Name: זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3LIFE (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: חקור זיהוי מטרות מיקרו-ARN בתפוקה גבוהה באמצעות שיטת 3'LIFE בתאי HEK293. שיטה זו מאפשרת מדידת כבילה תרגומית וניתוח מהיר של מאות אינטראקציות פוטנציאליות ברגולציה לאחר התמסרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לסטיבן בלייזי, קארן אנדרסון, ג'וש לה-בר על העצה והדיון. קארן אנדרסון, ג'ון צ'אפוט וג'וש לה-בר על שיתוף ריאגנטים ומכשור, מייקל גסקין ואנדריאה ת'רופ על ייעוץ טכני ופרוטוקולים. ג'סטין וולטר הוא חוקר מאהר ומודה למשפחת מאהר על תמיכתם הנדיבה.

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Pasquinelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+the+sequence+and+temporal+expression+of+let-7+heterochronic+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.</a> Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).</li>
<li>Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).</li>
<li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).</li>
<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li>
<li>Wienholds, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in zebrafish embryonic development.</a> Science. 309 (5732), 310-311 (2005).</li>
<li>Darnell, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+during+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression during chick embryo development.</a> Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).</li>
<li>Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+and+microRNAs+in+fragile+X+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA and microRNAs in fragile X mental retardation.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MicroRNA+feedback+circuit+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons.</a> Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).</li>
<li>Poy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pancreatic+islet-specific+microRNA+regulates+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion.</a> Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li>
<li>Paraskevopoulou, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-microT+web+server+v5.0%3A+service+integration+into+miRNA+functional+analysis+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).</li>
<li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microRNA+target+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3%27UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).</li>
<li>Lal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-24+Inhibits+cell+proliferation+by+targeting+E2F2%2C+MYC%2C+and+other+cell-cycle+genes+via+binding+to+%27seedless%27+3%27UTR+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements.</a> Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).</li>
<li>Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li>
<li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+microRNA+targeting+code%3A+functional+sites+with+centered+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li>
<li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838(2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li>
<li>Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mode+of+microRNA+target+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative mode of microRNA target recognition.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).</li>
<li>Jiao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+targeting+oncogenes+are+down-regulated+in+pancreatic+malignant+transformation+from+benign+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors.</a> PLoS One. 7 (2), e32068(2012).</li>
<li>Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27LIFE%3A+a+functional+assay+to+detect+miRNA+targets+in+high-throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput.</a> Nucleic Acids Res. , (2014).</li>
<li>Mangone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+C.+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The landscape of C. elegans 3'UTRs.</a> Science. 329 (5990), 432-435 (2010).</li>
<li>Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m%286%29A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3%27UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204(2013).</li>
<li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li>
<li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNASU+plasmid+and+PSI%3ABiology-Materials+repositories%3A+resources+to+accelerate+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li>
<li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li>
<li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li>
<li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs%3A+a+network+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li>
</ol>

עבודה זו נתמכת על ידי כספים מהמכללה לאמנויות ליברליות ומדעים והמכון לעיצוב ביולוגי באוניברסיטת אריזונה סטייט ומענק מחקר מחקר/התפתחותי של NIH 1R21CA179144-01A1.

