת. לאחר מכן, הצמידו תסביך כלי דם (vascular clamp) באמבולה על דופן התריסריון כדי למנוע מהאנזימים המוזרקים להיכנס לתריסריון.
זהו שלב חשוב הקובע אם האנזימים הלבלביים יחדרו אל רפלקס תעלת הלבלב, אל אתר ההזרקה או אל התריסריון. השתמש במחט בכילור (gauge) 31 כדי לבצע קנולציה של צינור המרה המשותף בקרבת נקודת החיבור של צינור הכבד המשותף וצינור כיס המרה, והשאר מקום להזרקה שנייה. אם הלבלב אינו מרווי (perfuse) בפעם הראשונה, הזריק באיטיות כ-two milliliters של תערובת אנזימים קרה אל צינור המרה המשותף של העכבר.
אם התסמיך נמצא במיקום הנכון, הלבלב יעבור פרפוזיה מהירה. ברגע שהלבלב עבר פרפוזיה, הוצא את האיבר במהירות, הנח אותו בתוך מבחנה מזכוכית והדגר אותו במקלחת מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כ-19 דקות. לאחר ההדגרה, עצור את תהליך העיכול על ידי הוספה של כ-20 milliliters של מדיום בידוד קר.
נער את המבחנה בעדינות כדי לפרק את הלבלב ושפוך אותה דרך נפה T סטנדרטית עם גודל נקבים של 1 mm לתוך מבחנה סטרילית של 50 mL. השתמש במדיום הבידוד כדי למלא את המבחנה עד למעלה וסבב בצנטריפוגה ב-400 G ובטמפרטורה של 4°C למשך דקה אחת. כאשר הצנטריפוגה נעצרת, הוסף מדיום בידוד למשקע והמס אותו.
לאחר מכן, העבירו את התרחופה לשתי פרוטות של 15 מיליליטר וסבבו שנית. לאחר שאיבת העל-נוזל, הוסיפו שש מיליליטרים של מדיום להפרדת תאים במדרג צפיפות לכל פרוטה, וערבבו באמצעות פיפטה או וורטקס לשחזור התרחופה. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות מצד הפרוטות כשישה מיליליטרים של מדיום בידוד מעל המדיום להפרדת תאים במדרג צפיפות, וסבבו בצנטריפוגה ב-100 G ובטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
עם ההפרדה, אספו את השכבות העליונה, האמצעית והתחתונה לשלוש צלחות נפרדות. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמשו בפיפטה כדי לבחור ידנית את ה-eyelets משלוש הצלחות. רובם יימצאו בשכבה האמצעית, כדי לסייע ל-eyelets להתאושש מעיכול האנזימים.
הכינו קבוצות של 40 איילטים (eyelets) בצלחות פטרי של 25 סנטימטר עם שישה מיליליטר של מצע גידול RPMI המכיל 10 millimolar גלוקוז, וגודלו במשך יומיים. החליפו את המצע מדי יום כדי לבצע דימות פוטון כפול כבדיקה עקיפה למדידת הפרשת אינסולין. התחילו בשימוש ב-three millimolar גלוקוז בבופר חוץ-תאי כדי להדגיר מראש את האיילטים שגודלו במשך יומיים.
במשך 30 דקות, מרחו גריז עלבמת המיקרוסקופ כדי למנוע דליפה של התמיסה, והתקינו עלבמת המיקרוסקופ תא בקרת טמפרטורה המכיל סלייד זכוכית. לאחר מכן, כסו את התא ב-500 µL של באפר חוץ-תאי המכיל 0.8 mM SRB וריכוזים שונים של גלוקוז. לאחר מכן, הניחו את ה-eyelet שעבר אינקובציה מוקדמת במרכז התא ובצעו פוקוס לעומק של שלושה עד ארבעה שכבות תאים בתוך ה-eyelet.
