Name: צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב Streptococcus pneumoniae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: חקור שינויים טרנסקריפטומיים בחיידקים באמצעות מערכי DNA ותוכנה ייעודית. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר ואמין של ביטוי גנים ב-Streptococcus pneumoniae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אן דה יונג וSiger Holsappel לעזרה עם הפקת שקופיות מערכי DNA. תמיכתה של אנה דה יונג לניתוח ביואינפורמטיקה גם מוערכת. אנו מודים גם Jelle Slager לבחינת הנייר. מוחמד אפזאל ואירפאן Manzoor נתמך על ידי אוניברסיטת GC, Faisalabad, פקיסטן במסגרת תכנית פיתוח סגל של HEC פקיסטן.

<ol><li>Kayala, M. A., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyber-T+web+server%3A+differential+analysis+of+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data.</a> Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).</li>
<li>Chang, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cells+to+matrixes+of+distinct+antibodies+coated+on+solid+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface.</a> J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
<li>Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+procedure+for+the+isolation+of+RNA+from+high-phenolic-containing+tissues+of+pecan%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan.</a> 27 (12), 1316-1318 (1992).</li>
<li>Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extraction+of+intact+RNA+from+fruits+rich+in+polysaccharides+using+ripe+mango+mesocarp%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp.</a> (5), 440-442 (1992).</li>
<li>Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Report%22%5BJournal%5D)">A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).</li>
<li>Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+protocol+for+isolation+of+functional+RNA+from+plant+tissues+rich+in+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol.+Report%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites.</a> Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).</li>
<li>Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+isolating+high-quality+RNA+from+leaves+of+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Enol.+Vitic%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine.</a> Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).</li>
<li>Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPreP%3A+a+cDNA+microarray+data+pre-processing+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework.</a> Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).</li>
<li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li>
<li>Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacR+is+a+repressor+of+lacABCD+and+LacT+is+an+activator+of+lacTFEG%2C+constituting+the+lac+gene+cluster+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).</li>
<li>Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UlaR+activates+the+expression+of+the+ula+operon+in+Streptococcus+pneumoniae+in+the+presence+of+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Read.+Engl%22%5BJournal%5D)">UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid.</a> Microbiol. Read. Engl. , (2014).</li>
<li>Hendriksen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+contributions+of+glutamine-dependent+regulator+GlnR+and+GlnR-regulated+genes+to+virulence+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae.</a> Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).</li>
<li>Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+arginine+acquisition+and+virulence+gene+expression+in+the+human+pathogen+Streptococcus+pneumoniae+by+transcription+regulators+ArgR1+and+AhrC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC.</a> J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).</li>
<li>Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+have+neighbour%27s+fare%3A+extending+the+molecular+toolbox+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Read.+Engl%22%5BJournal%5D)">To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIVA%3A+Functional+Information+Viewer+and+Analyzer+extracting+biological+knowledge+from+transcriptome+data+of+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinforma.+Oxf.+Engl%22%5BJournal%5D)">FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes.</a> Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosecutor%3A+parameter-free+inference+of+gene+function+for+prokaryotes+using+DNA+microarray+data%2C+genomic+context+and+multiple+gene+annotation+sources%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources.</a> BMC Genomics. 9, 495(2008).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCLOSE+%3A+DISsection+of+CLusters+Obtained+by+SEries+of+transcriptome+data+using+functional+annotations+and+putative+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites.</a> BMC Bioinformatics. 9, 535(2008).</li>
<li>Baerends, R. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome2D%3A+a+visualization+tool+for+the+rapid+analysis+of+bacterial+transcriptome+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data.</a> Genome Biol. 5 (5), R37(2004).</li>
<li>De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PePPER%2C+a+webserver+for+prediction+of+prokaryote+promoter+elements+and+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons.</a> BMC Genomics. 13, 229(2012).</li>
<li>Lanie, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Avery%27s+virulent+serotype+2+strain+D39+of+Streptococcus+pneumoniae+and+comparison+with+that+of+unencapsulated+laboratory+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6.</a> J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li>
<li>Molecular Devices, Corp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GenePix+Pro+6.0+Microarray+Acquisition+and+Analysis+Software+for+GenePix+Microarray+Scanners-Use%27s+Guide+and+Tutorial%22">GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial</a>. , Molecular Devices, Corp. (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מתארים פרוטוקול ידידותי למשתמש שניתן ליישם כדי לבצע ניתוח transcriptome שלם של חיידקים. נקודת המפתח על הטכניקה המסוימת הזה היא שהמצב לפיו התאים נקצרים ישתנה. לאחר קצירת תאי הבידוד ו- RNA, טכניקה זו הופכת להיות שווה לכל סוגי דגימות חיידקים ופועלת בהתאם לשלבים זהים לחלוטין ולכן, יכולה להיות מיושמת על כל סוג של תרבות חיידקים. הפרוטוקול הוא מאוד פשוט ונוח ומתחיל מבידוד RNA. פרוטוקול בידוד RNA שלנו (באמצעות Macaloid וערכת בידוד RNA) הוא זמן יעיל בהשוואה לפנול, כלורופורם קונבנציונלי...