Assay 3&#39;LIFE מזהה מטרות מירנה תפקודיות ב3&#39;UTRs בתפוקה גבוהה. assay זה שימושי לחוקרים המבקשים לזהות באופן ניסיוני במספר רב של מטרות המשוערות למירנה עניין שלהם. Assay 3&#39;LIFE הוא גישה רבת עוצמה לשאילתא לרגולציה מונעת 3&#39;UTR, שבassay מספק מדד תפקודי של מיקוד מירנה, והבדיקות בינארי של כתב אחד :: 3&#39;UTR נגד מירנה יחידה בביטחון יכול לטפל ב מצב המיקוד של גנים בודדים. כדי לאמת גישה זו, אנו הוקרנו פנל של 275 3&#39;UTRs ונגד שני miRNAs, בואו-7C וmiR-10b, וכללנו 10 ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות ולמפות בדיוק microRNA מטרות (מירנה) בתפוקה גבוהה. MiRNAs הוא RNAs קידוד שאינו אנדוגני ~ 22 נוקלאוטידים באורך. בעקבות שעתוק ועיבוד, miRNAs הבוגר משולבים בקומפלקס חלבון הנקרא RNA מושרה השתקה מורכב (RISC). כל מירנה מנחה את RISC למקד אלמנטים הממוקמים בעיקר באזורי 3&#39;untranslated (3&#39;UTRs) של RNAs שליח (mRNAs), וכתוצאה מכך גם דיכוי תרגום או מחשוף mRNA 1. מירנה להכיר אתרי יעד המבוססים על ווטסון-קריק הסטנדרטי וG: U לנענע זיווג בסיס, והם מנוונים בטבע, המכיל זוגות בסיסים תואמים מרובים ובלטה אזורים. miRNAs רבים נשמר באופן רחב מצמחים לבני האדם 2,3, שבו הם משחקים במגוון רחב של תפקידים ביולוגיים. בmetazoans miRNAs יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל החלטות גורל תא 4, עיתוי התפתחותי 5 </sup&gt;, ולעתים קרובות מפגין דפוסי ביטוי רקמות ספציפיים 6,7. misexpression מירנה יכול גם לגרום לויסות הגנים חריגה, אשר יכולה להיות השפעה מהותית על מבוססת אך ורק על התפקוד של גני מטרת התנהגות תא. ככזה, miRNAs צמוד למגוון רחב של מחלות, כולל ניוון מוחיים 8,9, סוכרת וסרטן 10 11. Bioinformatic וגישות רטוב ספסל מצביעים על כך שכל מירנה עשויה להיות מסוגל מיקוד מאות עד אלפי mRNAs הברור 12-14, מצביע על כך שתפוקה גבוהה או הגנום גישות רחבות נדרשות לחקור בריכה גדולה זו של אינטראקציות פוטנציאליות. זיהוי גני המטרה הוא מרכיב קריטי בתפקוד מירנה מכניסטי הגדרה, וכדי לעשות זאת חוקרים חייבים להיות מסוגלים לחשוף מטרות בקנה מידה גדולה. כמה גישות פותחו כדי לזהות מטרות מירנה, כולל אלגוריתמי תחזית bioinformatic, רצף תפוקה גבוההשל ממוקד mRNAs, וכתב מבחני מבוסס. כל הגישות הללו עוצמות וחולשות הגלומות. בהתחשב בכך שמיקוד מירנה מונחה על ידי סגוליות רצף, בעיקר של נוקלאוטידים 2-6 של מירנה (שמכונה אזור הזרע), כמה אלגוריתמים פותחו לחזות מטרות מירנה לאורך הגנום של אורגניזמים רבים. אלגוריתמים אלה מאומנים באמצעות המוטיבים בסיס שיוך הנצפים של מטרות מירנה תוקף, ולעתים קרובות לנצל פרמטרים כגון זיווג מחמיר זרע, שימור אתר, ו / או יציבות התרמודינמית 15. בעוד מסננים אלה לחדד מספר רב של מטרות המשוערות עם השלמה מספיק למטרות ביטחון בלבד גבוהות, הם עלולים שלא לכלול מיני אתרים ספציפיים ואינם קנוני מירנה יעד, שהראיות האחרונות עולה נפוצות 16-24. יתר על כן, תחזיות אלו אינן לוקחות בחשבון את מנגנוני עיבוד mRNA שלא לכלול אתרי יעד מירנה, כגון polyadenylation החלופי25, עריכת RNA 26, מתילציה RNA 27, ומחייב שיתוף פעולה. ככזה, שיעורים חיוביים ושקר שקר שליליים גבוהים דווחו לאלגוריתמים רבים 22,24,28. בעוד אלגוריתמים אלה הם שימושיים כדי לזהות מטרות מירנה מועמד לאימות ניסיוני שלאחר מכן, שיעורי שגיאה הגבוהים אלה מגבילים את היעילות של גישות bioinformatic לאיתור יעד מירנה שיטתית. לחקור באופן שיטתי לאינטראקציות בין מירנה נתון ו3&#39;UTRs פוטנציאלי הממוקד פיתחנו assay תפוקה גבוהה נקרא פלורסנט זיהוי של אלמנטים פונקציונליים ב3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24. צעדים זה assay אינטראקציות ישירות ודיכוי translational של 3&#39;UTR הבדיקה על ידי שאילתא מירנה באמצעות מערכת כתב בלוציפראז כפולה. במערכת זו, 3&#39;UTR של גן של עניין הוא משובט במורד הזרם של מסגרת קריאת גחלילית בלוציפראז (fluc) כתב. חסרונות הכתבtruct הוא cotransfected עם שאילתא מירנה בתאי HEK293T. מיקוד מירנה נקבע על ידי מדידת השינוי ביחס בין fluc המבחן :: כתב 3&#39;UTR וכתב בלוציפראז Renilla אינו ספציפי שני. חשוב לציין, מבחני בלוציפראז לזהות אינטראקציות מירנה / mRNA תפקודיים המשפיעות על תפוקת translational של הכתב. זהו יתרון מרכזי על פני שיטות מסורתיות כדי לזהות רגולציה מירנה, כגון RT-qPCR וכתמים מערביים, שבזו עוקפת הבדלים בשפלת mRNA ודיכוי translational, כמו גם שינויים בשפע חלבון עצמאי של רגולציה מבוססת 3&#39;UTR. מבחני בלוציפראז משמשים באופן נרחב כדי לאמת מטרות מירנה ישירות בגלל פשטותם היחסית וברגישות, עדיין השימוש בם במסכי תפוקה גבוהה הוא מוגבל על ידי עלויות גבוהות כרוכות בחומרים כימיים מתכלים, חוסר ספריות 3&#39;UTR ממקורות ציבוריים, והעדר של prot לוציפראז הסטנדרטיocols, שהוביל לקשיים בהשוואת דיכוי פונקציונלי על פני מערכי נתונים מרובים. כדי להקל על השימוש של assay 3&#39;LIFE, יש לנו דגש על פישוט של עיצוב ניסיוני, שימוש בחומרים כימי transfection 24 ולוציפראז לא מסחרי 29, יצירת ספריית 3&#39;UTR המתעדכנת באופן קבוע ומורחבת, והוא זמין ב מאגר פלסמיד ציבור 30. יכולת הרחבה של assay 3&#39;LIFE מאפשרת הקרנה של ספריית 3&#39;UTR גדולה למיקוד על ידי מירנה ניתנת ללא הטיית המסך לכיוון הגנים שזוהו bioinformatically. בנוסף לבדיקת אינטראקציות הקנונית וחזו, גישה שיטתית זו מאפשרת זיהוי מטרות רומן מונעות באמצעות אינטראקציות הלא-הקנונים ו / או מינים ספציפיות. חשוב לציין, את ההשפעה של מירנה מיקוד על ייצור חלבון הוא הבין בדרך כלל לגרום לדיכוי translational הצנוע 15,31 &lt;/ Sup&gt;, המצביע על כך תפקיד עיקרי של הרגולציה מירנה הוא לכוונן תפוקת חלבון, להגן מפני רמות חריגות של ביטוי גנים, ומספק חוסן לתא תוכניות ספציפיות 32,33. הרגישות של assay בלוציפראז בשילוב עם המספר הגדול מיסודו של אינטראקציות מירנה / mRNA שליליים במסך 3&#39;LIFE מאפשרת זיהוי של השפעות עדינות של מירנה מיקוד על מספר גדול של גנים, וזיהוי של מרכיבים רבים של רשתות גנים ש מוסדרים על ידי מירנה נתנה 24. כאן אנו מתארים את פרוטוקול 3&#39;LIFE, ולהפגין זה היתכנות על ידי הקרנת שני miRNAs המאופיין היטב, miR-10b ולתת-7C נגד פנל של 275 3&#39;UTRs האנושי (איור 1).

