סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים
30 באפריל 2015
תא האנדותל הסינוסואידלי של הכבד הוא מערכת סינון חשובה מבחינה ביולוגית המושפעת מאוד ממחלות שונות, רעלים ומצבים פיזיולוגיים. שינויים אלה משפיעים באופן משמעותי על תפקוד הכבד. אנו מתארים שיטות לסטנדרטיזציה של מדידת הגודל ומספר הפנסטרציות בתאים אלה.
המטרה הכללית של הליך זה היא לנתח את האנדותל הסינוסואידלי של הכבד. זאת על ידי בידוד ראשוני של כבד וביצוע פרפוזיה בעזרת חומר מקבע. לאחר מכן, הכבד נחתך לבלוקים ומובא לייבוש (דהידרציה) כהכנה למיקרוסקופיה אלקטרונית.
לאחר מכן, דגימות הכבד עוברות ציפוי בשיטת sputter ונבדקות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים. לבסוף, המיקרוגרפים האלקטרוניים מנותחים, וחושבים את קוטר הפנסטרציות, תדירותן ואת אחוז הנקביות. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אלקטרונית משמשת להדגמת שינויים באנדותל הסינוסואידלי של הכבד תחת תנאים שונים.
שיטה זו מספקת לנו תובנה לגבי המבנה העל-מיקרוסקופי והמורפולוגיה של כלי הדם בכבד באנדותל שלהם. ניתן להשתמש בה גם כדי לבחון את הכליה והמוח באופן דומה. כל ההליכים הכוללים שימוש בבעלי חיים מבוצעים בהתאם לחקיקה המקומית. עבודה זו אושרה על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של מחוז הבריאות המקומי של סידני (Sydney Local Health District Animal Welfare Committee).
הפרוצדורות המותרות מתוארות בתיעוד רישיון הפרויקט ועוקבות אחר הנחיות המבטיחות את רווחת בעל החיים בכל עת. זהו ניתוח שאינו למיצוי (non survival surgery). לאחר הכנת המקבע, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לחמם את בופר הפרופוזיה ואת המקבע ל-35 עד 37 degrees Celsius.
לאחר הרדמת בעל החיים באמצעות הזרקה תוך-בטנית בודדת של ketamine ו-xylazine, העריכו את רמת הסדציה על ידי בדיקת נסיגת הגפיים האחוריות וצביטה בזנב. לאחר מכן, באמצעות מספריים בעלי קצה קהה, בצעו חתך בצורת Y בבטנו של בעל החיים כדי לחשוף את הכבד ואת הווריד הפורטלי. לאחר מכן, קשרו שתי תפרים רפויות מאוד סביב הווריד הפורטלי, אחת פרוקסימלית לכבד והשנייה דיסטלית יותר לכבד.
בצעו קנולציה של הווריד הפורטלי באמצעות קנולה IV בגודל מתאים. לאחר מכן, הדקו את התפרים כדי לקבע את הקנולה. כעת, באמצעות 5 עד 20 מיליליטר של PBS המחומם ל-37 °C, התחילו בפרפוזיה בלחץ של 10 סנטימטרים של H2O.
הימנעו מכניסת בועות אוויר לכבד, דבר שעלול ליצור ארטיפקטים ולחץ אוויר גבוה מדי שיפגע בכבד; חתכו את הווריד החלול הבטני והחזי (vena CVA) כדי לאפשר למסייד לצאת בחופשיות מהכבד. פעולה זו מונעת לחץ חוזר גבוה ונזק לכבד, לתאי הסינוסואיד, לתאי האנדותל או ל-LCCs. לאחר שהכבד נקי מדם, החליפו את ה-PBS במקבע למיקרוסקופיה אלקטרונית (em) ובצעו פרפוזיה עד שהכבד יהיה קשה וחיוור מאוד.
במשך כחמש דקות. לאחר מכן, בעזרת הסקלפל, חתכו את הכבד לקוביות של 1 עד 2 מילימטרים קובים. השתמשו במקבע (fixative) למשך השלב הבא.
קבע את הרקמה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות. לאחר מכן, העבר את הרקמה לתוך בופר נתרן Cate בריכוז 0.1 molar, ואחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים לצורך קיבוע הדגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת או SEM. לאחר ייבוש הדגימות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, סמן את בסיסם של תומכי ה-SEM המתכתיים והדבק סרט פחמן דו-צדדי בחלקם העליון של התומכים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), ובחן את הדגימות כדי לזהות את המשטח עם הסינוסואידים הטובים ביותר עבור SEM.
הניחו את התחרור, כאשר הפני המבנים פונים כלפי מעלה אל פני סרט הפחמן של הבסיס (stub), והצמידו אותו בחוזקה לבסיס. לאחר ביצוע ציפוי בגימור (sputter coating) ובדיקת SEM לפי הפרוטוקול הכתוב, פתחו תמונה ב-image J והשתמשו בסרגל קנה המידה המוטמע בתמונה כדי להגדיר את הקנה מידה; בעזרת כלי הפוליגון (polygon tool) ב-image J, סמנו את כל השטח השטוח של ה-LSEC, כולל אזורים עם חלונות (fenestrated) ואזורים ללא חלונות, והשמיטו חלקי פסולת גדולים הנמצאים על פני התא שעלולים להסתיר את החלונות. כדי למדוד את קוטר החלון, שרטטו קו לאורך הקוטר הארוך ביותר של כל חלון באמצעות בחירה בכלי הקו (line tool).
