Name: ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: חקור מנגנוני דה-מיאלינציה ורמיאלינציה בעמוד השדרה של עכברים באמצעות הזרקת ליזולציטין. שיטה זו מאפשרת לבחון תהליכי תיקון ולסנן תרופות פוטנציאליות לטיפול במחלות מיאלין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי מענק מהאגודה לטרשת נפוצה של קנדה ותוכנית Alberta Innovates - Health Solutions CRIO Team. MBK זכתה במלגות לימודים מ-Alberta Innovates - Health Solutions ו-The Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ ממומן על ידי מענק תמיכה לסטודנטים לתארים מתקדמים ממרכז המחקר וההכשרה האזורי של אלברטה אנדMS של האגודה לטרשת נפוצה של קנדה. המחברים מבקשים להודות לד"ר יאן ואן מינן וליחידת ההתחדשות בנוירוביולוגיה על ההכשרה והשימוש בציוד.

<ol><li>Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+the+spinal+cord+of+the+cat+following+intraspinal+injections+of+lysolecithin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin.</a> J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).</li>
<li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+mouse+spinal+cord+axons+demyelinated+by+local+injection+of+lysolecithin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin.</a> J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+Schwann-cells+into+the+spinal-cord+of+rat+following+local+injections+of+lysolecithin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).</li>
<li>Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+occurs+as+extensively+but+more+slowly+in+old+rats+compared+to+young+rats+following+gliotoxin-induced+CNS+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination.</a> Glia. 28 (1), 77-83 (1999).</li>
<li>Patrikios, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+is+extensive+in+a+subset+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).</li>
<li>Keough, M. B., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+therapy+for+multiple+sclerosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Remyelination therapy for multiple sclerosis).</a> Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).</li>
<li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+injections+of+lysophosphatidyl+choline+into+white+matter+of+the+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord.</a> J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).</li>
<li>Miron, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+microglia+and+macrophages+drive+oligodendrocyte+differentiation+during+CNS+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.</a> Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).</li>
<li>Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+impairs+oligodendrocyte+remyelination+following+lysolecithin-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination.</a> Glia. 35 (3), 202-212 (2001).</li>
<li>Lau, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycans+in+demyelinated+lesions+impair+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination.</a> Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).</li>
<li>Fancy, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+Wnt+pathway+inhibits+timely+myelination+and+remyelination+in+the+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS.</a> Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Skihar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+oligodendrogenesis+and+myelin+repair+using+the+multiple+sclerosis+medication+glatiramer+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-responsive+neural+precursors+give+rise+to+myelinating+oligodendrocytes+after+transplantation+into+the+spinal+cords+of+contused+rats+and+dysmyelinated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice.</a> Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).</li>
<li>Chong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+inhibitor+Nogo-A+establishes+spatial+segregation+and+extent+of+oligodendrocyte+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).</li>
<li>Sturrock, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+the+mouse+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Myelination of the mouse corpus callosum.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).</li>
<li>Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+dynamics+in+the+healthy+adult+CNS%3A+evidence+for+myelin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling.</a> Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).</li>
<li>Woodruff, R. H., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+and+remyelination+of+the+caudal+cerebellar+peduncle+of+adult+rats+following+stereotaxic+injections+of+lysolecithin%2C+ethidium+bromide%2C+and+complement%2Fanti-galactocerebroside%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study.</a> Glia. 25 (3), 216-228 (1999).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+assays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Powers, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+reporter+reveals+prolonged+refinement+of+spontaneously+regenerated+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).</li>
<li>Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+remyelination+restores+secure+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Central remyelination restores secure conduction.</a> Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).</li>