<table><tbody><tr><td>ריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצילגליצין</td><td>סיגמא</td><td>G1127-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kx PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>FLAAS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>ו-2EDTA</td><td>Sigma</td><td>E0399</td><td></td></tr><tr><td>K H2 P O4</td><td>Sigma</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>ו-N3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Sigma</td><td>C3230</td><td></td></tr><tr><td>PBS/HEPES</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td></td><td>T2600000</td><td></td></tr><tr><td>חומרים</td><td></td><td></td><td></td>מתכלים</tr><tr><td>MaxiPrep Kit</td><td>Promega</td><td>A2392</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מיני-הכנה 96 בארות</td><td>Pall</td><td>8032</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות מעבורת</td><td>Lonza</td><td>V4SP-2096</td><td></td></tr><tr><td>5x מאגר ליזה</td><td>Promega</td><td>E1941&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מכשירים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-בארות GloMax קורא צלחות</td><td>Promega</td><td>E9032</td><td></td></tr><tr><td>Biomech FX נוזל מטפל רובוט</td><td>Beckmann</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001</td><td></td></tr><tr><td>96-well Shuttle System</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;life

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

פלורסנט זיהוי של אלמנטים פונקציונליים ב3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) מאפשר זיהוי המהיר של מטרות של miRNAs הספציפי בתוך מערך של מאות 3&#39;UTRs שאילתא. זיהוי יעד מבוסס על assay הכפול לוציפראז, אשר מזהה מחייב ברמת ה- mRNA על ידי מדידת תפוקת translational, נותנת קריאת נתונים פונקציונליות של מירנה מיקוד. 3&#39;LIFE משתמש מאגרים שאינן קניינית וריאגנטים, וספריות כתב זמינות בפומבי, מה שהופך את מסכי הגנום אפשרי וחסכוני. ניתן לבצע 3&#39;LIFE או במעבדה הגדרה סטנדרטית או לשנותם באמצעות רובוטים טיפול נוזליים ומכשור תפוקה גבוהה אחר. אנו מדגימים את הגישה באמצעות בסיס הנתונים של 3&#39;UTRs האנושי משובט ב96-גם צלחות, ושני miRNAs בדיקה, לתת-7C וmiR-10b. אנו מדגימים כיצד לבצע הכנת DNA, transfection, תרבות תא ומבחני בלוציפראז בפורמט 96-היטב, ולספק כלים לנתוניםניתוח. לסיכום 3&#39;LIFE הוא מאוד לשחזור, מהיר, שיטתי, ומזהה מטרות ביטחון גבוהות.

