מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את יכולת ייצור הכוח האיזומטרי המקסימלית של סיבים בודדים מדגימות שרירי שלד מבחינה כימית. זה מושג על ידי חשיפת ממברנות סיבי השריר לחומר ניקוי כימי, ובכך להסיר את המחסום בין התוכן החוץ-תאי לתוך תאי. השלב השני הוא לחלץ סיב בודד מצרור סיבים קטן ולחבר אותו למנגנון הניסוי.

לאחר מכן, דפוסי הפרעות לייזר משמשים לקביעת אורך הסרקום האופטימלי עבור הסיב הבודד. לבסוף, סידן ניתן כדי לעורר כוח התכווצות איזומטרי מקסימלי. בסופו של דבר, טכניקת הסיב הבודד מספקת הערכה של תכונות ההתכווצות של שריר השלד ללא המורכבויות הקשורות לארכיטקטורת שרירים שלמה.

הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון ששלבי המפתח לביצוע הפרוטוקול בהצלחה יכולים להיות קשים ללמידה. התחל בהכנת פתרונות החיתוך, האחסון והבדיקה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים להכנת לולאות תפרים מגדילים של תפר ניילון USP 10 אפס מונופילמנט

בעזרת טכניקת הקשר הכפול, הכינו ארבע לולאות לכל סיב שייבדק. לאחר שנוצר, הניחו את הקשר מתחת למיקרוסקופ והקטינו את גודלו לקוטר של כ-750 מיקרומטר. שימוש בסימוני IPS GTI כמדריך.

לאחר מכן חתוך את כל התפרים העודפים, והשאיר רק את הלולאה וזנבות קטנים של 500 מיקרומטר משני הצדדים. העבירו מסה קטנה של רקמת שריר המתקבלת באמצעות ביופסיה פתוחה או מחט לכלי המכיל תמיסת דיסקציה צוננת והוסיפו עוד תמיסת דיסקציה כדי להבטיח שהרקמה תישאר שקועה. בדוק את הדגימה תחת המיקרוסקופ ועשה מניפולציה כדי ליישר את ציר האורך של הסיבים לכיוון הכתף הימנית של החוקר.

לאחר מכן עוגן את הדגימה לצלחת על ידי הצמדתה בפינות עם המלקחיים ביד שמאל והמספריים המיקרו מנתחים ביד ימין. התחל לנתח בעדינות צרור לאורך שולי האורך בין הסיבים. הסר והשליך כל רקמה שנפגעה מהמלקחיים או הסיכות.

כתוצאה מתהליך הניתוח, העבירו את הצרורות מתמיסת החיתוך לבקבוקון של שלושה מיליליטר המכיל 2.5 מיליליטר תמיסת חיתוך צוננת טרייה בתוספת חומר ניקוי לא יוני. דגרו את הדגימה על קרח למשך 30 דקות עם תסיסה עדינה מדי פעם וודאו שהצרורות יישארו שקועים לאורך כל הדגירה. לאחר מכן העבירו את הצרורות לבקבוקון המכיל תמיסת חיתוך טרייה וערבבו בעדינות ובקצרה כדי להסיר את כל חומר הניקוי שנותר.

לאחר השטיפה, העבירו את החבילות לבקבוקון המכיל תמיסת אחסון צוננת ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הוציאו את הבקבוקון מהאחסון בארבע מעלות צלזיוס והעבירו את כל החבילות לכוס תרופות או לכלי ניתוח. כהכנה לאחסון, העבירו את החבילות לבקבוקוני קריו עם תוויות נפרדות, מלאים ב-200 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת אחסון טרייה, וודאו שהצרור לא נדבק לצד הצינור או צף על פני השטח.

לאחר מכן מכסה את הצינור ואחסן את הדגימה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. הקימו מנגנון ניסיוני כמו זה שמוצג כאן ומיוחס לפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן מלאו את תא הניסוי הראשון בתמיסה מרגיעה, את החדר השני בתמיסה מפעילה מחדש, ואת השלישי בתמיסה מפעילה.

כוונן את הטמפרטורה בתא עד שהיא יציבה על 15 מעלות צלזיוס כשהמכשיר בתמיסה המרגיעה. השחילו שתיים מלולאות התפרים המוכנות על משטחי החיבור מנירוסטה המשתרעים הן ממתמר הכוח והן מבקר האורך. לאחר מכן, הפשירו צרור סיבים מעניין על קרח למשך כ-15 דקות, ולאחר מכן העבירו אותו לצלחת פטרי מצופה אלסטומר סיליקון במילוי תמיסה מרגיעה טרייה וצוננת.

אבטח את הצרור במקומו עם סיכות משני קצותיו וודא שהוא שקוע באמצעות המלקחיים. אחוז בסיב בקצה אחד והתחל לחלץ אותו בצורה חלקה לאורך ציר האורך שלו. יש לנקוט בזהירות בעת חילוץ סיבים מהצרור מכיוון שהידבקויות בין הסיבים למטריצה החוץ-תאית עלולות לגרום למתח מוגזם, מה שמוביל בסופו של דבר לנזק הנגרם כתוצאה ממתיחה.