<li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotor+deficits+induced+by+experimental+spinal+cord+demyelination+are+abolished+by+spontaneous+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination.</a> Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).</li>
<li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מספר המודלים של בעלי החיים פותחו ללמוד MS, רוב recognizably המודל הניסיוני Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE). בEAE, מכרסמים הם חוסנו נגד שבר של פפטיד המיאלין ועוברים התפתחות נגע דלקתית המתבטאת בשיתוק עולה. בעוד מודל זה היה שימושי עבור בדיקות פרה-קליניות של תרופות טרשת נפוצה המערכת החיסונית, זה לא אידיאלי ללימוד חידוש יצירת המיאלין משלוש סיבות עיקריות: ראשית, המיקום של נגעים דלקתיים הוא אקראי במידה מסוימת, ואיתור נגעים בעת עיבוד רקמות ללמחצה או ultrathin חלקים יכולים להיות מאתגרים. השני הוא שחידוש יצירת המיאלין מתרחש על פני כמובן זמן מסוים, והגיל של נגע EAE אחת המדויק לא ניתן לדעת בלי הדמיה מגנטית לא פולשנית מתמשכת תהודה. השלישי הוא שחידוש יצירת המיאלין הוא תופעה מתרחשת באופן טבעי במכרסמים, וראיה לחידוש יצירת המיאלין הבאה טיפול תרופתי בEAE לא יכולה להיות תוצאה העיקרית של התרופה, אבל בסטיד תופעה משנית של הפחתת דלקת. שיטה נפוצה נוספת של ייצור demyelination מושגת על ידי החדרת cuprizone chelator הנחושת בתזונה. כתוצאה מכך demyelination הנרחב, בעיקר בכפיס המוח. יש מגבלות בלימוד כפיס המוח כאתר של חידוש יצירת המיאלין מהסיבות הבאות: ראשית, קטרי האקסון (ובכך עובי המיאלין) הם קטנים יותר מאשר אזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, ונדנים כך remyelinated דק יכולים להיות שאין להבחין בין אלה שאף פעם לא היו demyelinated. שנית, משום שכפיס מוח העכבר מכיל אקסונים unmyelinated&gt; 70% 16, זה יכול להיות לא ברור אם קטע remyelinated הוא תיקון אמיתי של המיאלין נפגע או דה נובו סינתזת המיאלין במבוגרים, אשר מתרחש בדרך כלל 17. זה האמונה שלנו שהמודל הטוב ביותר ללימוד חידוש יצירת המיאלין הוא ההזרקה הישירה של רעלים, או lysolecithin, ethidברומיד ium, או אחר, לpeduncles הזנב המוחית 18 או חומר לבן בחוט השדרה. המיקום לשעבר מושגת רק על ידי הזרקת stereotactic 3-ממד מדויק, ומוגבל למכרסמים גדולים יותר (חולדות) בשל גודלו הקטן של peduncles המוח הקטן. זה אינו כולל את המשאב הנרחב של עכברים הטרנסגניים בלימוד דה וחידוש יצירת המיאלין. חוט השדרה, לעומת זאת, מכיל קטעים רבים גדולים חומר לבנים כי הם בקלות בניתוח נגיש. רווחים בין החוליות במגזר החזה מקורי מאפשרים חשיפה של חוט השדרה ללא הצורך בlaminectomy, אשר הוא צעד הכרחי בפרוצדורות כירורגיות בבית חזה הזנב. יתרון של מיקוד ספציפי בחומר לבן הגחון הוא שהאקסונים הם אחיד יותר גדולים מהחומר לבן גב, מה שהופך את הכימות של חידוש יצירת המיאלין פחות מעורפל משימה דומה לאתגרים הקשורים בכפיס המוח. בנוסף, החומר לבן הגחון מפצה t הרבה יותר גדולarget אזור להזריק; כמה מאה מיקרונים רוחבי באזור הגב יעמידו את הנימים מחוץ לטור, ואילו באותו הסטייה ventrally עדיין לייצר נגע demyelinating בולט. פרוטוקולים כמה להזריק lysolecithin לשני הגב וגחון עמודות של אותה החיה 19. זה יכול להגדיל הן את הסבירות למיקום נימים נכונה ומספר הנגעים לכימות בפחות בעלי חיים. בעוד שהנתונים הנוכחיים המוצגים הנו מבעלי חיים ישנים 8-10 שבוע בזמן של פעולה, גם היה לנו הצלחה באותו אופן על עכברים ישנים 8-10 חודשים, שבו חידוש יצירת המיאלין מתואר כניכר איטי 4. כימות של חידוש יצירת המיאלין היא לא התחייבות של מה בכך. דוגמה מרכזית טוענת כי מגזרי remyelinated הם קצרים יותר באורך ודק יותר בממוצע מאשר עמיתיהם הבריאים, ולכן חישובי g-יחס (בקוטר האקסון מחולק בהאקסון + קוטר מיאלין) של חתך רוחב-למחצה oסעיפי Ultrathin r הפכו הליך סטנדרטי. עם זאת, ידוע כי מגזרי remyelinated לעבות לאורך זמן 2 ומחקר שנערך לאחרונה באמצעות כתב מהונדס של oligodendrocytes remyelinating עולה כי internodes רב הפך סופו של הדבר שאין להבחין בין שליטה 20. כימות מספר oligodendrocytes הבוגרת בתוך הנגע היא דרך עקיפה למדידת תיקון, כoligodendrocytes מסוגלת לעשות מספר רחב של internodes, וחלק משמעותי במודל בהתאם-חידוש יצירת המיאלין משומש יכול להתרחש מתאי שוואן 3. כמובן, כמו חידוש יצירת המיאלין נקשר לשיקום הולכה הקופצנית 21, המדד האולטימטיבי של תיקון יהיה התאוששות תפקודית של גירעונות נוירולוגיות. בעוד חידוש יצירת המיאלין נקשר להתאוששות של תפקוד בכמה מינים 22,23, זה לא הפך הליך סטנדרטי במחקרי lysolecithin עכבריים. זה כנראה עקב חוסר observ הגלויגירעונות מסוגלים מנגעים או הגבי או הגחון, בהשוואה לדגמי demyelination חזקים יותר כגון EAE ואפילו cuprizone. אנו מאמינים כי ליקויים תפקודיים הנובעים מlysolecithin הזרקה, והתאוששות שלאחר מכן עם חידוש יצירת המיאלין, יהיו רק נצפים באמצעות בדיקות רגישות של תפקוד הסנסורית בסדר. חיפוש PubMed של &quot;חידוש יצירת המיאלין&quot; לצד אחד מהמודלים של בעלי החיים המפורטים לעיל, אם כי גישה מתודולוגית גסה, תערוכות להיטי חיפוש פחות לlysolecithin (109) בהשוואה לEAE (188) וcuprizone (197). אם הטענה שלנו שlysolecithin demyelination הוא הגישה מעולה ללימוד חידוש יצירת המיאלין, למה זה דן לפחות? אולי חשש לשימוש בשיטה זו נובע מאמונה של קושי טכני בביצוע הפעולה כירורגית. למעשה, הליך זה הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ואין קשה יותר מנתיחת רקמה שגרתית, הדורש חומרים שהם כל commerזמין בייחוד-. תקוותנו הוא כי פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור אלה שרוצים להוסיף מודל זה חזק לרפרטואר שלהם ללימוד תחום המרתק והרחבת של תיקון המיאלין.

