סנכרון של Caulobacter crescentus לחקירה של מחזור תא החיידק
8 באפריל 2015
סנכרון של תאי חיידקים חיוני למחקר על מחזור התא החיידקי והתפתחותו. Caulobacter crescentus ניתן לסנכרון באמצעות צנטריפוגה בצפיפות המאפשרת כלי מהיר ורב עוצמה לחקר מחזור התא החיידקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לסנכרון תאי Caulobacter.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי נחיל Coob backer על מנת ליצור תרבית תאים מסונכרנת. זה מושג תחילה על ידי גידול תרבית מעורבת של תאי גיבוי coob, ולאחר מכן עצירת הצמיחה לזמן קצר על ידי Resus המשהה את התאים במדיום קר. השלב השני הוא להפריד את תאי הנחיל באמצעות צנטריפוגה בצפיפות דיפרנציאלית.
השלב הבא הוא להשעות מחדש את תאי הנחיל בתווך חם, המאפשר לתאים להיכנס למחזור התא. לבסוף, ניתן לעקוב אחר תאי הנחיל המבודדים לאורך כל מחזור התא באמצעות בדיקות ביוכימיות או מיקרוסקופיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו מכונת תאי התינוק, הוא שניתן לבודד תאים במהירות ולהגדיל כמויות מספיקות למחקרים ביוכימיים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון מה שולט בהפרדת הכרומוזומים ובמחזור חלוקת התא הא-סימטרי. כדי להתחיל לחסן חמישה מיליליטר של מדיום PYE בחיידקים מצלחת של זן CSIS של תומכי קולו, NA 1000. מגדלים את התרבות בן לילה ב -28 מעלות צלזיוס עם ניעור למחרת, מעבירים 0.5 מיליליטר מתרבית הלילה לבקבוק המכיל 25 מיליליטר של מדיום M שני G, ומנערים את הבקבוק ב -28 מעלות צלזיוס עד שהתרבות מגיעה לצפיפות אופטית בין 0.5 ל -0.6.
לאחר מכן, יש לדלל את התרבות לליטר אחד של מדיום M שני G כדי להשיג את הצפיפות האופטית ההתחלתית הרצויה ולנער את הבקבוק ב -28 מעלות צלזיוס כאשר הצפיפות האופטית של התרבות מגיעה ל -0.5 פיפטה מיקרוליטר אחד של התרבות על שקופית, ולאחר מכן לכסות את הנוזל בהחלקת כיסוי. דמיין את התאים במיקרוסקופ פאזה כדי לאשר את נוכחותם של תאי נחיל שוחים במהירות. העבירו את התרבית לצינור צנטריפוגה סטרילי ואז סובבו את התאים בטמפרטורה של 7,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, השליכו את התאים הגלולים באופן רופף בעת שפיכת הסופרנטנט והוסיפו 180 מיליליטר M קר שני מדיום. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להשעות בעדינות את התאים. לאחר מכן הוסיפו 60 מיליליטר של תמיסת סיליקה קולואידית קרה לתרחיף התאים וערבבו היטב.
שופכים את תרחיף התאים לשמונה צינורות של 30 מיליליטר וצנטריפוגה אותם בטמפרטורה של 6, 400 פעמים G למשך 30 דקות. הגדר ארבע מעלות צלזיוס. הסר בעדינות את הצינורות מהצנטריפוגה ובדוק אם יש שתי רצועות נפרדות בצינור.
הרצועה התחתונה מכילה את תאי הנחיל ותאי טרום החלוקה נמצאים ברצועה העליונה. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הרצועה העליונה ואת הנוזל עד כסנטימטר אחד מעל הרצועה התחתונה. השתמש בפיפטה פסטר כדי להסיר את רצועת הנחיל ולהעביר אותה לצינור נקי.
מלאו את הצינור ב-M קר שני בינוניים ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור כדי לשטוף את הסיליקה הקולואידית. לאחר מכן, השליכו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב -20 מיליליטר של צנטריפוגה קרה. שוב כדי לגלול את התאים, השעו מחדש את הכדורים ב -30 מיליליטר של M קר שני מדיום, ואז מדוד את הצפיפות האופטית של המתלה.
הנח מיקרוליטר אחד של תרחיף התא על שקופית מיקרוסקופ והשתמש בהדמיית פאזה כדי לבדוק אם יש תאי נחיל. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים והשעויה אותם מחדש במדיום M שני G לצפיפות אופטית בין 0.3 ל-0.4. דגרו את התרבות עם טלטול ב-28 מעלות צלזיוס עבור מבחני עלילה מערבית או ביטוי גנים.