באיים של מכרסמים, צביעה אימונוהיסטוכימית לאינסולין מראה שרוב התאים הם תאי בטא. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני ועדשת שמן 60 x, זהו אירועי אקסוציטוזה בודדים על ידי הופעה פתאומית של נקודה פלואורסצנטית קטנה. לבסוף, בתוכנת תמונת הסריקה, אשר את האירוע על ידי השלב העולה המהיר של האות הפלואורסצנטי מעל אזור עניין עבור עכבר מסוג wild type.
בשימוש בפרוטוקול המוצג בסרטון זה, צפוי להתקבלו כ-200 eyelets. eyelets בריאים נראים בהירים, בעלי צורה עגולה וגבול חלק. לעומת זאת, סבב בידוד עם עיכול חסר כולל בדרך כלל eyelets קטנים ובעלי מראה מעורפל, וכן eyelets עם תאי asar צמודים אליהם.
בעוד שסדרה שעברה עיכול יתר מראה פחות נקודות עיגון (eyelets) במבחן הדו-פוטון בתגובה לגירויים כגון גלוקוז או ריכוז גבוה של אשלגן, גרנולות אינסולין המתמזגות עם ממברנת הפלזמה גורמות לכך ש-SRB חודר אל הגרנולות, מה שמוביל להופעת נקודה פלורסצנטית פתאומית, בקוטר של כ-400 nanometers. במהלך הזמן שנמדד, כל אירועי האקסוציטוזה בתגובה לגירוי מזוהים, וכן מיקום האירועים, זמן ההופעה, המשך וסוג ההיתוך. אירועים כגון KISS ו-Run או היתוך מלא מאופיינים ומהווים ערך להערכת כל פגם בהיתוך הגרנולות במודלים של סוכרת מסוג 2.
שיטה זו שימשה כדי להראות שהפגם באיים של עכברי DB DB סוכרתיים הוא אובדן המיזוג המלא של הגרנולות ולא שינוי בקינטיקה של מיזוג גרנולות בודדות. יתרה מכך, הגורם המשפיע ביותר על הירידה בהפרשת האינסולין במחלה הוא הפחתה במספר התאים המגיבים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של פרפוזיה של הלבלב והפעלה של איים מעכברי RDB, ותהיו מסוגלים לבצע את שני מבחני השפה להערכת התגובות ההפרשתיות בתוך איים שלמים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את בידוד האיים מהמודל של עכברי Lepr db לסוכרת מסוג 2 ואסיי של תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצב
- אנדוקרינולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- סוכרת מסוג 2 מאופיינת בהפרשה לקויה של אינסולין.
- איורי לנגרהנס הם קריטיים לייצור אינסולין.
- מיקרוסקופיית דו-פוטון מאפשרת דימוי מפורט של תהליכים תאיים.
- הבנת מנגנוני הפרשת האינסולין חיונית למחקר הסוכרת.
מטרת המחקר
- בידוד איים לבלביים חיוניים מעכברים סוכרתיים.
- הערכת הפרשת אינסולין מתאי בטא בתוך האיים הלבלביים.
- שימוש בטכניקות דימוי מתקדמות לניתוח בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תערובת אנזימים לעיכול הלבלב.
- הזרקת האנזים ללבלב של עכברים שעברו הרדמה וקטילה (euthanized).
- הפרדה וגידול של איים (islets) מתוך תוצרי עיכול הלבלב.
- שימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית לדימוי של היתוכי גרנולות אינסולין.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של איים חיים מעכברי Lepr db.
- דימוי יעיל של אירועי הפרשת אינסולין בזמן אמת.
- תובנות לגבי הבקרה של שחרור אינסולין מתאי בטא.
- השלכות פוטנציאליות להבנת הפתולוגיה של סוכרת.
מסקנות
- פרוטוקול זה מעמיק את ההבנה של מנגנוני הפרשת האינסולין.
