צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב Streptococcus pneumoniae
25 באפריל 2015
כתב יד זה מתאר את השימוש בטכנולוגיה חדישה המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA. מיקרו-מערכים מספקים סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו בתנאי מסוים. יתר על כן, אנו מדגישים את הקלות שבה ניתן לנתח כמויות גדולות של נתונים באמצעות חבילות תוכנה נוחות שפותחו בבית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו במצב מסוים. זה מושג על ידי גידול וקצירת תאי חיידקים בתנאי מסוים. לאחר מכן, ה-RNA הכולל מבודד מהתאים שנקטפו ו-CDNA מיוצר מה-RNA.
לאחר מכן ה-CDNAs מתויגים ועוברים הכלאה לשקופיות מיקרו-בדיקה מתוצרת החברה. לבסוף, השקופית נשטפת ולאחר מכן סורקים ומנתחים את השקופיות. בסופו של דבר, המיקרו-מערך משמש להצגת השינויים הטרנסקריפטומיים בתאי חיידקים בתנאי הספציפי.
היתרון העיקרי של טכנולוגיית המיקרו-מערך של ה-DNA על פני שיטות קיימות אחרות לחקר ביטוי גנים כמו QPCR או כתמים צפוניים, הוא שהיא מספקת סקירה גלובלית של כל השינויים הטרנסקריפטומיים שנגרמו בתנאי מסוים. זה מהיר, אמין וזול יחסית. ידגימו את ההליך מוחמד סאל ואיירון מנזו, סטודנטים PSD מהמעבדה שלי בגנטיקה מולקולרית לאחר הפשרה, s, pmo, כדורי תאים ED 39 ו-Resus השעיה ב-400 מיקרוליטר של te על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו את הדברים הבאים בצינורות מכסה בורג ללא RNA, 0.5 גרם חרוזי זכוכית, 50 מיקרוליטר של 10% SDS 500 מיקרוליטר של פנול כלורופורם שהוכנו בעבר וכדורי התאים התלויים.
כדי לשבור את התאים, הכניסו את הצינורות למקצף חרוזים והומוגניזציה פעמיים למשך 60 שניות כל אחד, הניחו אותם על קרח למשך דקה אחת בין הפולסים, ואז צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את השלב העליון לצינור טרי, וב -500 מיקרוליטר כלורופורם i, a וצנטריפוגה למשך חמש דקות נוספות. פיפטה 500 מיקרוליטר מהשלב העליון לצינורות טריים.
הוסף שני נפחים של מאגר קשירת ליזה וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, באמצעות ערכת בידוד RNA מבודדים את ה-RNA הכולל בהתאם לפרוטוקול היצרן להסרת DNA מזהם מה-RNA. מוסיפים 100 מיקרוליטר של תערובת אחת של D a ודוגרים בחום של 15 עד 25 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות.
השתמש בערכה של RN a כדי לשטוף את ה-RNA הנקי ואת ה-Elute לנפח של 50 מיקרוליטר כדי לבצע את תגובת הברך בצינורות PCR של 300 מיקרוליטר. מערבבים RNA כולל עם שני מיקרוליטרים של מונומרים אקראיים ומשתמשים במים נטולי נוקלאז במידת הצורך כדי להביא את הנפח ל-18 מיקרוליטר. דגרו את תערובת הכריעה בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר מכן קררו את התגובות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ותנו להן סיבוב מהיר לפני שמניחים את הצינורות על קרח למשך דקה אחת לפחות. כדי לתמלל CDNA הפוך, הכינו את תערובת השעתוק ההפוך, שלבו 18 מיקרוליטר מהתערובת עם 12 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ודגרו את התגובה ב-42 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד 16 שעות. פירוק ה-mRNA מהתגובה על ידי הוספת שלושה מיקרוליטרים של 2.5 מולארי ו-OH והנחתו ב-37 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות.
לאחר מכן הוסף 15 מיקרוליטר של שתי ערימות טוחנות ללא חומצה כדי לנטרל את ה-NAOH. לאחר מכן, לאחר שימוש בעמודות ניקוי PCR כדי לטהר את ה-CDNA עם ספקטרופוטומטר, מדוד את ריכוז ה-CDNA כדי לתייג את ה-CDNA. הוסף חמישה מיקרוליטר של צבע תגובתי ממוצע ל-20 עד 60 ננוגרם למיקרוליטר CDNA.
מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר החשוכה והמודגרת למשך 60 עד 90 דקות לפני השימוש בעמודות ניקוי PR כדי לטהר את הצבע המסומן ב-CDNA החומק ב-50 מיקרוליטר של מאגר אבולוציה עם ספקטרופוטומטר, ודא שריכוז ה-CDNA המסומן הוא לפחות 0.5 פיקו מול למיקרוליטר בנפח כולל של 50 מיקרוליטר. לאחר הכנת מאגר ביישן, על פי פרוטוקול הטקסט, מחממים את המאגר בחום של 68 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. כדי להכין את הדגימה, שלב כמויות שוות של CDNAs מסומנים, ולאחר מכן השתמש ברכזי ואקום בטמפרטורה גבוהה כדי להפחית את הנפח לשבעה מיקרוליטר או פחות.
בינתיים, כדי לנקות החלקות מרים כדי להפחית את אות הרקע, השתמש בסבון והרבה מי ברז, ואחריו 100% אתנול לאחר ייבוש המייבש את החלקות ההרמה, הנח אחד על מגלשה כשבטנת הטפלון הלבנה פונה כלפי מטה. לאחר מכן, ממיסים את דגימות הצבע המיובשות בשבעה מיקרוליטרים של H2O ודוגרים בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. מוסיפים מיד 35 מיקרוליטר של חוצץ ביישן שחומם מראש, מערבבים בעדינות ומסובבים במהירות מקסימלית למשך דקה אחת.
כדי לזרום משקעים, יש לחמם את הגשושית בטמפרטורה של 68 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות לפני הטעינה. כדי להרכיב את המגלשה ואת החלקת ההרמה, הנח את מחזיק שקופיות ההיברידיזציה על גוש חום בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס. הנח שקופיות מיקרו-מערך DNA עם החלקת ההרמה על מחזיק שקופיות ההכלאה המחוממת וחמם מראש את המגלשה עם החלקת ההרמה למשך דקה.
לאחר מכן, במהירות האפשרית, הוסף 40 מיקרוליטר ממטרת הדגימה לסוף השקופית. אפשר לנוזל לזרום בין משטחי הזכוכית בכוח נימי. כעת הוציאו את קלטת ההכלאה החמה מראש מתנור ההכלאה וסגרו את המכונה.
לאחר מכן הניחו נייר פילטר ספוג בשלושה מיליליטר של שני XSSC בקלטת ההכלאה. הנח בעדינות את מחזיק שקופיות ההכלאה עם שקופיות בקלטת ההכלאה. סוגרים את קלטת ההכלאה ומחזירים אותה לתנור ההכלאה ודוגרים למשך 16 עד 18 שעות.
לשטיפת השקופיות, הכינו מאגרי כביסה טריים אחד, שניים ושלוש, והניחו אותם על 30 מעלות צלזיוס. כדי להבטיח שה-SDS יתמוסס בסיום הדגירה, טבלו בעדינות את השקופיות במהירות האפשרית בצינור פלקון מלא ב-50 מיליליטר של מאגר כביסה, אחד עד שהכוס מונחת בתחתית הצינור. לאחר שהמרים מחליק, שוקע לתחתית הצינור מבלי לשרוט את המערך, השתמש בפינצטה כדי להסיר את המגלשה ולהכניס אותה למתלה של תחנת הכביסה.
השתמש מיד ב-500 מיליליטר של מאגר כביסה אחד כדי לשטוף את השקופיות למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את השקופיות למאגר כביסה שניים למשך 20 עד 30 דקות לפני העברתם ל-500 מיליליטר של מאגר כביסה שלוש למשך חמש דקות. לבסוף, יבש את השקופיות ב-2000 סל"ד למשך שתי דקות לפני ביצוע ניתוח מיקרו-מערך.
על פי פרוטוקול הטקסט לחקר ההשפעה של L serin על כל הטרנסקריפטום של S pneumonia, בוצע ניתוח מיקרו-מערך של זן D 39 Wildtype של זן D 39 שגדל ב-CDM עם 150 מיקרומולר של L Seine, בהשוואה לזה שגדל ב-10 מילי-מולרי L Seine באותו מדיום. טבלה זו מפרטת את ריכוזי ה-RNA הכולל שבודדו מכל תרבית כפי שמוצג באיור זה. לאחר הסרת ה-DNA נבדקה איכות ה-RNA.
שני נתיבים אלה מייצגים RNA מ-150 מיקרו-מולארי סיין, ושני נתיבים אלה הם מתרביות שגודלו עם 10 מילי-מולארי. נוכחותם של שתי להקות ברורות מעידה על RNA באיכות טובה. ריכוזי ה-CDNA המסונתזים מסך ה-RNA נרשמים בעמודה זו ושל דגימות הצבע התגובתי הממוצע של AM מפורטות כאן.
ניתוח תרשים פיזור של יחס הקוביות התגובתיות הממוצע של AM נראה באיור זה, והנתונים נותחו עוד יותר כדי להפחית את הרעש. טבלה זו מסכמת את תוצאות מחקרי המיקרו-מערך לאחר יישום הקריטריונים של גדול או שווה להפרש כפול וערך P של פחות מ-0.001. כפי שניתן לראות כאן, מספר גנים באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בנוכחות סרין L מינימלי בהשוואה למקסימום לאחר הליך זה.
ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו ביג, אלקטרוציטים, בדיקות QPCR, נוקאאוט ו/או חוזק ביטוי על מנת לענות על השאלות הקרובות לאחר פיתוחו. טכניקה זו נתנה לחוקרי VFR בתחום הביולוגיה המולקולרית והתאית לחקור את הרשתות והמנגנונים הרגולטוריים ב-RAM חיובי
.צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב היד מתאר את השימוש בטכנולוגיה מתקדמת המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA לניתוח שינויים טרנסקריפטומיים בחיידקים. התהליך כולל גידול תאי חיידקים בתנאים ספציפיים, בידוד RNA כולל, ושימוש בתוכנה שפותחה באופן מקומי לניתוח נתונים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- גנומיקה
- ביואינפורמטיקה
רקע
- מיקרו-מערכי DNA הם כלים רבי עוצמה לחקר ביטוי גנים.
- ניתוח טרנסקריפטומי עוזר להבנת התגובות של חיידקים לשינויים סביבתיים.
- תוכנה מקומית יכולה להקל על ניתוח מערכי נתונים גדולים.
- מחקר זה מתמקד בתנאי ספציפי המשפיע על תאי חיידקים.
מטרת המחקר
- לספק סקירה כללית של שינויים טרנסקריפטומיים בחיידקים.
- להדגים את היעילות של מיקרו-מערכי DNA בניתוח ביטוי גנים.
- להדגיש את הקלות של ניתוח נתונים באמצעות תוכנה מותאמת אישית.
שיטות ששימשו
- גידול וקצירת תאי חיידקים בתנאים ספציפיים.
- בידוד RNA כולל מתאי קצירה.
- המרה של RNA ל-cDNA.
- תיוג והכלאה של cDNA לשקופיות מיקרו-מערך.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של RNA והמרה ל-cDNA.
- הכלאה יעילה של cDNA לשקופיות מיקרו-מערך.
- ניתוח גילה שינויים טרנסקריפטומיים משמעותיים.
- ניתוח נתונים הוזרם באמצעות תוכנה מקומית.
מסקנות
- מיקרו-מערכי DNA יעילים לחקר טרנסקריפטומיקה בחיידקים.
- תוכנה מותאמת אישית משפרת את יכולות ניתוח הנתונים.
- מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים חיידקיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
DNA microarray technology enables rapid, cost-effective global transcriptome profiling in bacterial systems, supporting target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery. By capturing genome-wide transcriptional responses to environmental stimuli such as nutrient availability, the method provides predictive confidence in pathway modulation and gene regulatory networks. This facilitates early-stage hypothesis triage and portfolio prioritization in antibacterial R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to serine availability, clarifying gene regulatory networks in S. pneumoniae.
- Operational Value: Provides a standardized workflow from cell harvest to data analysis using optimized RNA isolation and labeling protocols.
- Predictive Value: Identifies differentially expressed genes with ≥2-fold change and p<0.001, supporting confidence in target modulation under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide expression profiles enabling comparison of transcriptional states across growth conditions.
- Operational Value: Utilizes homemade microarray slides and standardized hybridization/wash buffers to ensure reproducibility and low background signal.
- Scalability: Supports parallel processing of multiple samples via vacuum concentration and automated scanning for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro transcriptional responses to potential in vivo relevance by modeling nutrient stress conditions encountered during infection.
- Mechanistic De-risking: Clarifies serine-dependent gene regulation, reducing uncertainty in target essentiality and pathway inhibition strategies.
- Preclinical Alignment: Enables identification of co-regulated gene clusters that may represent druggable pathways or virulence modulators.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in target validation and informing lead identification through mechanistic insights into bacterial adaptation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by revealing condition-specific transcriptional reprogramming.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs suitable for assay readiness and cross-condition comparison in antimicrobial screening campaigns.
- Analytics: Employs Microprep for preprocessing and Cyber-T for statistical analysis, enabling robust identification of significant expression changes.
- Translational Research: Connects laboratory observations to pathogenic relevance by modeling host-associated metabolic pressures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across bacterial strains and growth conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies through unbiased, global expression profiling.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA quality checks, dye labeling thresholds, and slide washing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by highlighting condition-specific essential genes and regulatory hubs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, RNA handling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to microarray scanning equipment and spectrophotometric quantification tools.
- Necessitates cross-team standardization of RNA isolation, labeling efficiency, and data preprocessing workflows.
- Involves adaptation considerations when extending to Gram-negative or fastidious bacterial models.
- Limited by the requirement for prior sequence knowledge to design homemade microarray probes.
