Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'ל פולי אקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. זה מושג על ידי סנדוויץ' ראשון, תמיסת מבשר הג'ל בין לוח זכוכית מצופה הידרופובי לתומך פלסטיק גמיש דבק אקרילאמיד. השלב השני הוא לקלף את הג'ל מצלחת הזכוכית, שנצמדה קוולנטית לתמיכת הפלסטיק הגמישה בעת הפילמור ולתת לה להתייבש.

לאחר מכן, הג'ל היבש ותמיכת הפלסטיק הגמישה הבסיסית נחתכים לצורות רצויות ומודבקים בצד הפלסטיק כלפי מטה לתחתית הבאר של צלחת מרובת בארות או כל כלי תרבית תאים אחר. השלב האחרון הוא ציפוי ג'לי הפולי אקרילאמיד המורכבים בצלחת מרובת בארות בציפוי דבק תאים, כגון שכבה חד-שכבתית של קולגן מסוג אחד. בסופו של דבר נעשה שימוש במיקרוסקופיה, כמו גם בטכניקות אחרות לאפיון תאים כדי להתבונן בהשפעת מצע הפולי אקרילאמיד הבסיסי.

בפרט, הנוקשות שלו על התנהגויות התאים. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני השיטות הקיימות הוא המאפשר טיפול בכל קשיחות ועובי של פולי ג'ל וכן הרכבתם בפורמט צלחת מרובת בארות, בעלות נמוכה וחסכונית בזמן, שאינה ניתנת בשיטות אחרות. הדגמת ההליך תיעשה כסטודנטית במעבדה שלי.

ראשית, הכינו את תמיסת מבשר הג'ל פולי אקרילאמיד על ידי ערבוב אקרילאמיד, ה-crosslinker bis acrylamide, ומים נטולי יונים ממיסים Sul OPA בדימתיל סולפוקס ב-50 מיליגרם למיליליטר. Aliquot 20 מיקרוליטר מתמיסת המלאי לתוך 10 צינורות מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן הבזק, הקפיאו את התמיסות בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, ממיסים אמוניום לכל סולפט במים נטולי יונים כדי להשיג ריכוז אמוניום סופי לסולפט של 10% משקל בנפח. Eloqua 25 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום לסולפט לתוך 10 צינורות מיקרו צנטריפוגה, ואחסן אותו שלילי 20 מעלות צלזיוס. הכן 0.2 מיליגרם למיליליטר של תמיסת קולגן על ידי דילול תמיסת קולגן מסוג אחד ב-XPBS אחד ב-pH 7.4.

כל התמיסות נשמרות על קרח עד לשימוש. בשלב זה, הניחו כמה טיפות של תמיסה הידרופובית על צלחת זכוכית והשתמשו בנייר טישו כדי להתפשט על פני השטח. לאחר שאפשרת לצלחת להתייבש באוויר, נגב שוב עם נייר טישו כדי ליישר את הציפוי ההידרופובי.

חותכים תומך פלסטיק גמיש כך שיתאים לגודל צלחת הזכוכית המצופה הידרופובי. לאחר מכן סמן את הצד ההידרופובי של תומך הפלסטיק הגמיש על ידי גירוד קל של פני השטח בעזרת כלי חד כגון אזמל. להכנת הג'ל הוסף 4972.5 מיקרוליטר של תמיסת מבשר פולי אקרילאמיד בריכוז הסופי הרצוי לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

הנח את הצינור בתא הסרת גז למשך 30 דקות כשהמכסה פתוח. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום לסולפט שהוכנה קודם לכן לתמיסת הג'ל של DGAs כדי להשיג ריכוז אמוניום סופי לסולפט של 0.05% ואז הוסף 2.5 מיקרוליטר של TM me כדי להשיג ריכוז TM ME סופי של 0.5% ערבב את התמיסה בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. לאחר מכן, הנח מרווחי סיליקון בעובי הרצוי על הצד ההידרופילי של תומך הפלסטיק הגמיש.

