Name: Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למדו את פרוטוקול Assay Mammosphere לבידוד תאי גזע מסרטן שד אנושי ולהערכת יכולת ההתחדשות העצמית שלהם. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור פוטנציאל התמורה של תאים בודדים בסביבה תלת-ממדית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הקיסרי BRC, המכון הלאומי לחקר בריאות, והפעולה נגד הסרטן עם אזכור מיוחד להילארי קרפט וסר דאגלס מאיירס.

ההנחיות המפורטות להלן אושרו על ידי אתית אימפריאל קולג &#39;, לונדון. 1. דור של Mammospheres הראשוני משורות תאי סרטן שד האנושי הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Mammosphere מדיה המכילה DMEM / F12 בתוספת L- גלוטמין 2 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, 100 U / סטרפטומיצין מיליליטר. הכן תקשורת מלאה מייד לפני השימוש על ידי הוספת 20 גורם ng / ml רקומביננטי צמיחת אפידרמיס האנושי (EGF; Sigma), 10 ng / ml גורם רקומביננטי אדם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF; מערכות R &amp; D) ותוספת 1x B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מבקבוק המכיל MCF-7 או מד&quot;א MB-231 תאים חסיד (או שורת תאי סרטן השד על פי בחירתך; 70-80 מפגש%), לשטוף פעמיים ב1x PBS, וtrypsinize תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG 200 בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תאי supernatant ו resuspend למזוג ב1-5 מיליליטר של תקשורת mammosphere. פיפטהלמעלה ולמטה ואם יש צורך להשתמש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג השעיה תא בודד. השתמש hemocytometer כדי להבטיח השעיה תא בודדת יצרה (אם לא, השתמש מחט 25 G למזרק ההשעיה התא עד 3 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם CD44 בודד הצורך + CD24- משנה סלולארי באמצעות FACS באמצעות אנטי CD24-Phycoerythrin (PE) ואנטי-CD44-והעמסת isothiocyanate (FITC) נוגדנים חד-שבטיים 9. לחלופין, לבודד אוכלוסייה כגון באמצעות תא-מגנטי הופעל מיון מערכת (MACS) עם אנטי CD44 וmicrobeads המשולב אנטי CD24 ביוטין לפי הוראות יצרן. לבצע סלקציה חיובית באמצעות LS עמודות, וסלקציה שלילית באמצעות עמודות LD ולאשר את פנוטיפים של כל התאים המבודדים על ידי cytometry זרימה 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר באמצעות trypan כחול. הערה: כדאיות תא מחושבת כמספר תאי קיימא מחולקים במספר הכולל של תאים בתוך הרשתות על hemocytometer. תאים שתופסים trypan כחול נחשבים לא-קיימא. ההליך הבא משמש כדי לקבוע שיעור של תאי קיימא בצורה מדויקת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.4% מtrypan הכחול בPBS. להוסיף 0.1 מיליליטר של פתרון מניות trypan הכחול עד 1 מיליליטר של תאים. לטעון hemocytometer ולבחון באופן מיידי תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. לספור את מספר התאים כולל ומספר תאי כתמי כחולים. תאי קיימא = [1.00 - (מספר התאים הכחולים ÷ מספר התאים כולל)] × 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר של תרבות, השתמש בנוסחא הבאה. זכור לתקן את הגורם לדילול. מספר תאי קיימא × 10 × 4 = 1.1 תאים / מיליליטר התרבות </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend סכום שנקבע מראש של תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת mammosphere מלאה בכל טוב של צלחת חסיד 6-גם נמוכה במיוחד. צפיפות הזריעה היא בדרך כלל 500-4,000 תאים / 2 סנטימטר תא בכל טוב. lo שימוש אופציונלי24 גם צלחות מצורפים w תוך זריעת תאים באותו הצפיפות ב 0.5 מיליליטר של תקשורת. הערה: אנו ממליצים אופטימיזציה של צפיפות זריעה ושעה של תרבות לכל שורות תאים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 6-גם צלחות נמוך במיוחד