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה כרונית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירת תאים חיסונית ושלטים המכילים איבדו המיאלין, oligodendrocytes, אקסונים ותאי עצב. רוב החולים מהלך מחלה מורכב מהתקפים דלקתיים מלווים במגוון רחב של תסמינים נוירולוגיים, ואחריו תקופות של הפוגה. למעלה ממחצית חולים אלו סופו של דבר לעבור לשלב מתקדם משניים ללא הישנות לכאורה אך ירידת נוירולוגית מתמשכת. הוא האמין כי ההידרדרות מתקדמת וזאת בשל נזק ואובדן axonal, תרם בחלקו על ידי demyelination הכרוני. אסטרטגיות כדי לשחזר מיאלין שאבד הם וכך נחשבים גישת טיפול מבטיחה לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים. חידוש יצירת המיאלין היא תגובת תיקון אנדוגני במערכת העצבים המרכזית לפיה נדני המיאלין חדשים שנוצרו מתאי מבשר oligodendrocyte גויסו(OPCs) שלהתמיין oligodendrocytes יוצרי מיאלין. חידוש יצירת המיאלין הוכח במודלים של בעלי חיים כדי להיות די חזק 1-3, לעומת זאת, היעילות שלה יורדת עם גיל 4. ואכן, חידוש יצירת המיאלין מתרחשת בבני אדם למרות שהוא לא שלם ברוב המכריע של חולי טרשת נפוצה 5. כל התרופות זמינות כעת עבור MS בעיקר למקד את הרכיב חיסוני החריג של המחלה, ובעוד יעילים בהפחתת התקפים, לא במידה ניכרת לעכב את התקדמות מחלה. הדור הבא של אסטרטגיות טיפוליות לניהול MS ישלב התקדמות בתפקוד מערכת חיסון עם השיפור של חידוש יצירת המיאלין אנדוגני כדי למנוע הישנויות שני והתקדמות 6. שיטה אחת ללמוד דה וחידוש יצירת המיאלין במערכת העצבים המרכזית כרוכה בהזרקה הישירה של חומר הניקוי lysophosphatidylcholine (lysolecithin) ל1,3,7 חומר לבן בחוט השדרה. הליך זה מייצר demyelinat מאופיין היטבing פציעה מורכב בעיקר של מקרופאג / חדירת microglial והפעלה 8,9, astrogliosis תגובתי, ההפרעות של הומאוסטזיס axonal / פציעת axonal, והתפשטות OPC והגירה 10. הנגע צפוי מתפתח על פני תקופה של כמה שבועות, והוא מסוגל באופן מלא remyelinating סופו של דבר. שיטה זו הייתה שימושית במיוחד בלימוד כוריאוגרפיה של אירועים המעורבים בדה וחידוש יצירת המיאלין. יתר על כן, זה כבר אימץ ככלי לבדיקות פרה-קליניות של טיפולי מועמד להאצת תיקון הבאים עלבון demyelinating.