המחקר של המערך השלם של mRNA שפע (transcriptome) מקודד על ידי הגנום של האורגניזם חד-תאי או תא האיקריוטים בזמן מסוים או במצב מסוים, ובכלל זה ביטוי יתר של גן או נוק-אאוט, נקרא transcriptomics. Transcriptomics מאפשר לנו להתבונן למה גני המידה באים לידי ביטוי במצב מסוים בנקודת זמן X ונותן לנו מידע על כמה חזק גנים באים לידי ביטוי ביחס להתייחסות. Microarray הוא מערך דו-ממדי על מצע מוצק (בדרך כלל שקופיות זכוכית או תא סרט דק סיליקון) שיכול לשמש לassay כמויות גדולות של חומר ביולוגי באמצעות הקרנת תפוקה גבוהה, וממוזער, עיבוד מרובב ומקביל וזיהוי שיטות. Microarrays בא בסוגים שונים, כולל DNA-microarrays, microarrays חלבון, microarrays פפטיד, microarrays רקמות, microarrays נוגדן, microarrays הסלולרי ואחרים. מערך DNA הואבעצם הרכבה של כתמים מיקרוסקופיים DNA קבוע למשטח מוצק, בדרך כלל זכוכית. מערכי DNA משמשים למדידת רמות הביטוי של גן או קבוצת גנים בו זמנית או לגנוטיפ אזורים מרובים של הגנום 2,3. Picomoles (10 -12 שומות) של חללית נמצא בתוך כל מקום DNA שמייצג רצף DNA ספציפי, הידוע גם בכתב. מולקולות mRNA שכותרתו מהדגימות נקראות &#39;יעדים&#39;. Fluorophores משמשות למדידת הכלאת בדיקה-יעד וזיהוי של מטרות שכותרתו fluorophore קובע את השפע היחסי של רצפי חומצות גרעין ביעד. ניסוי microarray יכול להשיג בדיקות גנטיות מרובות במקביל כי מערך עשוי להכיל עשרות אלפי בדיקות. הפריסה של ניסוי microarray פשוט מוצגת באיור 1. לאחרונה, הוקם במעבדות האחרות שלנו ושהמערכים אלה הם לשימוש חוזר, מה שהופך את עלות effectiv די בטכניקה זודואר. טכניקות בידוד RNA וטיהור שונות פותחו לאורך השנים כולל C-TAB, SDS ושיטות GT 4-8. יתר על כן, כמה ערכות מסחריות זמינות גם. לביטוי גני RNA באיכות גבוהה הוא חשוב מאוד. לכן, שיטות בידוד RNA הן שונה כדי לקבל כמות המרבית של RNA. באופן דומה, הצעדים להכנת cDNA וסימון של cDNA הם מזעריים. נורמליזציה של נתונים לאחר הסריקה מבוצעת גם ביעילות על ידי שימוש בחבילות תוכנה ב- בית שנבנה וכלים 9. pneumoniae Streptococcus הוא הפתוגן אנושי גרם-חיובי שcolonizes לוע האף והוא הגורם לזיהומים רבים כגון דלקת ריאות, אלח דם, דלקת אוזן תיכונה ודלקת קרום המוח 10. החיידק יכול לנצל את מגוון רחב של החומרים המזינים הדרושים לצמיחה והישרדות 11,12. מספר המחקרים בוצעו עלחילוף חומרים דלקת ריאות חנקן ורגולציה המדגישים את החשיבות של חומצות אמינו ותפקידם בארסיות 13,14. במחקר זה, תגובת transcriptomic של ס &#39; pneumoniae לשינוי ריכוזים של L-סרין, חומצת אמינו בשפע קיים בפלזמת הדם האנושית, הוא דיווח באמצעות מערכי DNA. תגובת transcriptomic של ס &#39; pneumoniae גדל בריכוז מינימאלי של L-סרין (150 מיקרומטר) הושווה שלגדל בריכוז מרבי (10 מ&quot;מ) של סרין. בינוני הגדרה כימית (CDM או בינוני מינימאלי) 15 שימש למחקר זה כדי לשלוט בריכוז של סרין. המוקד של מחקר זה הוא להפוך ידידותי למשתמש בטכניקה זו ולספק כלים שונים לנורמליזציה נתונים וניתוח. לכן, מספר הכלים שפותחו לצורך הניתוח ופרשנות הנתונים. FIVA (מידע Viewer פונקציונלי וAnalyzer) מספק פלטפורמה לעיבוד המידע הכלול באשכולות של גנים שישדפוסים דומים ביטוי גנים ולבניית פרופילים תפקודיים 16. התובע הוא חבילת תוכנה אחרת המאפשרת זיהוי של פונקציות והסברים של גנים 17 משוערים. על ידי עשיית שימוש של שיטות קיבוץ באשכולות, לחשוף מספק אלגוריתם זיהוי אתר הקישור DNA. המוטיבים רגולטורית הסיס של גנים יכולים להיות מוקרנים באמצעות אלגוריתם זה 18. Genome2D מציע פלטפורמה מבוססת Windows להדמיה וניתוח של נתונים transcriptome על ידי הצעת טווחי צבע שונים כדי לאפיין את השינויים ברמות ביטוי גנים על מפת הגנום 19. שרת האינטרנט של הפלפל מציע, בנוסף לשיטת ניתוח all-in-one, ארגז כלים לכרייה לregulons, יזמים וגורם שעתוק מחייב אתרים 20. ביאור מלא של אזורים חוץ-בגנום של חיידקים יכול להיות מושגת על ידי שימוש בחבילה זו. ביולוגים יכולים להפיק תועלת רבה מפלפל כפי שהוא מציע להם במה לעיצוב ניסויs כך שהמידע המשוער ניתן לאשר במבחנה 20. חבילות תוכנה אלה תורמים באופן משמעותי לניתוח microarray כמו רובם זמינים באופן חופשי ולעשות נורמליזציה נתונים וניתוח אמינה מאוד.