קובץ מצורף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5-10 ימים (בהתאם לקו התא ואת גודל mammospheres) מבלי להפריע לצלחות, במיוחד בשלב הצמיחה של 5 הימים הראשונים . </li></ol> 2. דור של Mammospheres הראשוני מדוגמאות קליניות לסרטן השד האנושי ניתן להשיג רקמת סרטן השד אנושית מחולים שעברו ניתוח להסרת גידולים בשד: הערה. רקמת חנות על קרח למשך עד 24 שעות בצינורות סטרילי 50 מיליליטר בתקשורת ובתרבות המכילות 100 U / ml פניצילין ו -100 U / ml סטרפטומיצין. בצע את השלבים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדגם לתוך צלחת פטרי רקמות 100 מ&quot;מ עם נפח קטן של תקשורת. Removדואר רקמת שומן באמצעות מספריים, scapel ופינצטה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2-3 מיליליטר של DMEM / F12 וברר את המדגם לתוך 1 מ&quot;מ 3 חתיכות עם scapel סטרילי או סכין גילוח עד שלא יישארו חתיכות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חתיכות רקמה במראש חימם DMEM 10 מיליליטר המכיל אנזימי מפרקי חלבונים (3000 U / collagenase מיליליטר ו -1000 U / hyaluronidase מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס שייקר סיבובי עד שכל שברי הרקמה מתעכלים. בדרך כלל עיכול שלם לוקח בין 1-3 שעות. התאם את זמן עיכול על פי תווים פתולוגית של גידולים. (לדוגמא אדנוקרצינומה השד היא בדרך כלל קשה יותר לעיכול בהשוואה לקרצינומה רִירָנִי שהוא שביר יותר וזקוק לזמן עיכול קצר יותר). להעריך את מידת העיכול בכל שעה וחצי על ידי התבוננות 20 השעיה μl תחת hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לברים למשקעים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant בצינור חרוטי 15 מיליליטר פוליפרופילן צנטריפוגות ב XG 200 עבור 10 דקות ב TEM החדרperature. למזוג בזהירות את תאי supernatant ו resuspend ב 1 - 5 מיליליטר של תקשורת mammosphere. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים שתוארו לעיל 1.1-1.4 לשורות תאים להשיג וצלחת השעיות תא בודדות. עובר תאים דרך 25 G מזרק מרבי של פי 2 במידת צורך להגביל תאי נזק. </li></ol> 3. Mammosphere יצירת יעיל (%) חישוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת התרבות, לספור את mammospheres (יותר מ 40 מיקרומטר) קוטר תחת מיקרוסקופ בהגדלה 40X. תמונה דיגיטלית 5 שדות אקראיים באמצעות מצלמה דיגיטלית במיקרוסקופ אור ולקבוע את גודל mammospheres באמצעות תוכנת הרכישה. השתמש בכל תמונת ניתוח תוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יעיל Mammosphere יצירת (% MFE) באמצעות המשוואה הבאה: MFE (%) = (# של mammospheres לכל טוב) / (# של תאי זרע בכל טוב) x 100 </li></ol> 4. Passaging הסידורי של Mammospheres להערכה של התחדשות עצמית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; פיפטה מדיה המכילה mammospheres מכל טוב לתוך צינור 15 מיליליטר. לשטוף את הבארות עם PBS ולהוסיף לתקשורת שנאסף. צנטריפוגה ב 115 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μl של 0.5% EDTA טריפסין / 0.2% מראש חימם. דגירה במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של FCS לנטרל טריפסין. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. בטל supernatant וגלול גלולים בתקשורת של mammospheres, pipetting עד 100 μl ולמטה כדי disaggregate תחומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer ולקבוע אם תאים בתרחיף תא בודד. אם לא תעבור דרך 25 G מזרק עד 3 פעמים כדי להשיג תאים בודדים. זרעי התאים לתוך צלחת אולטרה חדשה נמוכה מצורף 6-גם באותו הצפיפות בשימוש בדור העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5-10 ימים, לספור תחומים&gt; 40 מיקרומטר ולחשב את יעילות יוצרי תחום שימוש בנוסחא דווחה בעבר. </li></ol>