לחצו על M כדי למדוד את הקו ועל D כדי לצייר את הקו באופן קבוע על התמונה. קו זה מוגדר כקוטר הפנסטרציה (fenestration diameter) וכעת הוא יהיה זמין בתיבת התוצאות של Image J. מדדו את כל הפערים המהווים חורים גדולים יותר בציטופלזמה של ה-LSEC שגודלם מעל 250 nanometers, כמו גם את הפנסטרציות. חשבו את השטח של פערים שאינם עגולים על ידי שרטוט מסביב להם ושימוש ב-Image J לחישוב שטחם, והעבירו את הנתונים מתיבת התוצאות ב-Image J לגיליון אלקטרוני ב-Excel.
לניתוח נוסף, השתמש בנוסחאות הבאות לביצוע חישובי חלונות (fenestration). קוטר החלונות הממוצע שווה לממוצע של כל קוטרי החלונות. שטח החלונות שווה ל-pi r squared, כאשר R מחושב מקוטרי החלונות האינדיבידואליים.
אחוז הנקבוביות שווה לסיגמא פאי R בריבוע חלקי השטח הכולל שנבדק כפול מיקרונים כפול 100; יש להחריג את סכום שטחי הפערים מחישוב זה. להצגת הנתונים בפרסומים, יש לכלול את קוטר הפנסטראציה (fenestration) יחד עם הצהרה המאשרת כי קוטרי הגבול השמשו להגדרת הפנסטראציות, תדירות הפנסטראציות והנקבוביות. כמו כן, יש לכלול הצהרה המאשרת האם פערים נכללו בניתוח, גרף התפלגות תדירויות של קוטר הפנסטראציה ומספר בלוקי הכבד, וכן תמונות. הגדלה נמוכה באמצעות SEM חושפת משטח שטוח של דגימת הכבד עם שטח חשוף הגדול מספיק כדי להבחין בכלי דם רבים וגדולים של הכבד ובסינואידים, כולל את הנתיב הפורטלי ואת הווריד המרכזי, כפי שמוצג כאן.
הבטחת מיקום נכון של גוש הכבד על תושבת ההרכבה חיונית לקבלת תמונות ברורות של הסינוסואידים, ויש להימנע מהברקה של הקפסולה, המסתירה את כל פרטי הסינוסואידים של הכבד. מסיבה זו, כפי שמוצג כאן, הגדלה גבוהה יותר מאפשרת תצפית על הפנוסטרציות של ה-LSEC. פלטות של הפטוציטים עשויות להיראות ככלי דם, אך מאפיינים כגון ה-BLI מסייעים an ओरיינטציה.
איור זה מדגים כי לחץ פרפוזיה גבוה עלול לגרום לארטיפקטים כגון פערים גדולים באנדותל, אשר ככל הנראה נגרמים מהתמזגות של לוחות SIV של LSEC, הניתנים לזיהוי קל תחת SEM. הימנעות מסריקת ממברנת התא ישירות מעל הגרעינים, אשר עשויה להיראות כבליטה מתחת לפני השטח של ה-LSEC, תסייע בדיוק של חישובי צפיפות הפנסטרציות והנקביות. לבסוף, כימות של קוטר הפנסטרציות של LSEC, צפיפותן ותדירותן מספק מדידה אמפירית של הפנסטרציות ומאפשר מדידה של שינויים המושרים על ידי הזדקנות, מחלה, רעלים או טיפולים. לאחר הליך הפרפוזיה, ניתן לעבד את הרקמה עבור טכניקות אחרות כמו מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) לבחינת העל-מבנה התאי ומבנה המיטוכונדריה.
ניתן להשתמש בו גם עבור היסטולוגיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול סטנדרטי לניתוח המורפולוגיה של תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM). שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של גודל הפנסטראציות (fenestration), תדירותן והנקבוביות (porosity), שהן קריטיות להבנת האופן שבו גורמים פיזיולוגיים, פתולוגיים ופרמקולוגיים משפיעים על תפקוד הכבד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של הכבד
- מורפולוגיה תאית
- מיקרוסקופיה אלקטרונית
רקע
- לתאי LSECs יש חלונות (fenestrations) טרנס-תאיים המקלים על מעבר של חומרים מהדם לפרנכימה של הכבד.
- החלונות הם דינמיים וגודלם ומספרם עשויים להשתנות בתגובה למחלה, לתרופות או למצבים פיזיולוגיים.
- כימות מדויק של החלונות חיוני לחקר תפקודי הכבד והפתולוגיה שלו.
- פרוטוקולי דימוי וניתוח סטנדרטיים נחוצים לצורך הדירות והשוואתיות בין מחקרים.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול הניתן לשחזור לצורך קיבוע, עיבוד ואנליזת SEM של LSECs.