<table><tbody><tr><td>פנול חומצי</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA</td> של <td>רוש חרוזי</td><td></td> זכוכית 11828665001 <td></td>מדע יישומי</tr><tr><td></td><td>105015</td><td></td>בום כלורופורם 92013505.1000.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td></td><td></td>18080044</tr><tr><td>First Strand Buffer</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Buffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>מצנן</td><td>Speedvac Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>רכז Speedvac בתוספת</td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-Slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>נגב KIMTECH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix autoloader 4200A1</td><td>MSD טכנולוגיות אנליטיות</td><td></td><td>סורק Microarray</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני serine תלויה ב<em&gt; streptococcus pneumoniae</em

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

ביטוי גנים והרגולציה שלה הם מאוד חשובים להבין את התנהגותם של תאים בתנאים שונים. טכניקות שונות משמשות כיום ללמוד ביטוי גנים, אך רובם מוגבלים במונחים של מתן תמונה כוללת של הביטוי לכל transcriptome. מערכי DNA מציעים טכנולוגית מחקר מהירה וכלכלית, אשר נותנת סקירה מלאה של ביטוי גנים הגלובלי ויש להם מספר עצום של יישומים, כולל זיהוי של גנים חדשים וגורם שעתוק מחייבים אתרים, אפיון של פעילות תעתיק של התאים וגם לעזור בניתוח אלפים של גנים (בניסוי יחיד). במחקר הנוכחי, את התנאים לניתוח transcriptome חיידקים מקציר תא לניתוח מערך DNA כבר מותאמים. אם ניקח בחשבון את הזמן, עלויות ודיוק של הניסויים, פלטפורמה טכנולוגית זו מוכיחה להיות שימושי מאוד ואוניברסלי applicabale ללימוד transcripto חיידקיםmes. כאן, אנו מבצעים ניתוח מערך DNA עם pneumoniae Streptococcus כמקרה מבחן-ידי השוואת תגובות תעתיק של ס &#39; pneumoniae גדל בנוכחות ריכוזים שונים L-סרין במדיום. RNA סה&quot;כ היה מבודד באמצעות שיטת Macaloid באמצעות ערכת בידוד RNA והאיכות של RNA נבדק על ידי שימוש בערכת בדיקת איכות RNA. cDNA הוכן באמצעות transcriptase ההפוך ודגימות cDNA תויגו באמצעות אחת משני צבעי ניאון אמין-reactive. שקופיות מערך DNA תוצרת בית שמשו לכלאה של דגימות cDNA המסומנים ונתונים microarray נותחו באמצעות מסגרת עיבוד מראש נתונים microarray cDNA (Microprep). לבסוף, Cyber-T שימש כדי לנתח את הנתונים שנוצרו באמצעות Microprep לזיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי משמעותיים מבחינה סטטיסטית. חבילות תוכנה כמו כן, נבנו בבית (פלפל, FIVA, לחשוף, התובע, Genome2D) שמשו כדי לנתחנתונים.

RNA, בידודי cDNA וניתוח L-סרין הוא אחד מחומצות אמינו החיוניות וריכוזו בפלזמת דם אדם משתנה 60-150 מיקרומטר בילדים ומבוגרים. תפקידה בביוסינתזה של purines וpyrimidines מדגיש את חשיבותה בחילוף חומרים והוא מבשר על כמה חומצות אמינו (גליצין, ציסטאין וטריפטופן). כדי לחקור את ההשפעה של L-סרין על כל transcriptome של ס &#39; זן פראי סוג pneumoniae D39, ניתוח microarray של זן D39 גדל בCDM ע...

כתב יד זה מתאר את השימוש בטכנולוגיה חדישה המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA. מיקרו-מערכים מספקים סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו בתנאי מסוים. יתר על כן, אנו מדגישים את הקלות שבה ניתן לנתח כמויות גדולות של נתונים באמצעות חבילות תוכנה נוחות שפותחו בבית.