<ol><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB%2C+Lin28%2C+Let-7+MicroRNA%2C+and+IL6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li>
<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+current+status+and+evolving+complexities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: current status and evolving complexities.</a> Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).</li>
<li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+cancer+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm.</a> Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).</li>
<li>Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL6-mediated+suppression+of+miR-200c+directs+constitutive+activation+of+inflammatory+signaling+circuit+driving+transformation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis.</a> Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).</li>
<li>Chen, J., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li>
<li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li>
<li>Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li>
<li>Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Ginestier, C., Hur, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Liu, S., Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 
 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558</a> 1707-1710 (1992).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem+%2F+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells.</a> Genes Dev. , 1253-1270 (2003).</li>
<li>Ponti, D., Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).</li>
<li>Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+breast+cancer+stem+cells+by+knockdown+of+CD44%3A+promising+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy.</a> J Transl Med. 9 (1), 209(2011).</li>
<li>Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+in+breast+carcinoma+cell+lines+depends+upon+expression+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin.</a> PloS one. 8 (10), e77281(2013).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%E2%80%99t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+mammary+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of mammary gland stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Al-Hajj, M., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+solid+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and solid tumor stem cells.</a> Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).</li>
<li>Yu, F., Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((let-7+regulates+self+renewal+and+tumorigenicity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.</a> Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים שיכול להיתפס כפוגע בחוסר משוא הפנים של מאמר זה.

הערכה מוצלחת של mammospheres הראשוני והמשני מסתמכת על תאים שמצופים בצפיפויות נמוכות מספיק שmammospheres צורה משיבוטים אחד, עם צבירת תחום מינימאלית. עם זאת בצפיפויות נמוכות מדי, מעט מדי mammospheres עלול להיווצר להבחין את ההשפעות של טיפולים סטטיסטיים. צפיפות זריעה צריכה להיות מותאמת לשורת תאים כל שימוש שכן הם יכולים להשתנות במידה ניכרת ביעילות תחום יצירתם (אלה מבטאים E-cadherin הנמוך עלולים להיווצר תרבויות mammosphere טווח פחות יציבים וקצרות 18). שלב אופטימיזציה זו צריך ...

קיומם של שושלות תאים הסרטניים בראשותו של תאי גזע סרטני כמו גזע הוסיף רב להבנת ההטרוגניות גידול שלנו. בעוד קצת גיוון פנוטיפי בגידולים אין נובע מהתולדה המשובט של שיבוטים גנטיים שונים, רכיב מהותי מופיע לנבוע מהבדלים אפיגנטיים: תאים סרטניים יכולים לעבור (לפעמים הפיך) בין גזע, אב, ומדינות מובחנות באמצעות הפעלה או דיכוי של גן ספציפי תוכניות ביטוי 1-3. זה עשוי לשקף גורמים פנימיים או חיצוניים תא, המשקף את תכנית ביטוי גנים בימים אלה באים לידי ביטוי בתא עם איתות autocrine התוצאה שלה בשילוב עם המנגנון פאראקריני משכנות סרטן, סטרומה או תאי מערכת חיסונית ומספק גורמי modulatory, ותנאי microenviromental כגון מידת היפוקסיה 2,4,5. למרות גישות שושלת התחקות חדשניות<html> מתקדמים את היכולת שלנו ללמוד תאי גזע סרטני משוערים בנישה שלהם in vivo 6-8, מבחני יוצרי תחום להישאר גישה פופולרית ונוחה להעריך את הפוטנציאל של תאי סרטן השד להתנהג כמו תאי גזע, לפחות בתנאי assay בשימוש. הוא משמש לעתים קרובות לצד שיטות רטרוספקטיבית לתאי גזע סרטני טיהור, על ידי הביטוי שלהם CD44 סמני קרום ו -9 CD24, ורמת הפעילות של ALDH (dehydrogenase אלדהיד) האנזים 10, סמנים שהוצעו למתאימים ליותר mesenchymal- ואפיתל תאי גזע סרטני דמויים בהתאמה 11. גישת היווצרות הכדור פותחה לראשונה כassay neurosphere, מה שמאפשר את הצמיחה של תאי גזע המשוערת משיבוטים בודדים בתנאים שאינם חסיד, סרום חופשיים עם התוספת של גורם גדילת אפיתל (EGF) 12, לאחר מכן מיושם מועיל למצב נורמלי וסרטני רקמות שד. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; הזהות של תא מייסד יוצרי תחום, וסוגי התאים המעורבים המרכיבים את מסת הכדור, רלוונטיים למסקנות שיכולות להיות עשויה מmammo-, או-תחום אחר להרכיב מבחני. תאים לטווח ארוך עצם שקט בתום גזע, חשבו לנוח בשלב G0, לא תוכל לחוות את השילוב המדויק של גורמים שהיה מעדיפים הפעלה in vivo. Assay mammosphere במקום מאפשר את הצמיחה של תאים או בכוננות חלוקת mitotic או שכבר חילקו 13. אבות אלו, אם כי לא תא באמת שקט, עשויים להיות שלב התא שמתרבה עם mitogens EGF וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) המשמשת בassay. אף על פי כן, הם מכילים מגוון של האיתות הקשורים בתאי גזע מופעל מסלולים מ-14. בנוסף, קצב היווצרותם מתייחס לtumorigenicity של הרקמות שנלקחו מ, כשהיא נמדדת בעצמה שלהם במבחני דילול מוגבלים בxenografts עכבר 2,15,16 &lt;/ Sup&gt;. כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבודד תאים בודדים וליצור mammospheres עיקרי משני קווים אנושיים סרטן שד תא ודגימות קליניות של גידולים בשד. אנו גם מתארים כיצד לבצע קטעים סידוריים של mammospheres העיקרי להעריך התחדשות עצמית, וכיצד לחשב תחום יצירת יעילות המאפשרת השוואה בין צפיפות זריעה שונה (ראה תכנית באיור 1).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"מ L-גלוטמין</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml פניצילין & סטרפטומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF)</td><td>R& D systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x תוסף B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0.5% טריפסין/0.2% EDTA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>First Link בריטניה</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות חיבור נמוכות</td><td>קורנינג</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 1A</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח סטריליים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>אזמל סטרילי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-דיסקציה סטרילית מספריים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

