Name: HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: למד לזהות ולכמת נזק חמצון ב-DNA באמצעות HPLC עם גילוי אלקטרוכימי. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה להערכת 8-oxo-dGuo בתאים וברקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה מומן על ידי משרד הבריאות הקנדית ג&#39;נומיקס המחקר ופיתוח היוזמה (GRDI) ותקינת האסטרטגיה הקנדית לביוטכנולוגיה (CRSB). יש הסופרים אין ניגוד האינטרסים.

<ol><li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+oxidation+matters%3A+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-hydroxy-2%27+-deoxyguanosine+%288-OHdG%29%3A+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Sci+Health+C+Environ.+Carcinog.+Ecotoxicol.+Rev%22%5BJournal%5D)">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li>
<li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+DNA+damage%3A+formation%2C+measurement%2C+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Pathol+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li>
<li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer%3A+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li>
<li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li>
<li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li>
<li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine%3A+implications+for+mutagenicity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li>
<li>Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+%288-oxo-dGuo%29+by+PAH+o-quinones%3A+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper%28ii%29%2Fcopper%28i%29+redox+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li>
<li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+7%2C8-dihydro-8-oxo-2%27-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li>
<li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+background+level+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine%3A+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li>
<li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice%3A+A+model+for+studying+mutations+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li>
<li>Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oecd-ilibrary.org">http://www.oecd-ilibrary.org</a> (2015).</li>
<li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li>
<li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li>
<li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+and+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li>
<li>Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection%3A+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li>
<li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li>
<li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li>
<li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+urinary+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li>
<li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonising+measurements+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%E2%80%B2-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzol%3A+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li>
<li>Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li>
<li>Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+DNA%3A+formation%2C+measurement+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li>
<li>Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: <a target="_blank" href="http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf">http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.

למרות 8-אוקסו-dGuo דווח כסמן ביולוגי שימושי של חמצון ה- DNA, הכימות אמין שלה יכול להוות אתגר. למרות כמה שיטות שפורסמו קיימות, יש צורך בסקירה מקיפה, תיאורים של פרוטוקול להתיר לחוקרים לפרוס את השיטה במעבדות שלהם. כאן אנו מציגים סקירה מפורטת של פרוטוקול מבוסס HPLC שיאפשר למשתמשים חדשים להקים שיטה יעילה לגילוי 8-אוקסו-dGuo וכימות. שלוש שיטות עיקריות שתוארו לכימות של 8-אוקסו-dGuo. אלה כוללים אנזים צמוד immunosorbent a...