הסר מינון מיליליטר אחד כל 10 עד 30 דקות למשך כ-140 דקות עד שהצפיפות האופטית של התרבית מוכפלת. השתמש בצנטריפוגה שולחנית כדי לסובב את התאים למשך 30 שניות ולאחר מכן שאב במהירות את ההבזק הבינוני. הקפיאו את כדורי התא בחנקן נוזלי ואחסנו אותם בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לסנכרון בקנה מידה קטן, חסנו חמישה מיליליטר של מדיום M שני G עם תאי NA 1000 וגידלו את התאים למשך הלילה עם טלטול ב-28 מעלות צלזיוס למחרת.
מדללים את התרבית ב -15 מיליליטר של מדיום M שני G ומגדלים את התאים עד שהצפיפות האופטית היא בין 0.5 ל -0.6. צנטריפוגה את התאים ואז השעו אותם מחדש במיליליטר אחד של קר M שני מדיום. העבירו את התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר, גלולו את התאים על ידי צנטריפוגה ושאבו את ה-sup natant.
לאחר מכן הנח את הצינור על קרח והשהה מחדש את כדור התא ב-900 מיקרוליטר של M קר שני בינוני. לאחר מכן, הוסף 900 מיקרוליטר של סיליקה קולואידית מצופה PVP קרה, וצנטריפוגה את הצינור למשך 20 דקות. שאפו בזהירות את רצועת התאים העליונה לפני החלוקה ולאחר מכן אספו את רצועת הנחיל התחתונה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חדש.
שטפו את תאי הנחיל פעמיים במיליליטר אחד של M קר שני בינוני תוך צנטריפוגה במשך שלוש דקות בין כל שטיפה ממש לפני הסיבוב האחרון. הנח את תרחיף התאים במבחנה זכוכית מקוררת מראש של מיליליטר אחד ומדוד את הצפיפות האופטית של התאים. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור מיקרו פוגה וצנטריפוגה לאחר צנטריפוזיה.
ריס, השעו את כדור התא הסופי במדיום Prewarm M 2 G בצפיפות אופטית בין 0.3 ל-0.4 ונערו את התאים ב-28 מעלות צלזיוס. אם יש צורך במיקרוסקופיה, הנח מיקרוליטר אחד של התרבית על כרית אירוס M two G בנקודות הזמן המתאימות. צנטריפוגה בצפיפות דיפרנציאלית של תרבית אסינכרונית מניבה שתי רצועות תאים.
הרצועה התחתונה מכילה תאים נחילים, בעלי צפיפות גבוהה יותר, והרצועה העליונה מכילה תאים מלאים וטרום חלוקה, בעלי צפיפות נמוכה יותר. הצפיפות האופטית של התרבית גדלה בערך פי שניים במהלך מחזור התא. במהלך תקופה זו, תאי נחיל מתמיינים לתאים מאוחסנים, תאים מאוחסנים ואז משתכפלים ועוברים חלוקת תאים אסימטרית.
כאשר כל חלוקה מניבה תא נחיל חדש ותא האב המלאי, כתם מערבי לווסת הראשי של מחזור התא CTRA הוא בקרה שימושית לאימות סנכרון, CTRA חוסם את שכפול ה-DNA בתאי נחיל ומתפרק עם שכפול ה-DNA. לאחר מכן CTRA מסונתז מאוחר יותר במחזור התא ומונע התחלה מחודשת של שכפול DNA ומפעיל שעתוק של גנים התפתחותיים רבים. דפוס מתנודד זה של רמות חלבון CTRA מעיד על סנכרון מוצלח.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לסנכרן תאי קריאה חוזרת או NA 1000 כדי לחקור את מחזור התא החיידקי. הליך סנכרון תאים זה יכול להיעשות תוך שעה עד שעתיים אם הוא מבוצע כהלכה. בזמן ביצוע הליך זה חשוב לזכור לעבוד במהירות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לסנכרון של תאי Caulobacter crescentus, פעולה שהיא קריטית לחקר מחזור התא הבקטריאלי. השיטה כוללת בידוד של תאי swarmer באמצעות סבוב צנטריפוגי לפי צפיפות, דבר המאפשר לחוקרים לעקוב אחר תאים אלו לאורך תהליך התפתחותם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מחזור התא הבקטריאלי
רקע
- סנכרון של תאי חיידקים הוא חיוני לצורך ביצוע מחקרים מדויקים.
- ניתן לסנכרן את *Caulobacter crescentus* באמצעות סנטריפוגציה בצפיפות.
- שיטה זו מספקת כלי מהיר לחקר התפתחות חיידקים.
- הבנת מחזור התא חיונית ליישומים שונים במחקר ביולוגי.