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק סקירה של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים המתרחשים תחת תנאי ספציפי. הדבר מושג תחילה על ידי גידול וקציר של תאי חיידקים תחת תנאי ספציפי. לאחר מכן, RNA כולל מבודל מהתאים שנקצרו ו-CDNA מיוצר מה-RNA.לאחר מכן, ה-cDNAs מסומנים ועוברים היברידיזציה לשקופיות מיקרו-מערך (micro assay slides) שהוכנו במעבדה. לבסוף, השקופית נשטפת, ולאחר מכן השקופיות נסרקות ומנותחות. בסופו של דבר, המיקרו-מערך משמש להצגת השינויים הטרנסקריפטומיים בתאי חיידקים תחת התנאי הספציפי.היתרון העיקרי של טכנולוגיית מערכי ה-DNA (microarray) על פני שיטות קיימות אחרות לבדיקת ביטוי גנים, כגון QPCR או northern blotting, הוא שהיא מספקת סקירה גלובלית של כל השינויים הטרנסקריפטומיים המתרחשים תחת תנאי ספציפי. היא מהירה, אמינה וזולה יחסית. את הפרוצדורה ידגימו Mohammed Sal ו-Airon Manzu, סטודנטים לדוקטורט במעבדתי לגנטיקה מולקולרית. לאחר הפשרה, s pmo, משקעי תאי ED 39 וריסוסי תאים ב-400 µL של te בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו את הרכיבים הבאים במבחנות עם פקק הברגה נקיות מ-RNA: 0.5 גרם חרוזי זכוכית, 50 µL של 10% SDS, 500 µL של פנול-כלורופורם שהוכן מראש, ואת משקעי התאים שסוספנדו מחדש.לפירוק התאים, העבירו את המבחנות למכשיר bead beater ובצעו הומוגניזציה פעמיים למשך 60 שניות בכל פעם, תוך הנחת המבחנות על קרח למשך דקה אחת בין הפולסים; לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-10,000 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את הפאזה העליונה למבחנה נקייה, הוסיפו 500 microliters של כלורופורם וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות נוספות. העבירו באמצעות פיפט 500 microliters מהפאזה העליונה למבחנות נקיות.הוסיפו שני נפחים של תמיסר קישור וליזיס (lysis binding buffer) וערבבו באמצעות פיפוט למעלה ולמטה. לאחר מכן, השתמשו בערכה לבידוד RNA כדי לבודד RNA כולל בהתאם לפרוטוקול היצרן, על מנת להסיר DNA מזוהם מה-RNA. הוסיפו 100 microliters של תערובת D a's one והדגירו בטמפרטורה של 15 עד 25 degrees Celsius למשך 20 עד 30 דקות.השתמש בערכה של RN a's כדי לשטוף את ה-RNA המנוקה ולבצע אלוציה לנפח של 50 microliter לצורך ביצוע תגובת an kneeling במבחנות PCR של 300 microliter. ערבב RNA כולל עם two microliters של random monomers והשתמש במים נקיים מנוקליאז במידת הצורך כדי להביא את הנפח ל-18 microliters. דגרי את תערובת ה-an kneeling בטמפרטורה של 70 degrees Celsius למשך חמש דקות.