- מתן אפשרות למדידה מדויקת של קוטר הפנסטראציות, תדירותן והנקבוביות.
- סיוע בחקר שינויים מורפולוגיים ב-LSEC תחת תנאים ניסיוניים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע בפרפוזיה של הכבד באמצעות בופרים ומקבעים מחוממים.
- דיסקציה וחיתוך של רקמת כבד לבלוקים קטנים.
- דהידרציה, הרכבה וציפוי בגימור התזה (sputter coating) של הדגימות עבור SEM.
- דימוי SEM בהגדלות שונות להדמיית פנסטרציות של LSEC.
- ניתוח כמותי של תמונות באמצעות ImageJ למדידת קוטר הפנסטרציות, שכיחותן ואחוז הנקביות.
תוצאות עיקריות
- SEM מאפשר ויזואליזציה ברורה של פנסטרציות (fenestrations) ב-LSEC ומבני סינוסאידים בכבד.
- לחץ פרפוזיה תקין וטיפול נכון ברקמה הם קריטיים כדי למנוע ארטיפקטים כגון מרווחים מלאכותיים.
- ניתוח כמותי מספק נתונים אמפיריים על קוטר הפנסטרציות, צפיפותן והנקבוביות (porosity).
- הפרוטוקול מאפשר זיהוי של שינויים מורפולוגיים ב-LSECs המושרים על ידי הזדקנות, מחלה, רעלים או טיפולים.
מסקנות
- פרוטוקול SEM סטנדרטי זה מספק מדידות מהימנות וניתנות לשחזור של פנסטרציות (fenestrations) בתאי LSEC.
- ניתוח מורפולוגי מדויק תומך במחקרים על תפקודי הכבד ופתולוגיה.
- ניתן להתאים את השיטה לניתוח של איברים אחרים כגון הכליות והמוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
כימות מדויק של פנסטרציות (חלוןיות) בתאי אנדותל סינוסואידליים בכבד מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות למחלות מטבוליות ולרעילות כבדית. ניתוח סטנדרטי המבוסס על SEM מספק ביטחון חיזוי להערכת שינויים אנדותליים המושרים על ידי תרכובות, ובכך תומך בהחלטות מוקדמות של המשך או הפסקה (go/no-go) בתהליכי הגילוי. שיטה זו משפרת את הרצף התרגומי על ידי קישור פנוטיפים אולטרה-מבניים לתוצאות של תפקודי כבד במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות כימות קוטר החלונות (fenestrations), תדירותם והנקבוביות (porosity) כמדדים תפקודיים של הפנוטיפ של LSEC.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הערכה אולטרה-מבנית הדירה של מנגנוני חדירות אנדותליאלית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בביטחון חיזוי בבחירת מטרה על ידי קישור דינמיקת החלונות למצבים פיזיולוגיים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, באמצעות קביעת מדדי בסיס של חלוליות (fenestration).
- ערך תפעולי: טיפול בסטנדרטיזציה והדירות של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים קבועים של פרפוזיה, קיבוע וניתוח תמונות.
- ערך אסטרטגי: הדגשת המוכנות לסריקה באמצעות פלטים כמותיים המופקים מ-SEM, המתאימים לאפיון פנוטיפי אנדותל רב-תוכן (high-content).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלות על ידי אפשור זיהוי שינויים בחלונות (fenestrations) בתגובה לרעלים, הזדקנות או מצבי מחלה.
- ערך תפעולי: מתאר המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות ניתוח מורפומטרי עקבי של LSEC.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכון על ידי אספקת נתונים אמפיריים על שלמות האנדותל תחת תנאים ניסיוניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
ממקמת את השיטה בתוך רצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, שבה תקינות האנדותל משמשת לבסיס להערכת תרכובות המבוססת על מנגנון.
- ביולוגיה של הגילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות, הבהרת מסלולים או הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מורפומטריה של חלונות (fenestration morphometry).
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה, השחזוריות או התוצרים הכמותיים כאשר הדבר נתמך במאמר.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות, קריאות (readouts) או תוצרים סטטיסטיים המסייעים לצוותים להשוות תנאים בין קבוצות ניסוייות.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית או להתאמה של סמנים ביולוגיים (biomarkers) רק כאשר המקור תומך בכך.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת ניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון במיקדי חיזוי, תיקוף מטרות, וצמצום עמימות מכניסטית בהערכת תפקוד אנדותליאלי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של תהליכי עבודה לפנוטיפ של LSEC.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון, וצמצום סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות המכוונות לכבד.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על שינויים אנדותליאליים מדידים.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בהכנת דגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית ובניתוח מורפומטרי.
- צרכים של תשתיות אנליטיות וציוד, כולל SEM, מכשיר לציפוי בגימור (sputter coater) ותוכנה לניתוח תמונות.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולים של קיבוע, דהידרטציה ודימות בין מעבדות.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל שונות, כגון אנדותל של הכליות והמוח, כפי שצוין במקור.
- מגבלות מעשיות הנתמכות בחומרי המקור, כולל מניעת ארטיפקטים הנובעים מלחץ פרפוזיה והנחה נכונה של הדגימה.