<table><tbody><tr><td>מספריים קפיציים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>מפסק</td><td>Fine Science Tools</td><td>17003-03</td><td></td></tr><tr><td>קוצץ</td><td>פיליפס</td><td>QG3330</td><td></td></tr><tr><td>תא התאוששות חימום</td><td>Peco Services</td><td>V1200</td><td></td></tr><tr><td>סרט כירורגי</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל</td><td>נוצה</td><td>מס' 15</td><td></td></tr><tr><td>חנית ספוג</td><td>Beaver Visitec</td><td>581089</td><td></td></tr><tr><td>5-0 תפרי ויקריל</td><td>Ethicon</td><td>J511G</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים מעוקלים ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>15123-12</td><td></td></tr><tr><td>32 גרם מחט מתכת</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>305106 מחזיקי מחטים</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים זוויתיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>מוליך עם קצה כותנה</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>רפידות גזה</td><td>בטוחות צלב עזרה ראשונה</td><td>3763</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l מזרק</td><td>המילטון</td><td>7635-01</td><td>הקפד לרכוש את המיקרוליטר, לא</td></tr><tr><td>התאמת דחיסת</td> מזרק אטומה <td>לגז המילטון</td><td>55750-01</td><td>מכיל את 2 הטבעות והאום הנשלף, אך האום שמגיע עם ה-10 &mu; l מזרק הוא ערכת תחול בהתאמה הדוקה יותר</td></tr><tr><td></td><td>המילטון</td><td>PRMKIT</td><td>מכיל את מזרק ההתחלה, מחט הרכזת הנשלפת ודיסקיות הגומי</td></tr><tr><td>נימי זכוכית שנמשכו מראש</td><td>WPI</td><td>TIP10TW1 (חבילה של 10)</td> <td>מכיל נימים עם 10 &mu; קוטר פנימי מ '. 30 &mu; m קוטר פנימי עובד גם (TIP30TW1)</td></tr> <tr><td>מסגרת סטריאוטקטית</td><td>מכשירי דיוויד קופף</td><td>דגם 900</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-20</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek קריומולד ביניים</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td></td></tr><tr><td>קריוסטט</td><td>Leica</td><td>שקופיות מיקרוסקופ CM1900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר</td><td>אולימפוס&nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotome</td><td>Leica EM UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Lysophosphatidylchoine</td><td>Sigma</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>סרום עזים</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-SMI312 נוגדן</td><td>Covance</td><td>SMI-312R</td><td>דילול 1:2,000</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב נגד MBP</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>1:1000 דילול</td></tr><tr><td>עז נגד PDGFR&אלפא; נוגדן</td><td>R& D Systems</td><td>AF1062</td><td>1:100 דילול</td></tr><tr><td>ארנב נגד Olig2 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>עכבר נגד CC1 נוגדן</td><td>Calbiochem</td><td>OP80</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgG</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 עז נגד עכבר</td><td>IgG Life technologies</td><td>A-11003</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד עזים IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>705-546-147</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 חמור נגד עכבר IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-586-151</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 חמור נגד ארנב IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-606-152</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxoid</td><td>BR0014</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>CDMV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>CDMV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יוד</td><td>ווסט פנטון</td><td>2021</td><td></td></tr><tr><td>וזלין וזלין וזלין</td><td></td><td>CA05971</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>אריוכרום ציאנין R</td><td>סיגמא</td><td>32752</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>סיגמא</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>ברזל (III) כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>320145</td><td></td></tr><tr><td>אקריטול</td><td>לייקה ביוסיסטמס</td><td>3801700</td><td></td></tr><tr><td>ציטריזולב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>סוס סרום</td><td>סיגמא</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>אלקטרונים Micrscopy Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>אוסמום טטרוקסיד</td><td>אלקטרונים Micrscopy Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הקסציאנופרט (II) טריהידרט</td> רעיל מאוד <td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>שמן תירס</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול פוליוויניל</td><td>סיגמא</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>חומצה קקודילית</td><td>אלקטרונים Micrscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת פרופילן</td><td>אלקטרונים Micrscopy Sciences</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>ערכת EMBED</td><td>Electron Micrscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טטרבוראט דקהידראט</td><td>Sigma</td><td>S9640</td><td></td></tr><tr><td>מתכונים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>ציאנין אריוכרום</tr><tr>כמות<td>מרכיב</td><td></td><td></td><td>להוסיף</td></tr><tr><td>אריוכרום ציאנין R</td><td></td><td></td><td>0.8 גרם</td></tr><tr><td>חומצה</td><td></td><td></td> גופרתית <td>400 מ"ל 0.5%</td></tr> <tr><td>ברזל (III) כלוריד</td><td></td><td></td><td>20 מ"ל 10%</td></tr> <tr><td>מים</td><td></td><td></td><td>80 מ"ל</td></tr><tr><td>*הוסיפו אריוכרום ציאנין לחומצה גופרתית, ולאחר מכן ברזל (III) כלוריד ומים. ניתן לשמור את התמיסה לאחר השימוש. הכינו טרי פעם בשנה.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelvatol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרכיב</td><td></td><td></td> כמות <td>להוספת</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>140 מ"ל</td></tr><tr><td>אלכוהול</td><td></td><td></td> פוליוויניל <td>20 גרם</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td></td><td></td><td>40 גרם</td></tr><tr><td>*מערבבים היטב, מניחים ב-37 מעלות; C O/N, צנטריפוגה ב-1,960 x גרם 30 דקות, יש להכניס ל-40 צינורות</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של lysolecithin

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

טרשת נפוצה היא מחלה דלקתית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית המאופיינת בהיווצרות רובד המכילה oligodendrocytes איבדה, מיאלין, האקסונים, ותאי עצב. חידוש יצירת המיאלין הוא מנגנון תיקון אנדוגני לפי המיאלין החדש מיוצר לאחר התפשטות, גיוס, והתמיינות של תאי מבשר oligodendrocyte לoligodendrocytes יוצרי מיאלין, ויש צורך להגן על האקסונים מנזק נוסף. נכון לעכשיו, כל התרופה לטיפול בטרשת הנפוצה למקד את הרכיב החריג חיסוני של המחלה, אשר להפחית התקפים דלקתיים אבל לא למנוע התקדמות לירידת נוירולוגית בלתי הפיכה. לכן זה הכרחי כי אסטרטגיות קידום חידוש יצירת המיאלין מפותחות אשר עשוי לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים. מודלים של בעלי חיים כמה מdemyelination קיימים, כוללים Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסיוני וcurprizone; עם זאת, יש Limitations בשימוש בם ללימוד חידוש יצירת המיאלין. גישה חזקה יותר היא הזרקת המוקד של רעלים במערכת העצבים המרכזית, כוללים lysolecithin חומר הניקוי לתוך החומר לבן חוט השדרה של מכרסמים. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההליך הכירורגי הכרוך בהזרקת lysolecithin לחומר לבן הגחון של עכברים הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ולא דורש חומרים נוספים מאלה זמינים מסחריים. הליך זה הוא חשוב לא רק ללימוד האירועים הרגילים מעורבים בתהליך יצירת מיאלין מחדש, אלא גם ככלי פרה-קליני לסינון תרופות קידום חידוש יצירת המיאלין מועמד.