assay גיבוש mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

בדומה לרקמות בריאות, רב דם ומחל ממאירות סולידיות עכשיו חשבו להיות מאורגן באופן היררכי, עם תת-קבוצה של תאי סרטן כמו גזע שעצמי לחדש-בזמן והוליד צאצאים מובחנים יותר. הבנה ומיקוד תאים אלה גזע סרטני בסרטן השד, אשר עשוי להחזיק chemo- משופר והרדיו-התנגדות בהשוואה לגידול בכמות גדולה אינו גזע, הפכה אזור חשוב מחקר. סמנים כוללים CD44, CD24, ופעילות ALDH ניתן להעריך באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד מכאן ולהבא תאים המציגים tumorigenicity משופר כאשר מושתלים לעכברי מדוכאי חיסון: גם assay mammosphere הפך בשימוש נרחב ביכולתה לזהות sphere- למפרע יצירת תאים המתפתחים משיבוטים כמו תא גזע בודד. כאן אנו מתארים גישות לculturing המתאים של mammospheres משורות תאים או דוגמאות מטופל עיקריות, passaging, וחישובים להעריך f תחוםיעילות orming (SFE). ראשית עלינו לדון בשיקולים מרכזיים ואת חסרונות בתכנון ובפרשנות של ניסויי mammosphere המתאימים.

מדגמים שונים או אלה נתון לטיפולים שונים עשויים להשתנות במספר mammospheres&gt; 40 מיקרומטר היוצרים לאחר נרמול לתאים ראשוניים שנזרעו. לחשב את יעילות mammosphere להרכיב (MFE) עבור כל טיפול גדל בשלושה עותקים. זה מאפשר ניסויים עם צפיפות זריעה שונה להשוואה. הנתונים מוצגים הטוב ביותר בגרף עמודות, באופן אידיאלי עם בקרות חיוביות ושליליות, ובו מוצגות סטיית התקן פני הבארות בשלושה עותקים. באופן עקבי להעביר תאים חסיד לתוך צלחות שאינן חסיד במפגש בין 60-80%. ספירת תאים זהירה היא חיונית לכימות במ...