לאחר מכן, קררו את התגובות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ובצעו ספינ קצר לפני הנחת המבחנות על קרח למשך דקה אחת לפחות. כדי לבצע תעתוק הפוך ל-CDNA, הכינו את תערובת התעתוק ההפוך, שלבו 18 µL מהתערובת עם 12 µL של master mix והדגירו את התגובה בטמפרטורה של 42 °C למשך שעתיים עד 16 שעות. פלקו את ה-mRNA מהתגובה על ידי הוספה של 3 µL של 2.5 M NaOH והניחו אותה בטמפרטורה של 37 °C למשך כ-15 דקות.לאחר מכן, הוסף 15 µL של חומצה חופשית בריכוז 2 M כדי לנטרל את ה-NaOH. לאחר מכן, טהר את ה-cDNA באמצעות עמודי PCR cleanup, ומדוד את ריכוז ה-cDNA בעזרת ספקטרופוטומטר לצורך תיוג ה-cDNA. הוסף 5 µL של צבע AM-reactive ל-20 עד 60 ng/µL של cDNA.יש להניח את התערובת בחושך ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 60 עד 90 דקות, לפני שימוש בעמודי PR cleanup לטיהור ה-CDNA המסומן בצבע, תוך אלוציה ב-50 µL של elution buffer. בעזרת ספקטרופוטומטר, יש לוודא שריכוז ה-CDNA המסומן הוא לפחות 0.5 pmol/µL בנפח כולל של 50 µL. לאחר הכנת shy buffer, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לחמם מראש את הבאפר בטמפרטורה של 68 °C למשך לפחות 30 דקות. להכנת הדגימה, יש לשלב כמויות שוות של CDNAs מסומנים, ולאחר מכן להשתמש במרכזים בוואקום בטמפרטורה גבוהה כדי להפחית את הנפח ל-7 µL או פחות.בינתיים, כדי לנקות את ה-lifter slips להפחתת רעש הרקע, השתמשו בסבון ובשפע של מי ברז, ולאחר מכן ב-100% ethanol. לאחר ייבוש ה-lifter slips בנשיפת אוויר, הניחו אחד מהם על סלייד כאשר ציפוי ה-Teflon הלבן פונה כלפי מטה. לאחר מכן, המיסו את דגימות הצבע המיובשות ב-7 µL של H2O והדגירו בטמפרטורה של 94 °C למשך שתי דקות. הוסיפו מיד 35 µL של shy buffer שחומם מראש, ערבבו בעדינות וסובבו במהירות מקסימלית למשך דקה אחת.כדי להשקיע משקעים, חממו מראש את הפרובה בטמפרטורה של 68 °C למשך כחמש דקות לפני הטעינה. להרכבת השקופית וסרט ההרמה, הניחו את מחזיק שקופיות ההיברידיזציה על בלוק חימום בטמפרטורה של 50 °C. הניחו את שקופיות המיקרו-מערך של ה-DNA עם סרט ההרמה על מחזיק שקופיות ההיברידיזציה המחומם, וחממו מראש את השקופית עם סרט ההרמה למשך דקה אחת.לאחר מכן, הוסיפו במהירות רבה 40 µL של דגימת המטרה לקצה השקופית. אפשרו לנוזל לזרום בין משטחי הזכוכית באמצעות כוח קפילרי. כעת הוציאו את קסטת ההיברידיזציה שחוממה מראש מתנור ההיברידיזציה וסגרו את המכשיר.