Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפשר הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לי poly acrylamide בפורמט של פלטה רב-בארים. דבר זה מושג תחילה על ידי דחיסת תמיסת הפרקורסור של הג'ל בין פלטת זכוכית מצופה בחומר הידרופובי לבין תמיכה פלסטית גמישה דביקה של acrylamide. השלב השני הוא קילוף הג'ל מפלטת הזכוכית, לאחר שנצמד אליה באופן קוולנטי לתמיכה הפלסטית הגמישה בעקבות הפולימריזציה, והשארתו לייבוש.

בשלב הבא, הג'ל היבש ותמיכת הפלסטיק הגמישה שמתחתיו נגזרים לצורות הרצויות ומודבקים בצד הפלסטיק כלפי מטה לתחתית הבארות של פלטת ריבוי בארות או לכל כלי אחר לתרבית תאים. השלב הסופי הוא ציפוי ג'לי הפוליאקרילאמיד שהורכבו בפלטת ריבוי הבארות בשכבת דבק לתאים, כגון שכבה אחת של קולגן מסוג one. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה, כמו גם בטכניקות אחרות לאפיון תאים, כדי לבחון את ההשפעה של מצע הפוליאקרילאמיד שמתחתם.

בפרט, השפעת הקשיחות שלו על התנהגויות תאים. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת טיפול בכל רמת קשיחות ועובי של ג'לי פולימרים, וכן את הרכבתם בפורמט של פלטת רב-בארות, באופן חסכוני וביעיל מבחינת זמן, דבר שאינו ניתן בשיטות אחרות. הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי סטודנט במעבדתי.

ראשית, הכינו את תמיסת המקדם של ג'ל פולי-אקרילאמיד על ידי ערבוב של אקרילאמיד, חומר הקישור ביס-אקרילאמיד ומים דאיוניזיים. המסו Sul OPA ב-dimethyl sulfox בריכוז של 50 mg/mL. העבירו מנות של 20 µL מתמיס הסטוק ל-10 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, בצעו הקפאה מהירה (flash freeze) של התמיסות בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80°C-.

בשלב הבא, המיסו ammonium per sulfate במים דאיוניים כדי להגיע לריכוז סופי של ammonium per sulfate של 10% weight by volume. העבירו 25 µL של תמיסת ה-ammonium per sulfate ל-10 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה, ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20°C-.

את כל התמיסות יש לשמור על קרח עד לשימוש. בשלב זה, טפטפו מספר טיפות של תמיסה הידרופובית על פלטת זכוכית והשתמשו בנייר סופג כדי לפרוס אותן על פני השטח. לאחר שהפלטה תתייבש באוויר, נגבו אותה שוב בנייר סופג כדי להבטיח שהציפוי ההידרופובי יהיה אחיד.

גזרו תמיכת פלסטיק גמישה כך שתתאים לגודלו של לוח הזכוכית בעל הציפוי ההידרופובי. לאחר מכן, סמנו את הצד ההידרופובי של תמיכת הפלסטיק הגמישה על ידי שריטה קלה של הפני השטח באמצעות כלי חד, כגון סקלפל. להכנת הג'ל, הוסיפו 4972.5 µL של תמיסת קדם-פוליאקרילאמיד בריכוז הסופי הרצוי לתוך מבחנה קונית של 50 mL.

הנח את המבחנה בתא ניקוי גזים למשך 30 דקות כאשר הפקח פתוח. לאחר מכן, הוסף 25 µL של תמיסת האמוןיום פרסולפט שהוכנה מראש לתמיסת ג'ל ה-DGAs כדי להשיג ריכוז סופי של אמוןיום פרסולפט של 0.05%. לאחר מכן, הוסף 2.5 µL של TM me כדי להשיג ריכוז סופי של TM ME של 0.5%. ערבב את התמיסה בעדינות באמצעות פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. לאחר מכן, הנח ספייסרים של סיליקון בעובי הרצוי על הצד ההידרופילי של התמיכה הפלסטית הגמישה.

לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפט את תמיסת הג'ל אל התמיכה הפלסטית הגמישה בין המרווחים, וכסו בשקיפה עם זכוכית מצופה בחומר הידרופובי. לאחר המתנה של 45 דקות לפולימריזציה של הג'ל, קלפו את התמיכה הפלסטית הגמישה כאשר ג'ל הפוליאקרילאמיד הקשור קוולנטית נמצא מעליה, והניחו את הג'ל כלפי מעלה לייבוש באוויר. ברגע שהג'ל יבש, גזרו את ג'ל הפוליאקרילאמיד לצורות הרצויות.

הכינו כ-500 µL של polymethyl soane לכל פלטה בעלת 96 בארות, בהתאם להוראות היצרן, כדי להדביק את הגלים לתחתית פלטה רב-בארית. הניחו טיפה קטנה של Polymethyl soane במרכז כל בארה באמצעות פינצטה. הניחו ג'ל polyacrylamide אחד בכל בארה, כאשר הצד של התמיכה הפלסטית הגמישה פונה כלפי מטה.

לאחר פולימריזציה (curing) של ה-poly dimethyl suboxane, העבירו כמות קטנה של דגימת התאית שהוכנה מראש לכל באר באמצעות פיפט העברה, וסובבו את הפלטה מצד לצד כדי לצפות את פני הג'ל באופן אחיד. הניחו את פלטת הבארה תחת נורת UV בעוצמה גבוהה למשך חמש דקות. בסיום התהליך, שטפו את הג'לים עם PBS כדי להסיר שאריות תאית.

באמצעות פיפט זו, העבירו כ-50 µL של תמיסת קולגן מסוג 1 שהוכנה מראש לכל באר. השאירו את הפלטה מכוסה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות, ולאחר מכן שטפו עם PBS כדי להסיר עודפי תמיסת קולגן. סטריליזו את הג'לים תחת אור UV בתוך מנקה תרביות רקמה למשך שעתיים.

לבסוף, השרו את הג'לים במדיום מלא למשך לילה כדי להגיה ולהגיע לשיווי משקל. השתמשו בג'לים להצמדת תאים באופן מיידי, או אחסנו אותם במקרר למשך עד יומיים. מודול יאנג כפונקציה של מספר ריכוזי אקרילאמיד ו-bis-acrylamide, המסומנים כ-A ו-B בהתאמה, מוצג כאן כפי שצופה.

גם מודול האגירה G' וגם מודול האיבוד G'' אינם תלויים בתדר. כמו כן, אושש כי ייבוש ולאחריו רהידרטציה של הג'לים לא השפיעו על מודול יאנג שלהם. באמצעות שימוש במקשר (Crosslinker) Sulo sampa, ניתן להשיג ציפוי קולגן אחיד על הידרוג'לים בכל דרגת קשיחות.

נצפה כי כאשר תאי סרטן השד M-D-A-M-B 2 31 נזרעו על ג'לי פוליאקרילאמיד למשך 24 שעות, הם נותרו עגולים על ג'לים רכים של 0.5 ו-1 kilo pascal, אך הצליחו להתפשט ולהתארך על ג'ל קשיח של 100 kilo pascal. בנוסף, הידרוג'לים שהוכנו על גבי תמיכת הפלסטיק הגמישה הם שקופים ומאפשרים ויזואליזציה ומיקרוסקופיה קלה. יתרה מכך, תמיכת הפלסטיק הגמישה אינה גורמת לפלואורסצנציה עצמית, ולכן אינה מפריעה לדימוי של תאים המסומנים פלואורסצנטית.

מורפולוגיית התאים כוונתה באופן כמותי נוסף במונחים של שטח פריסת התא הכולל ועגוליות התא. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה כיצד להרכיב ג'לים של פוליאמיד באופן יעיל ובזול בפורמט של פלטת ריבוי בארות, לצורך חקר ביולוגיה של תאים התלויה בנוקשות.