בדיקות ממוספירה צפה יכולות לחקור את תת-הקבוצה של תאי סרטן שד דמויי גזע ששורדים בתנאי השעיה ומראים גידול משופר כאשר הם מושתלים בעכברים. פרוטוקול זה מספק מדד נוח במבחנה של יכולת יצירת כדור, פרוקסי לגידול in vivo, תוך הקלה על ניתוח נוף השעתוק הקשור לגבעול.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את פרופורציית התאים דמויי הגזע בתוך שורת תאי סרטן או דגימת רקמת גידול, ולבחון את יכולתם להתחדשות עצמית לאורך מעברים עוקבים. לשם כך, שורת תאי סרטן או רקמת גידול מעובדות ליצירת תרחיף של תאים בודדים, אשר מומיין לאחר מכן כדי לבודד תתי-אוכלוסיות תאיות חיוביות ל-CD 44 ושליליות ל-CD 24. התאים נזרעים בצלחות בעלות הידבקות נמוכה, ניתן להם זמן לצמיחה, ולאחר מכן נבדקים באמצעות מיקרוסקופיית אור לבחינת ספירות.יעילות היצירה מכומתת על ידי קביעת מספר הספירות שנוצרו ביחס למספר התאים שנזרעו במקור. התהליך של יצירת תרחיף תאים בודדים, מתן זמן לצמיחה וקביעת יעילות יצירת הספירות חוזר על עצמו לאורך מעברים עוקבים, ובסופו של דבר מספק מדד ליכולתם של התאים להתחדשות עצמית לאורך זמן. שיטה זו מספקת בדיקת פרספקטיבה פשוטה לזיהוי תאים המפגינים תכונות תפקודיות של תאי גזע, כגון התחדשות עצמית, וכן הערכה כמותית של מספר תאי הגזע המגיעים מגידולים in vivo.עיקרון מרכזי של בדיקות יצירת ספירות הוא שכל ספירה נגזרת מתא בודד ולכן היא קלונאלית. מסיבות אלו, צפיפות התאים היא הפרמטר החשוב ביותר בבדיקה זו, מכיוון שיש לה השפעה קריטית על התוצאה. עבדו תחת מנדף תרבית סטרילי. התחילו את ההליך עם תאי MCF-7 או MDA-MB-231 הנמצאים ב-70% עד 80% התמלאות (confluence).שאבו את המצע מהבקבוק, ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן הוסיפו tripsin EDTA והדגירו למשך שתיים עד שש דקות; לאחר ההיפרדות, נטרלו את הפעולה על ידי הוספת מצע mammos sphere המכיל 10%FBS. ברגע שהתאים היפרדו, העבירו אותם לשפופרת צנטריפוגה קונית של 15 מיליליטר וסבבו ב-200 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר הצנטריפוגציה, שפכו את הנוזל העליון. לאחר מכן, השעיו מחדש את התאים ב-1 עד 5 מיליליטר של מצע manosphere, ובצעו פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לפרק את משקע התאים. בשלב הבא, העבירו את תגלי התאים דרך מסנן סינון תאים של 40 מיקרון ואספו את התסנין למבחנה המחוברת.כדי להשיג סספנסיות של תאים בודדים, אני מטפטף מנה של 20 µL מהתאים שהחזרו לסספנסיה אל תוך המוציטומטר ומשתמש במיקרוסקופ כדי לבחון אותה. אם נצפים צבירי תאים כפי שרואים כאן, יש להשתמש במזרק כדי למעוך את הסספנסיה פנימה והחוצה ממחט בכילוי (gauge) 25 פעם אחת או פעמיים. לאחר שהתאים התפזרו לסספנסיה של תאים בודדים כפי שמוצג כאן, ניתן לבצע בידוד של תתי-אוכלוסיות תאים חיוביות ל-CD44 ושליליות ל-CD24 באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) או מיון תאים מופעל מגנטית (MACS).השתמש בעמודת LS כדי לבצע סלקציה חיובית של תאי CD 44 חיוביים. מכיוון שהתאים הרצויים נצמדים לדפנות עמודת ה-LS, השלך את תסמיך הזרימה (flow through), ולאחר מכן הוצא את התאים מהעמודה. הוסף 5 mL של בופר והפעל את הבוכנה המצורפת לעמודה כדי לשטוף החוצה את התאים הרצויים.בשלב הבא, השתמש בעמודת LD כדי לטהר עוד יותר את האוכלוסייה באמצעות סלקציה שלילית. כאן, התאים החיוביים ל-CD 24 נצמדים לעמודות ה-LD. אסוף את התוצר העובר (flow through) המכיל את התאים השליליים ל-CD 24.בשלב הבא, השתמש בציטומטריה של זרימה (flow cytometry) כדי לאשש את הפנוטיפים של כל התאים שהבודדו. באמצעות שיטת הדחייה של Trypan blue, חשב את צפיפות התאים החיים לאחר דילול מתאים של תגלי התאים. זרע בכל באער של פלטת שש באערים בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultralow attachment plate) בין 500 ל-4,000 תאים לסמ"ר בשני מיליליטר של מצע גידול מלא ל-mammospheres.דגרו את הצלחות תוך הקפדה לא להפריע להן במשך חמישה עד 10 ימים עד להופעת ספרואידים. המשיכו בטיפוח עד שהספרואידים יגיעו לקוטר של לפחות 40 microns אך טרם יתחילו להפוך לאפופטוטיים. השגיו רקמת סרטן שד אנושית ממטופלים העוברים ניתוח להסרת גידולי שד.