הזרקת מוקד של lysolecithin לחומר לבן הגחון מייצרת נגע demyelinating דיסקרטי שניתן לזהות על פני מרחק של כ -3 מ&quot;מ (איור 2). מכתים immunohistochemical של ליבת הנגע למיאלין (MBP) ואקסונים (SMI312) מראה האקסונים שהופשטו מהמיאלין ב -7 ימים (איור 3). ב -14 ימים, אקסונים רבים מוקפים בטבעות MBP-חיוביות, המציעה את המופע של חידוש יצירת המיאלין. מכתים לתאים של שושלת oligodendrocyte (PDGFRα, Olig2, גג 1 &#39;), יש עלייה משמעותית בשני המספר הכולל של תאים ב 14 ימים לעומת 7 ימים, כמו גם ההפצה של oligodendrocytes הבוגרת בהשוואה לOPCs (איור 4) . עולה בקנה אחד עם ממצא זה, סעיפי semithin המוכתמים בtoluidine הכחול לחשוף את הנוכחות של נדני המיאלין דקים ב -14 ימים שאותרו רק לעתים נדירות ב7 ימים (איור 5), מצביע על כך שאלו remyelinated internodes. ההליך הוא מאוד לשחזור בין בעלי החיים. וריאציה מתרחשת כאשר נשימה כבדה משנה את המצב הנייח של הנימים-זה בדרך כלל לא בעיה עם הרגעה הולמת. נזק לאקסונים נראה מינימאלי, למעט במרכז מאוד של הנגע, אשר תואר מאז השימוש המוקדם ביותר של המודל 1. אנו מאמינים שזה יהיה פגיעה מכאנית מנימי הזכוכית, כפי שהוא גם נצפים בPBS מוזרק בקרות. עם זאת, שונות נוטה להיות קטן, ואנחנו ואחרים באמצעות הליך דומה זיהינו הבדלים בין תנאי ניסוי עם כמה כמו 4 חיות לכל קבוצה 15. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig1.jpg" /> איור 1. אסיפה של מזרק הזרקה. () האגוז של מזרק ההזרקה היא מושחלת על t<html> הוא קצו השטוח של נימי הזכוכית, ואחריו 2 ferrules כך שההזדווגות שלהם מסתיימת משתלבים. ברגע שהנימים הן צמודה היטב בטבעת חזוק חרוטי, ההרכבה מוברגת יד הדוקה על הסוף של מזרק הזרקה. (ב) חתיכת מרכז דיסק גומי עם מחט רכזת מתכת מחוברת למזרק תחול ולהחליק אותו ל הבסיס. (ג) משיכה lysolecithin פתרון לתוך המזרק תחול. (ד) בעדינות לדכא את המזרק תחול עד הטיפה הראשונה של lysolecithin גלויה בקצה המחט. (E) הכנס את המזרק תחול לתוך החבית של ההזרקה מזרק, מה שהופך את חותם משרד עם דיסק הגומי. בעדינות לוחץ על הפתרון עד שהוא רץ לסוף הנימים. לסגת בזהירות את המזרק תחול תוך שמירה על לחץ על הבוכנה כדי להסיר את מחט רכזת מתכת ללא החדרת בועות אוויר לתוך מזרק הזרקה.להעלות / 52,679 52679fig1large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig2.jpg" /> נציג איור 2. lysolecithin הנגע מוכתם בeriochrome cyanine. סעיפים סידוריים (במרווחים 400 מיקרומטר בנפרד) של נגע lysolecithin אופייני בגיל 14 ימים מוכתמים בeriochrome cyanine לדמיין המיאלין (כחול). הערה demyelination שמוגבל לחומר לבן הגחון ושמשתרע על פני כ הנגע 3 מ&quot;מ במקורי / כיוון הזנב. בר סולם = 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig3.jpg" /> האקסונים איור 3. והמיאלין במודל lysolecithin. (א) דמה (PBS) מוזרק בחוט השדרה בשעה 7 ימים תערוכות אקסונים בריאים שמוקפים בטבעות המיאלין. (B) lysolecithin נגע בתערוכות 7 ימים ערומים האקסונים כמו גם המיאלין המושפל. (ג) בגיל 14 ימים, חלקם של האקסונים (דוגמאות מצוינות עם ראשי חץ לבנים) קשורים עם הופעתו של טבעות מיאלין. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig4.jpg" /> איור 4. תאי שושלת oligodendrocyte במודל lysolecithin. (A, C) בשעת 7 ימים, יש ייצוג גדול יותר של PDGFRα + OPCs (ברים לבנים) ביחס לoligodendrocytes + גג 1 &#39;(ברים מג&#39;נטה); המספרים בתוך הברים מייצגים אחוזים. Olig2 נבדק ללאשר צביעת תאי שושלת oligodendrocyte. (B, C) ​​בגיל 14 ימים, יש עלייה משמעותית במספר הכולל של תאי שושלת oligodendrocyte לעומת 7 ימים (p &lt;0.05, t-test שני זנב, n = 4 לכל קבוצה ). יש גם עלייה משמעותית בחלוקת oligodendrocytes לOPCs ב 14 ימים לעומת 7 ימים (p &lt;0.0001, הבדיקה המדויקת של פישר). בר סולם = 10 מיקרומטר. כל שדה הוא נתפס בהגדלה מקורית של 60x. ערכים הם ממוצעים ± SD. * מציין p &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig5.jpg" /> איור 5. חידוש יצירת המיאלין במודל lysolecithin. Toluidine כחול חתך המוכתם semithin סעיף של החומר לבן הגחון בhea ()מטונף עכבר תערוכות האקסונים על פני טווח רחב של קליבר עם עובי המיאלין בהתאמה. (ב) בשעה 7 ימים, חוסר נדני המיאלין נצפה בסמוך לאזור מושפע (מימין למטה). (ג) בגיל 14 ימים, נדנים דקים myelinated ( דוגמאות מצוינות עם ראשי חץ אדומים) מופיעות ברחבי הנגע, מעיד על מגזרי remyelinated. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