לאחר החילוץ, הכניסו את הסיב לקצה פיפטה שונה יחד עם כמות קטנה של תמיסה מרגיעה והעבירו אותו לתא הניסוי המכיל את התמיסה המרגיעה המנחה בעדינות עם המלקחיים. הסר את הסיב מקצה הפיפטה ועגן אותו לבקר האורך. בעזרת לולאת התפר הראשונה, תפעל את הקצה השני של הסיב לכיוון מתמר הכוח ואבטח את הסיב באותו הליך.

הסר את כל התפרים העודפים באמצעות המספריים המיקרו לניתוח. לאחר מכן, השחילו את הלולאה השנייה מעל הראשונה ועגנו את הסיב בנקודה בטווח של 0.2 מילימטרים מקצה משטח החיבור של בקר האורך. חזור על הפעולה עם הלולאה השנייה בקצה מתמר הכוח של הסיב.

כוונן את מיקום בקר האורך בכיוון ציר ה-Y על מנת ליישר את הסיב במקביל לדפנות הצד של תא הניסוי. לאחר מכן סקר את הסיב באמצעות תצוגת הצד של המנסרה והתאם את מיקום בקר האורך לכיוון ציר Z עד שהסיב מקביל לרצפת החדר. אם הסיב ניזוק בדרך כלשהי, יש להשליך את הסיב ולחבר סיב חדש.

הפעל את הלייזר והתאם את מיקום הבמה כך שהלייזר יעבור דרך מרכז הסיב. לאחר מכן הגדר את אורך הסרקומר על ידי הגדלה או הקטנה של המתח על הסיב באמצעות דרייבר מיקרומטר ציר X של בקר האורך עד שנצפה המרווח הרצוי של האור העקיפה על מסך המטרה. לאחר קביעת אורך סרקומר אופטימלי, מדוד את המרחק בין שני התפרים הפנימיים ביותר.

מקם את החדר כך שהשיער הצלב האנכי של העינית מיושר על הגבול הפנימי ביותר של תפר פנימי אחד ואפס. הקריאה הדיגיטלית בכונן המיקרומטר מתרגמת את השלב לאורך ציר ה-x ביחס למיקרוסקופ עד שהשיער הצלב האנכי של העינית מיושר עם התפר הפנימי ביותר. התצוגה הדיגיטלית תציין את אורך הסיב, תשמור על הסיב באורך הנמדד ותשתמש במצלמה המותקנת במיקרוסקופ כדי ללכוד תמונת הגדלה גבוהה של החלק המרכזי של הסיב הן מלמעלה והן מהצד.

השתמש בתמונות אלה כדי לחשב את שטח החתך של הסיב. השתמש בתוכנת בקרת התא כדי להעביר את הסיב לתא המכיל את תמיסת ההפעלה מחדש מראש ולדגור שם למשך שלוש דקות. בזמן שהסיב משבית את התמיסה, מדוד את המתח הפסיבי שלו, ואז העביר את הסיב לתא המכיל את התמיסה המפעילה ואפשר לכוח איזומטרי מקסימלי להתפתח כפי שמעידה מישור בכוח שלפניו עלייה מהירה.

לאחר מכן, השתמש בבקר האורך כדי להחיל הפחתה מהירה וקצרה גדולה במרחק בין נקודות חיבור הסיבים, ואחריה חזרה מהירה לאורך המקורי כדי לזהות את פלט מתמר הכוח המתאים לאפס. הכוח המוצג כאן הוא המבט העליון והצד של סיב בעל צורה אליפטית מהתצוגות הללו. שטח החתך נקבע על ידי מדידת הקוטרים בחמש נקודות לאורך הסיב ולאחר מכן חישוב הממוצע של חמשת האזורים המתקבלים.

עקבות כוח מסיבי שריר אנושיים, איטיים ומהירים ממחישים כי סיבים מהירים מייצרים כוח בקצב גבוה יותר מאשר סיבים איטיים באמצעות הטכניקה המוצגת בסרטון זה. המאפיינים האופייניים של סיבי שריר של עכברים וחולדות אנושיים נמדדו ומוצגים כאן. הטווח המוצג מציין את הרבעים ה-25 עד ה-75 וה-N הוא מספר הסיבים שנבדקו.

שימו לב לשונות הרחבה בכוח הספציפי בין המינים השונים. ההליכים המתוארים כאן מביאים להערכת יכולת יצירת הכוח הפנימי המקסימלי של סיב שריר שלד בודד על ידי הוספת התערבויות נוספות, היבטים חשובים בפיזיולוגיה של שרירי השלד, כולל בין היתר, כוח אורך, מהירות כוח וכוח. ניתן לחשוף קשרי סידן.