יש לאחסן את הרקמה על קרח למשך עד 24 שעות במבחנות סטריליות של 50 milliliters עם DMEM המכיל 100 units per milliliter penicillin ו-100 units per milliliter streptomycin, תוך עבודה תחת מנדף סטרילי לתרביות רקמה.העבירו את הדגימה לתוך צלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר המכילה נפח קטן של מצע, באמצעות מספריים סטריליים, סכין מנתחים ופינצטה. הסירו את רקמת השומן. הוסיפו שני עד שלושה מיליליטר של D-M-E-M-F 12 ובאמצעות סכין מנתחים סטרילית או להב תער, קצצו את הדגימה עד שלא יישארו חתיכות גדולות.מעבירים את פיסות הרקמה ל-10 milliliters של DMEM שחומם מראש ומכיל אנזימים פרוטאוליטיים, ומדגירים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך שייקר סיבובי למשך שעה אחת עד שלוש שעות. בעת בידוד תאי גידול חיוניים של פרימטים באמצעות אנזימים מעכלים, קיים איזון קריטי בין מוות תאי לבין חילוץ מספיק מהמטריקס התאי. כדי להבטיח הצלחה, חיוני לנטר את העיכול באופן קבוע. מדי חצי שעה, מעבירים בפיפט 20 microliters מהתמיה למספר תאים (hemocytometer), ומשתמשים במיקרוסקופ כדי להעריך את מידת העיכול.עם השלמת העיכול, יש להמתין חמש דקות לשקיעת הפרגמנטים. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה קונית מפוליפרופילן בנפח 15 milliliters.סבבו בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, שאבו בזהירות את הנוזל העליון ותלו את התאים ב-1 עד 5 מיליליטר של מצע לגדל ממוספירות (mammosphere medium). לאחר מכן, הכינו וזרוו תרחיפי תאים בודדים כפי שמתואר בסעיף הקודם.בשלב זה, יש להעביר את התאים מעלה ומטה באמצעות מזרק בכילייג' 25 עד פעמיים לכל היותר כדי לפזר את התאים במידת הצורך. לאחר תקופת התרבית, יש לבחון את התאי בהגדלה של 40 גדלים תחת מיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית. יש לרכוש תמונות של חמישה שדות אקראיים.לאחר שכל התמונות צולמו, השתמש בתוכנת הרכישה כדי לקבוע את מספר המיקרוספרות שקוטרן גדול מ-40 microns. לבסוף, חשב את יעילות היווצרות המטאספרות על ידי חלוקת מספר המאמוס-ספרות בכל באר במספר התאים שנזרעו בכל באר, והכפל ב-100. העבר את המצע המכיל את המאמוס-ספרות מכל באר לשפופרת של 15 milliliter. שטוף כל באר ב-PBS והוסף אותו למצע שנאסף.לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-115 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, השליכו את הנוזל העליון. השעו את המשקע ב-500 µL של trypan-EDTA שחומם מראש והדגירו למשך שתי עד שלוש דקות.לאחר הדגירה, יש להוסיף 500 µL של FBS כדי לנטרל את ה-trypsin ולאחר מכן לסבב במצנטריפוגה במהירות של 500 ×g למשך חמש דקות. עם סיום הסבב, יש להשליך את העלייה (supernatant) ולשסע את המשקע ב-100 µL של mammosphere medium, ולבצע פיפטור למעלה ולמטה כדי לפרק ספרואידים. שוב, באמצעות המוציטומטר (hemocytometer), יש לספור את התאים ולקבוע אם הם התפזרו לתליה של תאים בודדים.אם לא, העבירו אותם דרך מזרק בכילייב (gauge) 25 עד פעמיים כדי לקבל תאים בודדים, והזרעו את התאים לפלטה חדשה בעלת 6 בארות עם ציפוי למניעת היצמדות (ultralow attachment) באותה צפיפות ששימשה בדור הראשוני. לאחר 5 עד 10 ימים, ספרו ספירות הגדולות מ-40 microns וחשבו את יעילות יצירת הספירות כפי שנעשה קודם לכן כדי להעריך את יעילות יצירת הספירות. ממוספירות גודלו משורת תאים אפיתליאלית עם ביטוי של רצפטור לאסטרוגן CF7 ומשורת תאים מזנכימלית טריפל-נגטיב MDA 2 3 1 כפי שמתואר בסרטון זה; ספירה של ממוספירות הגדולות מ-40 microns מספקת הערכה של יעילות יצירת הספירות עבור כל שורת תאים.שימו לב כי צבירת מיזוג התאים המינימלית שנראית כאן הושגה באמצעות זריעה בצפיפות נמוכה של 500 תאים לסנטימטר רבוע עבור MCF7 ו-1000 תאים לסנטימטר רבוע עבור MDA-MB-231. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מגדלים וסופרים mammo spheres המופקים מקווי תאים שונים או מדגימות גידולים כירורגיים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לזרוע תאים בצפיפויות נמוכות כדי להבטיח קלונליות, ולוודא ששיעור גבוה של תאים הוא חיוני בעת הפקת תאים מדגימות כירורגיות.בנוסף להליך זה, יש לבצע שיטות אחרות, כגון השתלת אוכלוסיות תאים כקסנוגרפט (xenograft) לעכברים עם מערכת חיסון מודכאת, וזאת כדי לקבוע את הגנוגניות הגורמת לגידולים (tumor genicity) in vivo של הרקמות הנבדקות.