לאחר מכן, הניחו בקסטת ההיברידיזציה נייר סינון ספוג בשלושה מיליליטר של 2X SSC. הניחו בעדינות את מחזיק שקופיות ההיברידיזציה עם השקופיות בתוך קסטת ההיברידיזציה. סגרו את קסטת ההיברידיזציה, החזירו אותה לתנור ההיברידיזציה והדגירו למשך 16 עד 18 שעות.לשטיפת השקופיות, הכין תמיסורי שטיפה טריים 1, 2 ו-3, והצב אותם בטמפרטורה של 30 °C. כדי להבטיח שה-SDS ימומס עם סיום הדגירה, טבול בעדינות ובמהירות מרבית את השקופיות בתוך מבחרת פלקון (Falcon) הממולאת ב-50 milliliters של תמיסור שטיפה 1, עד שהזכוכית תישען על תחתית המבחנה. לאחר שפס הניתוק (lifter slip) שוקע לתחתית המבחנה מבלי לשרוט את המערך, השתמש בפינצטה כדי להוציא את השקופית ולהניח אותה במעמד של תחנת השטיפה.השתמש מיד ב-500 milliliters של wash buffer one לשטיפת השקופיות למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבר את השקופיות ל-wash buffer two למשך 20 עד 30 דקות, לפני העברתן ל-500 milliliters של wash buffer three למשך חמש דקות. לבסוף, ייבש את השקופיות במהירות של 2000 RPM למשך שתי דקות לפני ביצוע ניתוח microarray.בהתאם לפרוטוקול הטקסט לבדיקת ההשפעה של L-serine על כלל הטרנסקריפטום של S. pneumoniae, זן הפרא D 39, בוצע ניתוח מיקרו-מערך (microarray) של זן D 39 שגודל ב-CDM עם 150 µM של L-serine, בהשוואה לזן שגודל ב-10 mM L-serine באותו מצע. טבלה זו מפרטת את ריכוזי ה-RNA הכולל שבודדו מכל תרבית, כפי שמוצג באיור זה. לאחר הסרת ה-DNA, נבדקה איכות ה-RNA.שני הנתיבים הללו מייצגים RNA מ-150 micromolar Seine, ושני הנתיבים הללו הם מתרביות שגדלו עם 10 millimolar seine. נוכחותן של שני פסים ברורים מעידה על איכות טובה של ה-RNA. ריכוזי ה-CDNA שסונטזו מ-RNA כולל רשומים בעמודה זו, וריכוזי הדגימות המסומנות בצבע הריאקטיבי AM רשומים כאן.באיור זה מוצג ניתוח של תרשים פיזור עבור יחס הצבעים הרגישים הממוצע של ה-AM, והנתונים נותחו בהמשך כדי להפחית רעשים. טבלה זו מסכמת את תוצאות מחקרי המיקרו-מערך (microarray) לאחר החלת הקריטריונים של הבדל הגדול או השווה לפי שניים וערך P נמוך מ-0.001. כפי שניתן לראות כאן, מספר גנים ביטויים היו שונים בנוכחות מינימום L serin בהשוואה למקסימום בעקבות הליך זה.ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון בדיקות beag, electrocytes, QPCR, נוקאאוט ו/או עוצמת ביטוי כדי לענות על השאלות העולות לאחר פיתוחה. טכניקה זו אפשרה לחוקרי VFR בתחום הביולוגיה המולקולרית והתאית לחקור את רשתות הבקרה והמנגנונים ב-RAM חיובי.

