Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

בדיקות ממוספירה צפה יכולות לחקור את תת-הקבוצה של תאי סרטן שד דמויי גזע ששורדים בתנאי השעיה ומראים גידול משופר כאשר הם מושתלים בעכברים. פרוטוקול זה מספק מדד נוח במבחנה של יכולת יצירת כדור, פרוקסי לגידול in vivo, תוך הקלה על ניתוח נוף השעתוק הקשור לגבעול.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את שיעור התאים דמויי הגזע בתוך קו תאים סרטניים או דגימת רקמת גידול, ולהעריך את יכולתם להתחדש בעצמם לאורך מעברים עוקבים. לשם כך, קו תאים סרטני או רקמת גידול מעובד ליצירת תרחיף תא בודד, אשר לאחר מכן ממוין כדי לבודד תת-קבוצות תאיות חיוביות CD 44 ו-CD 24 שליליות. התאים נזרעים על לוחות חיבור נמוכים, נותנים זמן לצמיחה ואז נבדקים על ידי כדור מיקרוסקופ אור.

יעילות היצירה מכומתת על ידי קביעת מספר הכדורים שנוצרו ביחס למספר התאים שנזרעו במקור. התהליך של יצירת תרחיף תא בודד, המאפשר זמן לצמיחה וקביעת יעילות יצירת הכדור חוזר על עצמו לאורך מעברים עוקבים, ובסופו של דבר מספק מדד ליכולת התאים להתחדשות עצמית לאורך זמן. שיטה זו מספקת מבחן פרספקטיבה פשוט לזיהוי תאים המציגים תכונות פונקציונליות של תאי גזע כגון חידוש עצמי, כמו גם הערכה כמותית של מספר תאי הגזע המגיעים מגידולים in vivo.

עיקרון מרכזי של מבחני יצירת כדור הוא שכל כדור נגזר מתא בודד נמצא שם לשיבוט. מסיבות אלה, צפיפות התאים היא הפרמטר החשוב ביותר בבדיקה זו, מכיוון שיש לה השפעה קריטית על האליות עבודה מתחת למכסה המנוע של תרבית סטרילית. התחל הליך זה עם MCF 7 או MDA MB 2 3 1 תאים שהם 70 עד 80% קולואנטים.

שאפו את המדיום מהבקבוק, שטפו את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן הוסף טריפסין EDTA ודגירה במשך שתיים עד שש דקות לאחר כננת הניתוק על ידי הוספת מדיום כדור מאמוס המכיל 10% FBS. לאחר שהתאים התנתקו, העבירו אותם לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר וסובבו אותו 200 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסנה. לאחר מכן יש להשעות את התאים באחד עד חמישה מיליליטר של תווך מנוספרה, להניע פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לפרק את כדור התא. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים למסנן מכסה אימון תאים של 40 מיקרון ואספו את הזרימה דרך הצינור המצורף.

כדי להשיג תרחיף תא בודד, אני מלטף 20 מיקרוליטר של התאים המרחפים על ציטומטר המו ומשתמש במיקרוסקופ כדי לבחון אותו. אם נצפים אשכולות תאים כפי שניתן לראות כאן, השתמש במזרק כדי לעסות את המתלה פנימה והחוצה ממחט בגודל 25 פעם או פעמיים. לאחר שהתאים התפזרו לתרחיף תא בודד כפי שמוצג כאן, נסוג כדי לבודד תת-קבוצות תאיות שליליות CD 44 חיובי CD 24 באמצעות מקור תאים מופעל פלואורסצנטי או מקור תאים מופעלים מגנטיים.

השתמש בעמודת LS כדי לבחור באופן חיובי את התאים החיוביים של CD 44. מכיוון שהתאים הרצויים מחוברים לקירות עמודת ה- LS, השליכו את הזרימה דרכם ואז הסירו תאים מהעמודה. מרחו חמישה מיליליטר של חיץ ומרחו ולחצו על הבוכנה המסופקת עם העמודה כדי לשטוף את התאים הרצויים.

לאחר מכן, השתמש בעמודת LD כדי לטהר עוד יותר את האוכלוסייה על ידי בחירה שלילית. כאן התאים החיוביים CD 24 מחוברים לעמודות ה-LD. אסוף את הזרימה שדרכה מכיל את התאים השליליים CD 24.

לאחר מכן, באמצעות ציטומטריית זרימה, אשר את הפנוטיפים של כל התאים המבודדים. באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של Trian, חשב את צפיפות התאים ברי קיימא לאחר דילול מתאים של תרחיף התאים. זרע כל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של שש בארות עם 500 עד 4,000 תאים סנטימטר רבוע בשני מיליליטר של כדור מאמוס שלם. בינוני.

דגרו על הצלחות תוך הקפדה לא להפריע להן במשך חמישה עד 10 ימים עד שנצפו כדורים. המשיכו בתרבית עד שהכדורים בקוטר של לפחות 40 מיקרון אך עדיין לא התחילו להסתובב. אפופטוטי. השג רקמת סרטן שד אנושית ממטופלות העוברות ניתוח להסרת גידולי שד.