ניתן לעצב מחלות דמיאלינטיות בבעלי חיים על ידי יישום מוקדי של ליזולציטין במערכת העצבים המרכזית. זריקה אחת של ליזולציטין לחוט השדרה של העכבר מייצרת נגע שמתקן באופן ספונטני עם הזמן. המטרה היא לחקור גורמים המעורבים בדה-ורמיאלינציה, ולבדוק חומרים לשיפור התיקון.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור היבטים של דמיאלינציה ורמיאלינציה עוקבת בחוט השדרה של עכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת הדטרגנט lyin מקפילרית זכוכית משוכה אל החומר הלבן של החלק הוונטרלי של חוט השדרה. לאחר מכן, חוט השדרה מעובד בנקודות זמן שונות כדי לחקור היבטים של תיקון, כולל גיוס ודיפרנציאציה של תאי קדם לאוליגודנדרוציטים ורמיאלינציה.שיטה זו מועילה לא רק לחקר התהליכים הנורמליים המעורבים ברמיאלינציה (המיאלינציה מחדש), אלא גם ככלי פרה-קליני לסריקה של תרופיתים המקדמים רמיאלינציה. התחילו בהוצאת מנה של 75 µL של תמיסת דטרגנט 1% מאחסון בטמפרטורה של 20°C- והמיסו בטמפרטורת החדר על שולחן העבודה במידה והדטרגנט אינו מומס. בצעו סוניקציה לשפופרת ב-40 kHz למשך כ-30 דקות כדי לקבל תמיסה הומוגנית.בשלב הבא, שחררו את האום של מזרק הזרקה של 10 µL והבריגו אותו אל הקצה השטוח של קפילרית זכוכית של PrepU. הוסיפו שתי טבעות איטום כדי להבטיח שהן יחתמו היטב סביב הקפילרית. כעת שטפו את המזרק עם איזופרופנול והוציאו את הבוכנה.לאחר הייבוש, הדק ידנית את תסביב המחט על מזרק ההזרקה. לאחר מכן, חבר מחט עם בסיס מתכתי (metal hub needle) למזרק ההכנה (priming syringe). דקור את הדיסקה הגומי באמצעות המחט והזלק אותה למטה עד לבסיס.כעת מלאו את מזרק ההכנה ב-lyo בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בדטרגנט. לחצו בעדינות על הבוכנה כדי להוציא בועות אוויר עד שהתמיס יהיה גלוי בקצה המחט עבור ניתוחי ביקורת. טענו PBS.כעת הכניסו את מחט המתכת של מזרק ההכנה (priming syringe) לתוך מזרק ההזרקה, תוך הבטחה לאטימה הדוקה עם דיסקיות הגומי. לאחר מכן, לחצו באיטיות על מזרק ההכנה עד שהנימית תתמלא בתמיסה עד לקצה. כאשר הנימית מלאה, שלפו בזהירות את מזרק ההכנה תוך כדי המשך מילוי גוף מזרק ההזרקה.נסו להימנע מהחדרת בועות אוויר. כעת הכניסו את הבוכנה למזרק ההזרקה ווודאו שהתמיסה זורמת מהקצה. אם נראות בועות אוויר בנימי הנימי או במזרק ההזרקה, חזרו על הכנת המזרק מהתחלה.זרימה רציפה של נוזל במערכת ההזרקה היא קריטית להבטחת נפחי הזרקה מדויקים. לסיום, חברו את מזרק ההזרקה לזרוע של מיקרו-מניפולטור סטריאוטקטי. מערך זה מאפשר להזריק ל-15 עד 20 בעלי חיים לפני שיהיה צורך בקפילרה חדשה.ראשית, הרדימו את בעל החיים, במקרה זה עכברה בוגרת צעירה מסוג C 57 black six. השתמשו בקיטמין ובקסילאזין ותכננו את ההרדמה למשך שעה אחת. ודאו כי הסדציה נאותה על סמך היעדר תגובה ללחיצה חזקה על כף הרגל.לאחר מכן, גלחו שטח של שני עד שלושה סנטימטרים רבועים בצד הגבי (dorsal) קרוב לאוזניים. נגבו את העור עם 70% ethanol באמצעות פד גזה, כדי להסיר את כל השערות. לאחר מכן, חטאו את האזור בעזרת יוד.יש למרוח משחת atoma ולהשאיר את בעל החיים בתא התאוששות מחומם. כעת ניתן להתחיל בהליך. העבירו את בעל החיים למסגרת סטריאוטקטית כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, והגביהו את מרכז הגוף באמצעות מגבות נייר מקופלות כדי להדגיש את קימור עמוד השדרה.לאחר מכן, קבעו את הראש באמצעות תופסן שיניים והדביקו את הגפיים והזנב באמצעות סרט הדבקה כירורגי. אין צורך במוטות קיבוע לאוזניים. כעת השתמשו בסכין מנתח כדי לבצע חיתוך קווי אמצע באורך של שלושה סנטימטרים, החל ממיקום נמוך מסlightly מהאוזניים ובכיוון הזנב.