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

סרטון זה מדגים את פעולת הנימים הרדיאלית הדיפרנציאלית של בדיקת ליגנד - טכניקה לסינון שיטתי בתפוקה גבוהה של נוקלאוטיד תוך-תאי חלבונים קושרי שליח שני. טכניקה זו מאפשרת קשירה ישירה של השליחים לחלבון המטרה בעל ביטוי יתר בליזט התא – תוך עקיפת הצורך בטיהור חלבונים.

פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד: טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי נוקלאוטיד חיידקי חלבונים תוך-תאיים קושרי שליח שני

סרטון זה מדגים בדיקת in vivo בחיידקים כדי לחקור את האינטראקציה של חלבונים קושרי RNA (RBPs) עם RNA. תאי החיידק מותמרים באמצעות שני מבני פלסמיד – פלסמיד באתר קשירה המקודד mRNA המכיל גן כתב פלואורסצנטי במורד הזרם של אתר קשירת RBP – בעוד פלסמיד RBP מבטא את חלבוני RBP תחת שליטתו של משרה. עם עלייה בתיווך המושרה בייצור RBP, ה-RBPs נקשרים ל-mRNA, וכתוצאה מכך דיכוי תרגומי של הכתב באמצעות עיכוב של קשירת ריבוזום.

כתב בדיקת דיכוי גנים לחקר רגולציה תרגומית של גן מטרה

כאן, אנו מציגים גישות פנומיות לאפיון פונקציונלי של גנים משוערים של פאג'ים. הטכניקות כוללות בדיקה מפותחת המסוגלת לנטר את חילוף החומרים האנאבולי של המארח, לוחות הבדיקה הרב-פנוטיפיים (MAPs), בנוסף לשיטה המבוססת של מטבולומיקה, המסוגלת למדוד השפעות על חילוף החומרים הקטבולי .

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

כרומטין immunoprecipitation בשילוב עם רצף הדור הבא (שבב-seq) היא שיטה המשמשת ליצירת אינטראקציות בין גורמי שעתוק ואת רצפי גנומי הם שולטים. פרוטוקול זה מתאר טכניקות עבור ביצוע שבב-seq עם ביומאמים חיידקיים, באמצעות סלמונלה בידור החיידק Typhimurium בקטריות כדוגמה.

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לסינתזה של תשואות גבוהות של חלבונים רקומביננטיים ממערכת תרגום שעתוק ללא תאים (TX-TL) של סטרפטומיצ'ס ונצואלה .

ערכת כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים

חקור שינויים טרנסקריפטומיים בחיידקים באמצעות מערכי DNA ותוכנה ייעודית. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר ואמין של ביטוי גנים ב-Streptococcus pneumoniae.

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב

גלה סרטונים נוספים