מינים תגובתי חמצן (ROS), מצב יציב שיכולים להגדיל את הרמות בהרבה מצבים פתולוגיים וחילוף חומרי xenotoxic, תורמים לשכיחות מוגברת של נזק לדנ&quot;א חמצוני. בין כמה מוצרי חמצון nucleobases האפשרי, נזק לדנ&quot;א חמצוני יכול בקלות למדוד באמצעות הסמן היציב 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo), שהוא אחת מצורות חמצון של 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-אוקסו-dGuo הוא נגע DNA הנפוץ ביותר 2, ולכן, כבר למד לפירוט רב יותר כסמן ביולוגי חמצון ה- DNA למרות קיומם של מוצרי חמצון ה- DNA המרובים 3. בבני אדם, נזק זה ניתן לתיקון באמצעות תיקון כריתת בסיס על ידי glycosylase 8-oxoguanine 1 (hOGG1) 4. אם עזב מתוקן, 8-אוקסו-dGuo יכול לתרום להיווצרותן של מוטציות זוג-החלפת בסיס (כלומר, G לT transversions) 4. חשוב לציין, 8-אוקסו-dGuo הוא סמן הוקם FOנזק לדנ&quot;א r ביחס לייזום והקידום של היווצרות הסרטן 2. לכן, כימות מדויק של 8-אוקסו-dGuo הוא סמן ביולוגי שימושי ורצוי של נזק לדנ&quot;א חמצוני 5. יש בלבול נפוץ בספרות בנוגע לשמות הנכונים לצורות oxidatively פגועות של 2-deoxyguanosine ו, יתר על כן, את השם הנכון של המתחם (ים) שנמדדו באופן שגרתי כסמן ביולוגי של נזק לדנ&quot;א חמצוני 6. צורות tautomeric 8-קטו 6,8-diketo ו6-enol, של 8-אוקסו-dGuo (מוצג באיור 1) הן שני tautomers הבולט ביותר שנדון בספרות 5,7. טופס 6,8-diketo הוא הצורה הבולטת ביותר ב- pH הפיזיולוגי של 7.4, והוא מוצר חמצון ה- DNA הבולט 7. לכן, 8-אוקסו-dGuo, במקום 8-הידרוקסי-dGuo הוא השם המתאים ביותר למוצר חמצון זה 6. כמו כן, חשוב לשים לב ש2-deoxyguanosine (dGuo), ולא nucleobגואנין ASE (גואה) או guanosine ribonucleoside (גואו), בהתאמה, הוא זוהה על ידי רוב השיטות 6. איתור וכימות של 8-אוקסו-dGuo מדויקים הוא מאתגר עקב: השתנות i) בעיכול של דגימת DNA, ii) חמצון adventitious של dGuo 8-אוקסו-dGuo שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם, וiii) את הצורך לאימות יעילה של שיטת HPLC-ED אנליטיים 8. בפרוטוקול זה, אנו חותרים להשגת i) על ידי מתן תנאים, נוחים לעיכול DNA מלא וii) על ידי chelator הכללת המתכת ופתרונות שטופל chelator ומגיב בידוד-דנ&quot;א מיוחד, תוך iii) היה ממוען רק באופן חלקי על ידי הכללת בקרות חיוביות וכך לספק כי השיטה היא מסוגלת לאתר 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות. אימות נוספת היא מעבר להיקף של מאמר זה. עם זאת, אנו בטוחים כי פרוטוקול זה יעזור לי פוטנציאלימשתמשים לקבוע את המידה שבה הם צריכים לאמת באופן רשמי בפרוטוקול, בהתאם לצרכיהם. רשימה של צעדים הנדרשים לאימות הפורמאלית של השיטה מסופקת נוספת. במהלך הפיתוח והפריסה של שיטה לזיהוי 8-אוקסו-dGuo, שיטות שפורסמו נסקרו ומאוחדת. לכן, שיטה זו מבטלת את הצורך לאסוף מידע ממספר מקורות שפורסמו, כי לעתים קרובות חסרי פרטים ניסיוניים חשובים גם בעת מתן אמצעי מהיר ופשוט של בדיקות אם השיטה לאיתור והכימות של 8-אוקסו-dGuo כבר אימצה בהצלחה. שיטה מותאמת זה הועסקה לנתח בהצלחה דגימות DNA מהתאים בתרבית רקמה ועכברית. מאמר זה וידאו יסייע קבוצות אחרות בהקמת שיטה יעילה לגילוי אמין וכימות של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED.

<table><tbody><tr><td>תקן 8-oxo-dGuo</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>מכונה באופן לא הולם "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; ראה <חזק>איור 1</חזק> וטקסט לפרטים.</td></tr><tr><td>פוספטאז אלקליין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5931</td><td>מE. coli</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>כלאטים מתכות כבדות</td></tr><tr><td>Desferoxamine mesylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo Standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>DNA מזרע סלמון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>מלח נתרן</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>TypeII, מלבלב בקר</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic חומצה דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>התרכובת לא תתמוסס לחלוטין עד שה-pH של התמיסה יותאם ל-8.0 (למשל עם NaOH)</td></tr><tr><td>F12-K מדיה</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>עמוד משמר</td><td>התמחויות כרומטוגרפיות</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>מגן על הקולום מפני זיהום; עלול גם להוביל להצטברות לחץ</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td> <td>מונו-בסיסיSigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>פוספודיאסטראז I אנזים&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>סוג II מארס Crotalus adamaneus</td></tr><tr><td>הומוגנייזר טפלון</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>7724T-1 או 7724T-5 עבור 1 או 5 מ"ל, בהתאמה</td><td>נפח (יכולת החזקה) תלוי בכמות הדגימה שיש לעבד.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>עמודת YMC-BASIC עם סיליקה כדורית מלוכדת</td><td>התמחויות כרומטוגרפיות</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