- הוא מהווה כלי בעל ערך למחקר על סוכרת.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלה כדי לבחון אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה ישירה של אירועי היתוך של גרנולות אינסולין באיי לבלבל שלמים מדגם העכברים Leprdb של סוכרת סוג 2, ובכך מספק קריאה תפקודית של קיבולת ההפרשה של תאי בטא. על ידי שילוב של בידוד אנזימטי של איי הלבלבל עם דימיון דו-פוטוני של תאים חיים, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית של מטרות טיפוליות המעורבות באקסוציטוזה של אינסולין. גישה זו מספקת נתונים כמותיים של אירועים בודדים שיכולים לסייע בתיקוף מטרות ובהערכה פרה-קלינית של תרכובות המודולות הפרשת אינסולין.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את ההשערה כי מיזוג גרנולות חלקי פגום תורם להפרעה בהפרשת אינסולין במודלים של סוכרת.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבחנה בין פגמים קינטיים לבין אובדן של תאי בטא מגיבים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי תרכובות על ידי זיהוי תרכובות המשחזרות אירועי מיזוג מלאים באיים של Leprdb.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר איים ולידדתיים, חיוניים ומאומתים המתאימים לבדיקת תרכובות בהמשך, במסגרת בדיקת הפרשה בגירוי גלוקוז.
- פלט כמותי: מייצר פרמטרים מדידים של אירועי אקזוציטוזה (תדירות, משך, מיקום) כמדדים תפקודיים עבור קמפיינים של סריקה.
- שחזוריות: נהלי בידוד והדמיה סטנדרטיים מאפשרים הפקה עקבית של נתונים בין ניסויים ומעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: משתמש במודל Leprdb, המשחזר מאפיינים מרכזיים של סוכרת סוג 2 בבני אדם, כולל תפקוד לקוי של תאי בטא.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי לבין הערכה פרה-קלינית של ממריצי הפרשת אינסולין או מחזקים לרגישות לאינסולין.
- קבלת החלטות מותאמת סיכון: מספק נתוני ביומרקרים פונקציונליים (שכיחות אירועי היתוך) להנחיית החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בפיתוח פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף שבין גילוי פריצות למחקרים פרה-קליניים, שבו איי לבלב מבודדים משמשים כמערכת רלוונטית למחלה להערכת השפעות של תרכובות על הפרשת אינסולין לפני ביצוע מחקרים in vivo.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מנגנוני אקסוציטוזה של אינסולין ובבירור מסלולים בתאי בטא סוכרתיים.
- סריקה: מספק איים מוכנים לבדיקה עם חיוניות ותגובתיות סטנדרטיות לסריקת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קריאות כמותיות מבוססות אירועים (למשל, שכיחות של מיזוג מלא) המאפשרות השוואה בין תנאים גנטיים או תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר פנוטיפים הפרשתיים in vitro ליעילות פרה-קלינית על ידי מידול פגמים בתאי בטא סוכרתיים אנושיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת הפרשת אינסולין במגוון מודלים של סוכרת ובשיטות טיפוליות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור מנגנונים מולקולריים לתוצאות הפרשה פונקציונליות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרפוזיה סטנדרטית של אנזימים, טיהור במדרג צפיפות ופרמטרי דימוי.
- ערך אסטרטגי: מפחית נשירה בשלבים מאוחרים על ידי זיהוי פגמי הפרשה בשלב מוקדם של תהליך הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על יכולתן לשחזר היתוך גרנולות מלא באיי לבלב סוכרתיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח עכברים, פרפוזיה של הלבלב ודיסוציאציה אנזימטית של רקמות.
- תלוי בגישה למיקרוסקופ דו-פוטוני עם אורכי גל עירור ומסנני פליטה מתאימים לזיהוי צבע SRB.
- מחייב הרכב סטנדרטי של באפר חוץ-תאי ופרוטוקולי גירוי גלוקוז להשגת תגובות גירוי עקביות.
- כולל אופטימיזציה של יחסי תערובת האנזימים וזמני אינקובציה כדי לאזן בין תבואת האיים לבין חיוניותם השונות בין הגנוטיפים.
- מוגבל על ידי המורכבות הטכנית של שמירת שלמות האיים במהלך ההדמיה והצורך במפעילים מיומנים לזיהוי אירועי התאחות.