קובץ פלט luminometer מכיל מדידות גלם לשני חלבוני לוציפראז הגחלילית וRenilla. פורמט גלם זה תואם עם &quot;3&#39;LIFE - ניתוח צלחת אחת&quot; ו- &quot;3&#39;LIFE - ניתוח multiplate&quot; גיליונות אלקטרוניים זמין מאתר האינטרנט של המעבדה Mangone <a href="http://www.mangonelab.com">(www.mangonelab.com).</a> הגיליון האלקטרוני ניתוח צלחת אחת המחשב באופן אוטומטי גחלילית / יחס Renilla, מנרמל כל מירנה לשליטה השלילית המתאימה, ומנרמל ערכי דיכוי על פני כל צלחת. גיליון אלקטרוני ...

זיהוי זוהר של אלמנטים פונקציונליים ב-3' אזורים לא מתורגמים (3'UTRs) (3'LIFE) היא טכניקה לזיהוי ויסות פונקציונלי ב-3'UTRs על ידי miRNAs או גורמים רגולטוריים אחרים. פרוטוקול זה משתמש במתודולוגיה בעלת תפוקה גבוהה כגון טרנספקציה של 96 בארות ומבחני לוציפראז כדי לסנן מאות אינטראקציות משוערות לדיכוי תפקודי.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות מטרות של micro RNA מתוך ספרייה של אזורים לא מתורגמים של הקצה השלישי (3' UTR). דבר זה מושג על ידי טרנספקציית COT של תאי HEK 2 93 עם פלסמיד לביטוי micro RNA ופלסמיד המכיל רפורטר לוסיפראז המחובר ל-3' UTR, כדי לאפשר סריקות נרחבות ללא הטיה. הטרנספקציות מבוצעות בלוחות בעלי 96 בארות כשלב שני. התאים עוברים בדיקת לוסיפראז כפולה (dual Lucifer assay), המודדת ויסות פוסט-טרנסקריפציונלי של ה-3' UTR על ידי ה-micro RNA.בשלב הבא, נתונים ממספר חזרות וממספר פלטות מנותחים כדי לזהות מטרות microRNA בעלות רמת ביטחון גבוהה מתוך מאגר של מאות תוצאות 3' UTR. התוצאות מראות כי כל microRNA פוגע בסט ייחודי של 3' UTR, בהתבסס על דיכוי תרגומי כפי שנמדד על ידי בדיקת ה-dual luciferase. בדיקת ה-3' UTR יכולה לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של microRNA על ידי זיהוי מספר רב של גנים מטרה עבור microRNA מסוים, ובכך לספק נתונים להכוונת ניסויי תיקוף המשכיים. 24 עד 48 שעות לפני התעתוק (transfection), הכינו כמות מספיקה של תאי HEK 293T בהתאם למספר פלטות 96 הבארים המיועדות להתעתוק. כל פלטת 96 באר דורשת 9 מיליון תאים.בהדגמה זו, יסרוקו שני microRNAs מאופיינים היטב מול פאנל של 275 רצפי urs אנושיים שלושה-פריים. לפיכך, ייעשה שימוש ב-3 פלטות בעלות 96 בארות. פלטת תרבית מעגלית בקוטר 145 מילימטר מספיקה ב

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

אנו מתארים את השימוש בפלטפורמת ביטוי גנים מרובת תפוקה גבוהה המכמתת את ביטוי הגנים על ידי ברקוד וספירת מולקולות במצעים ביולוגיים ללא צורך בהגברה. השתמשנו בפלטפורמה כדי לכמת את ביטוי המיקרו-רנ"א (miRNA) בדם מלא בנבדקים עם ובלי תסמונת המעי הרגיז.

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

כאן אנו מציגים צינור miRNA חדש ואוטומטי לחלוטין, mirMachine ש-1) יכול לזהות miRNAs ידועים וחדשניים בצורה מדויקת יותר ו-2) הוא אוטומטי לחלוטין וזמין באופן חופשי. משתמשים יכולים כעת לבצע סקריפט הגשה קצר כדי להפעיל את צינור mirMachine האוטומטי לחלוטין.

mirMachine: חנות אחת לביאור miRNA צמחי

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

חקור זיהוי מטרות מיקרו-ARN בתפוקה גבוהה באמצעות שיטת 3'LIFE בתאי HEK293. שיטה זו מאפשרת מדידת כבילה תרגומית וניתוח מהיר של מאות אינטראקציות פוטנציאליות ברגולציה לאחר התמסרות.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3'LIFE

גלה סרטונים נוספים