hplc המדידה של ה- dna חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

סטרס חמצונים קשור הרבה תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם חילוף חומרים xenobiotic, מוביל לחמצון של Biomacromolecules, כולל DNA. לכן, זיהוי יעיל של חמצון ה- DNA הוא חשוב עבור מגוון רחב של תחומי מחקר, כוללים רפואה וטוקסיקולוגיה. סמן ביולוגי משותף של דנ&quot;א פגום oxidatively הוא 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo; לעתים קרובות מכונה בטעות כ8-הידרוקסי-2&#39;deoxyguanosine (8-OH-dGuo או 8 -oxo-DG)). כמה פרוטוקולים ל8-אוקסו-dGuo מדידה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ED) תוארו. עם זאת, אלה יושמו בעיקר ל- DNA מטוהר שטופל בפרו-חמצון. בנוסף, עקב הבדלים מתודולוגיים בין מעבדות, בעיקר בשל הבדלים בציוד אנליטי, האימוץ של שיטות שפורסמו לצורך זיהוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED דורש אופטימיזציה זהירה בכל מעבדה.פרוטוקול מקיף, המתאר תהליך האופטימיזציה כזה, חסר. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לגילוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים. זה מדגים כיצד הכנת דגימת DNA יכולה להיות מותאמת בקלות ובמהירות כדי למזער חמצון ה- DNA לא רצוי שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם. פרוטוקול זה מראה כיצד לזהות 8-אוקסו-dGuo בתאים בתרבית אדם אדנוקרצינומה מכתשי (כלומר, תאי A549) שטופלו בסוכן חמצון KBrO 3, ומהטחול של עכברים שנחשפו לdibenzo פחמימנים ארומטיים polycyclic (def, עמ &#39;) chrysene (DBC, שנקרא בעבר פיר dibenzo (, יב), DalP). בסך הכל, עבודה זו מדגימה כיצד מתודולוגיה HPLC-ED יכולה להיות מותאמת בקלות לזיהוי של 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות.

dGuo נצפה ליש זמן שמירה של 4.7 דקות ואילו 8-אוקסו-dGuo זמן שמירה של כ 6.4 דקות (איור 2 א &#39;וב&#39;). יש הבדל כ -1,000 פי בגבה השיא בין שני analytes, כפי שניתן לראות באיור 2 ג. Voltammograms ל8-אוקסו-dGuo וdGuo התקבלו על ידי סטנדרטים פועלים בפוטנציאל עבודה בטווח של 0.2-1.1 V. פוטנציאל העבודה האופטימלי עבור 8-אוקסו-dGuo היה נחוש להיות 0.5 V, ו0.9 V לdGuo (איור 3). פוטנציאלים אלה הם בהסכם עם אלקטרודות פחמן מזוגגות אחרות המתוארות ב...

המטרה של פרוטוקול זה היא הגילוי של סמן חמצון ה- DNA, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo) על ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים.

HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות ולכמת את תוצר חמצון ה-DNA שנקרא eight OXO DG בדגימות ביולוגיות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם גילוי אלקטרוכימי, או H-P-L-C-E-D. מטרה זו מושגת על ידי בידוד דגימת DNA מדגימות ביולוגיות, ולאחריו עיכול מלא של ה-DNA באופן הממזער חמצון בלתי רצוי של ה-DNA שעלול להתרחש במהלך הכנת הדגימה, וזאת באמצעות הוספת כלטור מתכת וריאגנט מיוחד לבידוד DNA. לאחר מכן, תנאי ההרצה של ה-H-P-L-C-E-D מותאמים, ונבנות עקומות סטנדרט עבור eight OXO DG ו-two primed dioxazine.השלב הסופי הוא הרצת DNA שעבר עיכול בסדרה עם 8-oxo-dG טהור ו-2'-deoxyguanosine ב-HPLC, במטרה למצוא את היחסים בין 8-oxo-dG ל-2'-deoxyguanosine בדגימות ה-DNA המעובדות הנבדקות. בסופו של דבר, זיהוי וכימות של 8-oxo-dG באמצעות HPLC-ECD משמשים להערכת מידת החמצון של DNA בדגימות ביולוגיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאחדת את כל המידע הרלוונטי ממספר מקורות שפורסמו, ובנוסף מספקת אמצעים מהירים ופשוטים לבחינת הצלחת היישום של שיטה זו בסביבת מעבדה חדשה.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר ביו-רפואי ובמחקר רעילות, כגון האופן שבו עקה חמצונית, או באופן ספציפי יותר חמצון DNA, קשורים מנגנונית להשפעות שליליות בתאים מתרבית ובבעלי חיים ניסייניים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את הטכנ

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

כימית biomimetic הרדיקלי מבוססת הוחלה ספריות בניין עד נחוצות לפיתוח סמן ביולוגי.

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לגילוי כמותי של נזקי חמצון בתאי MCF-7 בטכנולוגיית ELISA.

כימות הרמה של 8-oxo-dG באמצעות בדיקת ELISA להערכת נזק חמצוני לדנ"א בתאי MCF-7

קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

אוריגמי DNA היא שיטה רבת עוצמה לייצור אובייקטים ננומטריים מדויקים על ידי תכנות ההרכבה העצמית של מולקולות DNA. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקיפול של רובוט מגיב ביולוגית מאוריגמי DNA, טיהורו וצביעתו השלילית להעברת הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית (TEM).

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה קלה וניתנת לשחזור המשתמשת בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך (RP-HPLC) כדי למדוד את חילוף החומרים של פורין על תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) שגודלו בתנאים שונים.

HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית

מוצג פרוטוקול למניעת חמצון של מצעים מתכתיים במהלך העברת דגימה מתמיסה חומצית מעוכבת לספקטרומטר פוטו-אלקטרונים של קרני רנטגן.

קביעת ההרכב הכימי של ממשקי קורוזיה מונעים / מתכת עם XPS: חמצון טבילת הודעת מזעור

נתאר את תהליך ייצור ובדיקה של מדי חום פוטוני.

ייצור ובדיקה של מדי חום פוטוני

השיטה הנוכחית משמש לזיהוי מעכבי isoform ספציפיים של היסטון deacetylases (HDAC) בתאים הלה על ידי ניתוח UHPLC-MS של סובסטרטים מרובים. זוהי שיטה ללא נוגדנים שפותחו כדי לשקף את פעילות HDAC1, HDAC6 החיים בסביבת תא, בניגוד חד-isoform תא ללא מבחני.

המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של חלקיקים מגנטיים והערכה של תכונותיהם מחייב הדנ א באמצעות פיזור אור דינאמי ו electrophoretic. שיטה זו מתמקדת ניטור שינויים גודל החלקיקים, polydispersity שלהם, פוטנציאל זטה משטח החלקיקים אשר משחק מייג'ור תפקיד הכריכה של חומרים כגון ה-DNA.

חלקיקים מגנטיים-DNA מחייב ניתוח לפי פיזור אור דינאמי, Electrophoretic

למד לזהות ולכמת נזק חמצון ב-DNA באמצעות HPLC עם גילוי אלקטרוכימי. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה להערכת 8-oxo-dGuo בתאים וברקמות.

HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

גלה סרטונים נוספים