לאחר מכן פיפטה את תמיסת הג'ל על תומך הפלסטיק הגמיש בין המרווחים והכריך עם תאורת שקופית זכוכית מצופה הידרופובי. לאחר מתן אפשרות לג'ל להתפלמר במשך 45 דקות, יש לקלף את תומך הפלסטיק הגמיש עם ג'ל הפולי אקרילאמיד המחובר לקוולנטית מלמעלה ולהניח את צד הג'ל כלפי מעלה לייבוש באוויר. לאחר הייבוש, חותכים את ג'ל הפולי אקרילאמיד לצורות הרצויות.

הכן כ -500 מיקרוליטר פולימתיל סואן לכל צלחת 96 באר על פי הוראות היצרן להדביק את הג'לים לתחתית צלחת מרובת בארות. הניחו טיפה קטנה של פולימתיל סואן במרכז כל באר בעזרת מלקחיים. הניחו ג'ל פולי אקרילאמיד אחד בכל צד תומך פלסטיק גמיש כלפי מטה.

לאחר ריפוי הפולי דימתיל סובוקסן, מניחים כמות קטנה של סמפה התאית שהוכנה בעבר בכל באר בעזרת פיפטת העברה ומערבבים מצד לצד כדי לצפות את משטח הג'ל באופן שווה. הניחו את צלחת הבאר מתחת למנורת UV בעוצמה גבוהה למשך חמש דקות. בסיום, שטפו את הג'לים עם PBS כדי להסיר עודפי צ'לו.

בעקבות פיפטה זו, כ -50 מיקרוליטר של הקולגן שהוכן בעבר הקלד תמיסה אחת לכל אחד. ובכן, השאירו את הצלחת מכוסה בטמפרטורת החדר לפחות שעתיים לאחר השטיפה עם PBS כדי להסיר עודפי תמיסת קולגן. עקרו את הג'לים תחת אור UV במכסה המנוע של תרבית רקמות למשך שעתיים.

לבסוף משרים את הג'לים במדיום שלם למשך הלילה כדי להעניק לחות ולאזן אותם. השתמש בג'לים לישיבה סלולרית באופן מיידי או אחסן במקרר עד יומיים מודול יאנג כפונקציה של מספר אקרילאמיד וביס. ריכוזי אקרילאמיד המסומנים כ-A ו-B בהתאמה מוצגים כאן כצפוי.

גם מודול האחסון G ראשוני וגם מודול ההפסד G כפול ראשוני אינם תלויים בתדר. כמו כן, אושר כי ייבוש ולאחר מכן החזרת לחות הג'לים לא השפיעו על המודול של הצאצאים שלהם. על ידי שימוש ב-Crosslinker Sulo sampa, ניתן להשיג ציפוי קולגן אחיד על הידרוג'לים בכל קשיחות.

נצפה כי כאשר נזרעו על ג'ל פולי אקרילאמיד במשך 24 שעות, סרטן השד M-D-A-M-B 2 31 תאים נשארו עגולים על ג'ל הפסקל הרך של 0.5 וקילו, אך הצליחו להתפשט ולהתארך על ג'ל הפסקל הנוקשה של 100 קילו. בנוסף, הידרוג'לים המיוצרים על גבי תומך הפלסטיק הגמיש הם שקופים ומאפשרים הדמיה ומיקרוסקופיה קלות. יתר על כן, תומך הפלסטיק הגמיש אינו פלואורסצנטי אוטומטי ולכן אינו מפריע להדמיה של תאים המסומנים בפלואורסצנט.

מורפולוגיה של התא כומתה עוד יותר במונחים של שטח התפשטות התא הכולל ומעגליות התא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב באיזו יעילות וזול להרכיב ג'לים פוליאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. לחקר ביולוגיה של תאים תלויי נוקשות.