סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את האנדותל הסינוסואידלי של הכבד. זה מושג על ידי בידוד כבד תחילה והחדרתו לקיבוע. לאחר מכן, הכבד נחתך לבלוקים ומיובש כהכנה למיקרוסקופ אלקטרונים.

לאחר מכן דגימות הכבד מצופות במקרטע ונבדקות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים. לבסוף, מנתחים את המיקרוגרפים של האלקטרונים ומחושבים קוטר ותדירות ואחוז נקבוביות. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אלקטרונים משמש להצגת שינויים באנדותל הסינוסואידלי של הכבד בתנאים שונים.

שיטה זו מספקת לנו תובנה לגבי מבנה האולטרה והמורפולוגיה של כלי הדם בכבד באנדותל שלהם. ניתן להשתמש בו גם לבדיקת הכליה והמוח באותו אופן כל ההליכים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים מבוצעים על פי החקיקה המקומית. עבודה זו מאושרת על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים במחוז הבריאות המקומי של סידני.

הנהלים המותרים מתוארים בתיעוד רישיון הפרויקט ועוקבים אחר הנחיות המבטיחות את רווחת בעל החיים בכל עת. זהו ניתוח שאינו הישרדותי. לאחר הכנת הקיבוע, על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחמם את מאגר הזילוף והקיבוע בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס.

לאחר שהחיה מורדמת בזריקה תוך-צפקית אחת של קטמין וקסילזין, העריכו את רמת ההרגעה על ידי נסיגה מהגפה האחורית וצביטה בזנב. לאחר מכן, בעזרת מספריים קהים, בצע חתך Y בבטן החיה כדי לחשוף את הכבד ואת וריד הפורטל. לאחר מכן קשרו שני תפרים רופפים מאוד סביב וריד הפורטל, האחד פרוקסימלי לכבד והשני רחוק יותר לכבד.

קנול את וריד הפורטל עם צינורית IV בגודל מתאים. לאחר מכן הדק את התפרים כדי לאבטח את הצינורית. כעת באמצעות חמישה עד 20 מיליליטר PBS חם עד 37 מעלות צלזיוס, התחל בזלוף בלחץ של 10 סנטימטרים של H2O.

הימנעו מבועות אוויר שנכנסות לכבד, שייצרו חפצים ולחץ אוויר גבוה מדי, שיפגעו בכבד, חתכו את הווריד הנבוב הבטני ובית החזה כדי לאפשר למאגר לצאת בחופשיות מהכבד. זה מונע לחץ גב גבוה, נזק לתאי כבד, סינוסואידים ואנדותל או LCC. ברגע שהכבד נקי מדם, החלף את ה-PBS במיקרוסקופ אלקטרונים או em, מקבע ומחלחל עד שהכבד מתקשה וחיוור מאוד.

כחמש דקות. ואז בעזרת האזמל, חותכים את הכבד לבלוקים של מילימטר מעוקב עד שניים. השתמש ב-em fixative כדי לפרסם.

תקן את הרקמה בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות. לאחר מכן העבירו את הרקמה למאגר נתרן קייט 0.1 מולרי, ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים כדי להרכיב את הדגימות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים או SEM. לאחר ייבוש הדגימות על פי פרוטוקול הטקסט, סמן את בסיס בדלי המתכת של SEM והחל סרט פחמן דו צדדי על החלק העליון של הבדלים תחת מיקרוסקופ מנתח, דמיין את הדגימות כדי לזהות את המשטח עם הסינוסואידים הטובים ביותר עבור SEM.

תחרה, משטח נבחר הפונה כלפי מעלה על משטח סרט הפחמן של הבדל ומדביק אותו בחוזקה על הבדל. לאחר ביצוע ציפוי מקרטע ו-SEM בהתאם לפרוטוקול הטקסט, פתח תמונה בתמונה J והשתמש בסרגל קנה מידה המוטבע בתמונה כדי להגדיר את קנה המידה באמצעות כלי המצולע בתמונה J עקבות סביב כל השטח השטוח של ה-LSEC, כולל אזורים מרופדים ומנופחים, לא לכלול חתיכות גדולות של פסולת שנמצאות על פני התא שעלולות לטשטש את ה-fenestrations. כדי למדוד את קוטר ה-fenestration, הנח קו בקוטר הארוך ביותר של כל fenestration על ידי בחירה בכלי הקו.

הקש M כדי למדוד את הקו ו- D כדי לצייר לצמיתות את הקו על התמונה. קו זה מוגדר כקוטר ה-fenestration ויהיה זמין כעת בתיבת התוצאות של תמונה J.מדוד את כל הפערים שהם חורים גדולים יותר בציטופלזמה של LSEC מעל 250 ננומטר, כמו גם פנסטרציות. חשב את שטח הרווחים שאינם מעגליים על-ידי מעקב אחריהם ושימוש בתמונה J כדי לחשב את השטח שלהם מעבר לנתונים מתיבת התוצאות בתמונה J לגיליון אלקטרוני של Excel.

לניתוח נוסף, השתמש בנוסחאות הבאות לביצוע חישובי fenestration. קוטר הפנסטרציה הממוצע שווה לממוצע של כל קוטר הפנסטרציה. שטח ה-fenestration שווה ל-pi r בריבוע כאשר R מחושב מקוטר fenestration בודד.

אחוז הנקבוביות שווה לסיגמא pi R בריבוע על פני השטח הכולל שנותח ומיקרונים כפול 100 אינם כוללים את שטח סכום הפערים מחישוב זה. כדי להציג את הנתונים בפרסומים, יש לכלול קוטר fenestration עם הצהרה המאשרת כי קוטר הגבול שימש להגדרת fenestrations, תדירות fenestration ונקבוביות, כולל גם הצהרה המאשרת אם נכללו פערים בניתוח וגרף התפלגות תדרים של קוטר fenestration ומספר גושי הכבד וכן תמונות. הגדלה נמוכה על ידי SEM חושפת משטח שטוח של דגימת הכבד עם שטח חשוף גדול מספיק כדי לצפות בכלי כבד גדולים וסינוסואידים רבים, כולל מערכת הפורטל, ו-ES מרכזי כפי שמוצג כאן.

הקפדה על מיקום נכון של בלוק הכבד על בדל ההרכבה חיונית להשגת תמונות ברורות של הסינוסואידים ויש להימנע מקפסולת הנצנצים, המכסה את כל פרטי הסינוסואידים של הכבד. מסיבה זו, כפי שמוצג כאן, הגדלה גבוהה יותר מאפשרת תצפית על פנסטרציות LSEC. לוחות ההפטוציטים יכולים להיראות כמו כלי דם, אך תכונות כמו ה-BLI מסייעות להתמצאות.

איור זה מדגים כי לחץ שפע גבוה יכול לגרום לחפצים כגון פערים גדולים באנדותל הנחשבים כנגרמים על ידי התלכדות של לוחות LSEC SIV המזוהים בקלות תחת SEM, הימנעות מקרום התא ישירות מעל הגרעינים, שניתן לראות כבליטה מתחת לפני השטח של ה-LSEC תסייע לדיוק של חישובי צפיפות ונקבוביות. לבסוף, כימות של צפיפות ותדירות קוטר ה-LSEC מספק מדידה אמפירית של פנסטרציות ומאפשר מדידות של שינויים הנגרמים על ידי מחלות הזדקנות, רעלים או טיפולים. לאחר הליך הזילוף, ניתן לעבד את הרקמה לטכניקות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כדי להסתכל על מבנה אולטרה תאי, מבנה מיטוכונדריאלי.

זה יכול לשמש גם להיסטולוגיה.