אחסן את הרקמה על קרח עד 24 שעות ב-50 מיליליטר. צינורות סטריליים ב-DMEM המכילים 100 יחידות למיליליטר, פניצילין ו-100 יחידות למיליליטר. סטרפטומיצין עובד מתחת למכסה מנוע סטרילי של תרבית רקמות.

העבירו את הדגימה לתבנית תרבית רקמה בגודל 100 מילימטר המכילה נפח קטן של מדיום בעזרת מספריים סטריליים, אזמל ופינצטה. הסר את רקמת השומן. מוסיפים שניים עד שלושה מיליליטר D-M-E-M-F 12 ובעזרת אזמל סטרילי או סכין גילוח, טוחנים את הדגימה עד שלא נשארות חתיכות גדולות.

ריסים מכופפים את חלקי הרקמה ו-10 מיליליטר של DMEM מחומם מראש המכילים אנזימים פרוטאוליטיים ומודגרים ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר סיבובי למשך שעה עד שלוש שעות. כאשר ערימת תאי גידול פרימטים ברי קיימא באמצעות אנזימי עיכול, יש פשרה קריטית בין מוות תאים לבין מיצוי מספיק מהמטריצה התאית ל-INS. ודא שההצלחה חיונית לניטור קבוע של עיכול זה כל חצי שעה, שפכו 20 מיקרוליטר של תרחיף על ציטומטר המו, והשתמשו במיקרוסקופ כדי להעריך את מידת העיכול.

לאחר השלמת העיכול. הניחו לשברים לשקוע למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את הסופינטה לצינור פוליפרופילן חרוטי בנפח 15 מיליליטר.

צנטריפוגה 200 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, יש לשפוך בזהירות את חומר השכיבה ולהשעות מחדש את התאים באחד עד חמישה מיליליטר של מדיום כדור ממוס. לאחר מכן הכן וצלח מתלים חד-תאיים כמתואר בסעיף הקודם.

בסרטון זה, בקשו מהתאים למעלה ולמטה דרך מזרק 25 מד לכל היותר פעמיים לפזר את התאים במידת הצורך. לאחר תקופת התרבית, התבונן בתאים בהגדלה פי 40 תחת מיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית. רכוש תמונות של חמישה שדות אקראיים.

לאחר שכל התמונות צולמו, השתמשו בתוכנת הרכישה כדי לקבוע את מספר המיקרוספירות שקוטרם עולה על 40 מיקרון. לבסוף, חישבו את יעילות יצירת המטאספרה על ידי חלוקת מספר כדורי הממו בכל באר במספר התאים שנזרעו בכל באר כפול 100, אני מהמר על המדיום המכיל את כדורי הממו מכל באר לצינור של 15 מיליליטר. שוטפים כל באר עם PBS ומוסיפים אותה למדיום שנאסף.

לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב -115 פעמים G למשך 10 דקות של טמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, השליכו את האנדרים הסופיים. השעו את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של דגירה מוקדמת של EDTA למשך שתיים-שלוש דקות.

לאחר הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטר FBS כדי לנטרל את הניסיון ואז צנטריפוגה ב-500 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר השלמת הסיבוב, השליכו את הסופינאט ושם סובבו את הכדור ב-100 מיקרוליטר של כדור מאמוס, פיפטה בינונית למעלה ולמטה כדי לפרק את כל הכדורים. שוב, בעזרת ציטומטר המו, ספרו את התאים וקבעו אם הם התפזרו לתרחיף תא בודד.

אם לא, העבירו אותם דרך מזרק 25 מד עד פעמיים כדי להשיג תאים בודדים, זרעו את התאים לאולטרה-נמוך חדש. קובץ מצורף שש, צלחת באר באותה צפיפות המשמשת בדור הראשוני לאחר חמישה עד 10 ימים, סופרים כדורים גדולים מ-40 מיקרון ומחשבים את יעילות יצירת הפחד כמו קודם כדי להעריך את יעילות יצירת הכדור. האטמוספרות גדלו מקו תאים אפיתל חיובי לאסטרוגן CF 7 ו-am מזנכימלי טריפל נגטיב MDA 2 3 1 כמתואר בסרטון זה, ספירות של כדורי ממו גדולים מ-40 מיקרון מספקות אומדן של יעילות יצירת הכדור עבור כל קו תאים.

שימו לב שצבירת היתוך התאים המינימלית שנראית כאן הושגה על ידי ציפוי בצפיפות נמוכה כאן ב-500 תאים לסנטימטר רבוע עבור MCF 7 ו-1000 תאים לסנטימטר רבוע עבור MDA 2 3 1. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל ולספור כדורי ממו שמקורם בשורות תאים שונות או מדגימות גידול כירורגיות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לזרוע תאים בצפיפות נמוכה כדי להבטיח שיבוט ולהבטיח ששיעור גבוה של תאים הם ברי קיימא בעת חילוץ תאים מדגימות כירורגיות.

בנוסף להליך זה, יש לבצע שיטות אחרות כמו אוכלוסיות תאי קסנוגרפט לעכברים מדוכאי חיסון על מנת לקבוע את הגניזם של הגידול in vivo של רקמות מעניינות.