לאחר מכן, אתרו את המחיצה בין שתי מבני השומן הגדולים והשתמשו בפינצטות עדינות בכל יד. כדי להפריד ביניהם, הרחיבו את המרחיבים לפתיחת השדה הכירורגי תחת מיקרוסקופ כירורגי, ואתרו את הבליטה הגרמית הבולטת של חוליה T2, המאפיינת את זן העכברים C 57 black six. כדי לחשוף את החוליה, בצעו דיסקציה קהה של השרירים המכסים אותה בעזרת מספרי קפיץ סגורים.לאחר מכן, גששו את המשטחים הקשיחים של T three ו-T four כדי לאשר את המיקום האנטומי הנכון. כעת בצעו חתכים צדדיים רדודים ברקמה החיברית שבין T three ל-T four. שימו לב שחתך עמוק מדי עלול לחדור ולפגוע בחוט השדרה.דימום קל הוא שכיח וניתן לסלקו באמצעות מקל ספוג. חוט השדרה מכוסה בשכבה עבה של קרומים קשיחים (dura) ויהיה גלוי אם שכבה קרומית זו טרם נחתכה. אם הקרומים הקשיחים נותרו שלמים, הסירו אותם בזהירות באמצעות גירודים צדיים עדינים בעזרת מחט מתכת בכילוי 32.הימנעו מדקירה של קרומי העטיפה הנותרים שמתחתיהם, שאינם עבים באותה מידה וקשה יותר להבחין בהם. אם דולף נוזל חלחולי (cerebral spinal fluid) מהערכוכ (arachnoid), הסירו אותו באמצעות מקל הספוג. התחילו את ההזרקה על ידי העברת הנימידי למקומו מעל חוט השדרה.אין להשתמש בכלי הדם הרוסטלי הבולט של ה-coddle כנקודת ייחוס לקו האמצע. במקום זאת, השתמשו בגבולות שבין החומר האפור לחומר הלבן המקיפים את העמוד הדורסלי כדי להעריך את קו האמצע. כעת הורידו באיטיות את הקפילריה עד שקצהה יגע בקושי בחוט השדרה, מיד לצדו של קו האמצע בכל אחד מהצדדים.נעלו את הזרוע במקומה במיקום זה. לאחר מכן, רשמו את נקודת הבסיס על פי המדידות המדורגות של ציר Z בזרוע הסטריאוטקטית. מהקריאה זו, החסירו 1.3 millimeters והשתמשו בתנועה מהירה ורדודה כלפי מטה כדי לחדור לרקמה, תוך הורדה זהירה של הנימיאל לעומק הרצוי.כעת, באמצעות המיקרו-מניפולטור, בצעו סיבוב מלא אחד בכל חמש שניות במשך שתי דקות כדי להחדיר נפח כולל של 0.5 µL. לאחר מכן, השאירו את הקפילרית במקומה למשך שתי דקות. לאחר שתי דקות, משכו בזהירות את הקפילרית מהרקמה.פעולה זו מאפשרת לתמיסה לחלחל פנימה. אחרת, עלולה להתרחש זרימה חוזרת שתזיז את מכשיר ההזרקה מהבעל החיים ותסיר את המתפשטים. סגרו את פצע הבעל החיים על ידי קשירת תפר בודד ברקמת השומן השרירית, מעל עמוד השדרה.לאחר מכן, השתמשו בתפר רציף כדי לסגור את העור ומרחו יוד נוסף על מקום החתך. סיימו על ידי הנחת בעל החיים בתא התאוששות מחומם עד להחלמתו, ולאחר מכן החזירו אותו לכלובו. טיפול לאחר ניתוח ואנליזה מתוארים בפרוטוקול הטקסט focal injection of lyin into the ventral white matter.הופק נגע דמיליניזציה (דמיאלינציה) מובחן שהשתרע על פני כשלושה מילימטרים. בוצעו צביעות אימונוהיסטוכימיות של מרכז הנגע, שסימנו את המיאלין באמצעות MVP ואת האקסונים באמצעות SM I three 12. האקסונים היו נטולי מיאלין לאחר שבעה ימים, ועד ליום ה-14, טבעות חיוביות ל-MVP הקיפו אקסונים רבים, מה שמעיד על התרחשות רמיאלינציה (דמיאלינציה חוזרת).צביעת תאים משושלת האוליגודנדרוציטים באמצעות PDG FFR alpha LIC two ו-CC one הראתה עלייה משמעותית הן במספר התאים הכולל ביום ה-14 בהשוואה ליום השביעי, והן בפיזור רב יותר של אוליגודנדרוציטים בוגרים בהשוואה ל-OPCs. בהתאם לממצא זה, חתכים חצי-דקים שנצבעו ב-toluidine blue חשפו נוכחות של שכבות מיילין דקות ביום ה-14, שזוהו לעיתים רחוקות ביום השביעי, דבר המעיד על נוכחות יעילה של internodes שעברו רמיאלינציה.ניתן לבצע את הפעולה בתוך 10 עד 15 דקות לכל חיה, במיוחד בעזרתו של אדם שני הקושר את התפרים.