מטרת המחקר
- להקמת תרבית מסונכרנת של תאי swarmer של Caulobacter crescentus.
- להקל על ביצוע בדיקות ביוכימיות ומחקרי מיקרוסקופיה.
- לשפר שיטות קיימות לבידוד תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של תרבית מעורבת של תאי Caulobacter.
- עצירת הגדילה על ידי תליה מחדש של התאים במצע קר.
- הפרדה של תאי swarmer באמצעות סנטריפוגציה בצפיפות דיפרנציאלית.
- תליה מחדש של תאי swarmer מבודדים במצע חם להפעלת מחזור התא.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי swarmer לצורך תרבית מסונכרנת.
- יכולת מעקב אחר תאים לאורך כל מחזור התא באמצעות טכניקות שונות.
- הדגמת היתרונות של שיטה זו על פני טכניקות מסורתיות.
- אספקת פרוטוקול מפורט למחקרים לשם שחזור המחקר.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סנכרון יעיל של Caulobacter crescentus.
- שיטה זו משפרת את חקר מחזורי התא הבקטריאליים.
- היא מספקת כלי בעל ערך למחקרים ביוכימיים ומחקרי מיקרוסקופיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סנכרון של Caulobacter crescentus מאפשר ניתוח זמני מדויק של אירועים במחזור התא הבקטריאלי, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף של מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מספקת מערכות ביולוגיות בעלות רמת ביטחון גבוהה וניתנות לשחזור לצורך ניתוח רשתות בקרה ודינמיקה של חלבונים הרלוונטיים לצמיחה ולחלוקה בקטריאלית. יכולת ההרחבה של השיטה והתוצרים הכמותיים שלה ממצבים אותה כפלטפורמה רב-פעמית למחקרי מחזור תא בקטריאליים בפריסה רחבה על פני פורטפוליו של מחקרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולי בקרה של מחזור התא ותפקוד חלבונים באוכלוסיות מסונכרנות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מתן אפשרות להפרעה מבוקרת ומדידה של אירועי מחזור התא.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת הרצף והתלות של אירועים מולקולריים.
- מספק ביטחון חיזוי למחקרי צמיחה וחלוקה בקטריאלית המשכיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- יוצר אוכלוסיות תאים מסונכרנות ומאומתות עבור בדיקות ביוכימיות כמותיות ומיקרוסקופיה.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה על ידי מזעור השונות הביולוגית במצב מחזור התא.
- מאפשר סטנדרטיזציה של מדדים כגון תנודות חלבונים (למשל, CTRA) וסמני חלוקת תאים.
- מכין מערכות ביולוגיות חסונות עבור סריקת תרכובות או מחקרי הפרעה גנטית.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מקשר בין מודלים של מחזור התא הבקטריאלי לבין מחקר תרגומי על חלוקת תאים ושכפול הגנום.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות אנטי-בקטריאליות.
- מספקת פלטפורמה לקידום מותאם-סיכון של התערבויות מווסתות מחזור תא.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה עבור אסטרטגיות לעיכוב צמיחה בקטריאלית.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
פרוטוקול סנכרון זה משתלב בממשק שבין הגילוי המוקדם לפיתוח הבדיקה, ובכך מאפשר מחקרים מונחי-השערה על ויסות מחזור התא החיידקי ותומך בזיהוי מולקולות מובילות (lead identification) למחקר אנטי-בקטריאלי.
- ביולוגיה של התגליות: מקל על בדיקת השערת האפס והבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד של שלבים ספציפיים במחזור התא.
- סריקה: מספק אוכלוסיות מסונכרנות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות כמותיות ומוכנות לסריקה.
- אנליטיקה: מספק פלטים מדידים, כגון תנודות של חלבונים ותזמון של חלוקת תאים, לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין תובנות מכניסטיות למודלים פרה-קליניים של צמיחה וחלוקה חיידקית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה סטנדרטי וניתן להרחבה לשימוש חוזר במחקרי מחזור תא חיידקיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחזור התא הבקטריאלי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של הכנות תאים מסונכרנים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לתיקוף יעדים (target validation) חסון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של יעדים אנטי-בקטריאליים ואסטרטגיות לוויסות מחזור התא.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרבית חיידקים, סנטריפוגציה בצפיפות ותכנון בדיקות כמותיות.
- נדרשת גישה לציוד סנטריפוגה, מיקרוסקופיה ופלטפורמות אנליטיות לניתוח ביטוי חלבונים וגנים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי סנכרון ובדיקה לצורך הדירות.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור זני חיידקים או מערכות מודל שונות.
- ביצוע מהיר הוא קריטי לשמירה על סנכרון ולצמצום השונות הביולוגית.