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

HC11 בידול lactogenic יכול להיות מאופיין על ידי היווצרות של מבנים כיפה המכונה mammospheres. מבנים ניתן המנויים על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לסייע לכימות בידול lactogenic.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

סרטון זה מתאר בידוד תאי גזע סרטניים משורות תאי סרטן השד. אנו מגדלים תאי גזע סרטניים אלה כדי ליצור ממוספרות ראשוניות להערכת התחדשות עצמית ולחישוב יעילות יצירת הכדורים, מה שמאפשר השוואה בין צפיפויות זריעה שונות.

יצירת ממוספרות ראשוניות: טכניקה לקביעת עוצמת התא

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

כאן אנו מתארים את המודל והגישה לחקר הפונקציות של מקרופאגים מכתשית ריאתית בגרורות סרטניות. כדי להדגים את תפקידם של תאים אלה בגרורות, נעשה שימוש במודל הסינגני (4T1) של סרטן השד בשילוב עם דלדול המקרופאגים המכתשית עם ליפוזומים קלודרונאטיים.

לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

כאן אנו מתארים את ההטמעה והפרשנות של התוצאות של שיטת ההתחדשות הכמותית העצמית של ממוגרפיה.

קוונפיקציה של התחדשות עצמית בתרבויות מורנה במוספירה

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הבידוד של BCSCs מדגימות תאים ורקמות של סרטן השד, כמו גם את מבחני in vitro ו - in vivo שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של BCSC.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרופיזיולוגית במבחנה לחקר סרטן השד באמצעות רקמת שד אנושית ראשונית עם חומרי מדף.

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

פרוטוקול זה מתאר את השיטה להקמת מבחן היווצרות הממוספירה לחקר גזע סרטן שנגרם על ידי מעכב אפופטוזיס 5 (Api5) בתאי אפיתל שד שאינם גידוליים. ליזטים שנאספו מממוספירות דור ראשוני מנותחים לסמנים שונים של גבעול כדי להעריך את השראת תכונות דמויות תאי גזע.

בדיקת ממוספירה חושפת גבעול מושרה על ידי API 5 בקווי תאים אפיתליים של השד שאינם גידוליים

למדו את פרוטוקול Assay Mammosphere לבידוד תאי גזע מסרטן שד אנושי ולהערכת יכולת ההתחדשות העצמית שלהם. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור פוטנציאל התמורה של תאים בודדים בסביבה תלת-ממדית.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

גלה סרטונים נוספים