experimental-demyelination-remyelination-murine-spinal-cord-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

המחלה מעוררת תאים חיסוניים אוטו-תגובתיים לתקוף חלבוני מיאלין, ומפרקים את מעטפת המיאלין המקיפה אקסונים עצביים.

ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי של דמיאלינציה בחתכי חוט השדרה של עכבר

סרטון זה מדגים את ההליך של גישה כירורגית לעצב הראייה בחיה מורדמת ואספקה מדויקת של ליסולציטין כדי לגרום לדמיאלינציה מוקדית, יצירת תנאים נוירופתולוגיים למחקר נוסף.

גרימת דמיאלינציה מקומית בעצב הראייה באמצעות ליזולציטין

סרטון זה מדגים את היצירה של מודל עכבר דה-מיאלינציה מוקדית באמצעות הזרקת ליזופוספטידילכולין דו-נקודתית (LPC). גולגולת של עכבר מורדם חשופה. קואורדינטות ההזרקה נקבעות, ונקדח חור כדי לאפשר הזרקות LPC באתרים ממוקדים. LPC גורם לדמיאלינציה מוקדית של נוירונים באמצעות דלקת, בעוד שהזרקה של שתי נקודות מבטיחה את קיימותו.

ביסוס מודל עכבר דמיאלינציה מוקדית באמצעות הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין

סרטון זה מדגים את השיטה להשראת דה-מיאלינציה בתאי עצב בחוט השדרה של עכברים באמצעות זריקות ליזולציטין, ואחריה רמיאלינציה באמצעות נדידה והתמיינות של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים. התהליך פוגע ואז משחזר בהדרגה את העברת האותות העצביים.

דה-מיאלינציה ורמיאלינציה של נוירונים בחוט השדרה של עכברים

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר רבייה של חיקוי נרחב של חומר אפור של שתי ההמיספרות הקליפתיות בחולדות אגוטי אפלות זכריות בוגרות. השיטה כוללת השתלה תוך-מוחית של קטטר, חיסון תת-אקליני נגד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין, והזרקה תוך-מוחית של תערובת ציטוקינים פרו-דלקתית דרך הצנתר המושתל.

מודל חולדה של דמיאלינציה קליפת המוח הנרחבת הנגרמת על ידי הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים פרו דלקתיים

Demyelination מתרחשת במחלות מרובות של מערכת העצבים המרכזית. טכניקה אמינה של אספקת תרופות vivo נחוצה לבדיקות רמיאלין של תרופות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת משאבה אוסמוטית המאפשרת אספקת תרופות לטווח ארוך ישירות לתוך parenchyma המוח ומשפר את הזמינות הביולוגית של התרופה, עם יישום רחב במחקר רמיאלינציה.

משלוח תרופות מבוסס משאבה אוסמוטי למחקר רמיאלינציה In Vivo על מערכת העצבים המרכזית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית כדי ליצור מודל דמילינציה יציב וניתן לשחזור בעכברים.

הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) משמשת כמודל של בעלי חיים לטרשת נפוצה. מאמר זה מתאר גישה לניקוד דלקת בחוט השדרה, דמיאלינציה ופגיעה אקסונלית ב- EAE. בנוסף, מוצגת שיטה לכימות רמות האור של נוירופילמנט מסיס בסרום העכברים, המאפשרת הערכה של פגיעה אקסונלית בעכברים חיים.

ניקוד דלקת במערכת העצבים המרכזית, דמיאלינציה ופגיעה באקסון באנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

סרט הווידאו הזה מדגים שיטה לנתח ותרבות נוירונים commissural מחוט השדרה הגבי E13 חולדה. נוירונים commissural ניתק מועילים כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון והדרכה.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

חקור מנגנוני דה-מיאלינציה ורמיאלינציה בעמוד השדרה של עכברים באמצעות הזרקת ליזולציטין. שיטה זו מאפשרת לבחון תהליכי תיקון ולסנן תרופות פוטנציאליות לטיפול במחלות מיאלין.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

גלה סרטונים נוספים