בידוד של תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם EAE

שלום, אני כריסטין ביטון. אני עוזרת מחקר במעבדתו של ג'ורג' צ'ן במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה של אוניברסיטת קליפורניה ארווין. והיום אני אראה לכם כיצד לבודד תאי מונונוקלאריים ממערכת העצבים המרכזית של חולדות.

פרוצדורה זו כוללת הרדמה עמוקה של חולדה לביצוע פרפוזיה לבבית, כדי למנוע זיהום של דם במערכת העצבים המרכזית. לאחר מכן, נוציא את המוח ואת חוט השדרה ונכין תמיסת תאים בודדים (single cell suspension) באמצעות מסננת תאים, ולאחר מכן נבודד את התאים חד-גרעיניים (mononuclear cells) באמצעות גרדיאנט כפול של Percoll. אז בואו נתחיל.

אני מוכן כעת לבצע את הפרפוזיה הלבבית, לכן אציג את כל החומרים הדרושים לכך. הדבר הראשון שנצטרך הוא צנצנת ואקום (Bell jar), ובחלק התחתון הנחנו נייר סופג ספוג בחומר הרדמה נדיף. ניתן להשתמש ב-halothane או ב-isoflurane.

הדבר הבא שנזדקק לו הוא אביזר להחזקת החולדה ואביזר לאיסוף הדם. לכן, יש לנו התקנה מאולתרת זו לביצוע פרפוזיה לחולדות. אתם תשתמשו במחט בכילוי 21 gauge, ונבצע פרפוזיה של תמיסת סלין המוגשת בכוח הכבידה דרך מערכת פרפוזיה תוורידית (IV).

אם אין לכם גישה לאחת מהמערכות הללו, תוכלו גם למלא מספר מזרקים בתמיסת סלין ולבצע פרפוזיה ידנית. אך הדרך הזו קלה הרבה יותר. כמו כן, נזדקק לגוף של מזרק בנפח 10 mil שבו הנחנו ניגוני Kim wipes.

אני אשים פנימה מעט מהחומר ההרדמתי, כדי למרוח אותו על אפו של החולדה ולהבטיח שהיא תישאר תחת הרדמה עמוקה במהלך הפרוצדורה. ולאחר מכן, כמובן, נדרשים מכשירים. היום לא אבצע את הפרוצדורה באופן סטרילי, מכיוון שאיני מתכוון להעביר את התאים לתרבית.

לכן, כל המכשירים שבהם אני משתמש אינם סטריליים. אך כמובן, אם ברצונכם להעביר את התאים שלכם לתרבית, תרצו להשתמש במכשירים סטריליים. לצורך סרטון זה, אשתמש בחולדה שהיא למעשה מתה.

כך אוכל לבצע את הפרוצדורה באיטיות כדי להראות לכם אותה, שלב אחר שלב. כמובן שבפרוצדורה אמיתית, תצטרכו שהחולדה תהיה תחת הרדמה עמוקה, אך לא מתה. תרצו שהלב עדיין יפעם.

בואו נתחיל עם חולדה זו. הנחתי את החולדה כך שגבה פונה אלי, והנחתי מגבוני שתן ספוגים על אפה. הדבר הראשון שאעשה הוא לבדוק שהחולדה נמצאת תחת הרדמה עמוקה.

לכן עליכם לבצע זאת לפני כל אחד מההליכים הללו. אני לוקח את הפינצטה וצובט את החולדה, ואין תגובה כלל. אם יש תגובה כלשהי, עליכם להחזיר את החולדה למכשיר ההרדמה כדי לוודא שהיא תחת הרדמה עמוקה.

לאחר מכן אשתמש ב-70% ethanol כדי להשרות את החלק העליון של החולדה. לאחר מכן אפתח את חלל בית החזה. ראשית אגזור את העור ואפתח אותו מהצד.

כעת אני אפתח את החלל עצמו. המסה כאן היא הלב. כאן ניתן לראות את העליה הימנית.

זה החלק שאחתוך כדי לאפשר לדם לזרום החוצה. וכדי לבצע פרפוזיה לכל הגוף, אני צריך להחדיר את המחט שלי לחדר השמאלי. לכן, אני אחדיר את המחט שלי ממש כאן למטה.

לאחר הכנסת המחט, אפתח את צינור ה-IV כדי לאפשר למלח (saline) לזרום, ואשאיר זאת למשך חמישה עד 10 דקות. אם הפרפוזיה טובה, ניתן יהיה לראות שינוי בצבע של הדופק האדום, האף האדום וכמובן העיניים של החולדה, דבר המעיד על כך שהדם יוצא מגוף החולדה. המשמעות היא שהפרפוזיה אמורה להיות טובה.

הנה החולדה לאחר פרפוזיה לבבית. כפי שניתן לראות, האף, האוזניים והעיניים של החולדה הזו כבר אינן ורודות או אדומות. הן לבנות לחלוטין, מה שמעיד על כך שהפרפוזיה הצליחה.

כל הדם או רובו יצא מנקודות הדיגום של החולדה. כעת, לאחר שהחולדה עברה פרפוזיה לבבית, עליי להסיר את ראשה. עליי לבצע דקפיטציה לחולדה.

עבור כך אשתמש בציוד מעבדה רגיל. כעת אני עומד להוציא את המוח מהחולדה. אני אשרה את כל הפרווה ב-70% ethanol כדי למנוע התפזרות של שערות מסביב.

כעת אסיר ראשית את העור. מכיוון שאיני מעוניין להשתמש במוח עבור היסטולוגיה, ואתגחח אותו לחלקים קטנים, איני מקפיד באופן מוחלט להוציאו בצורה נקייה. כחתיכה אחת, אני מכניס את המספריים לבסיס הגולגולת, במקום שבו המוח מתחבר לעמוד השדרה, ממש כאן.

אני אגזור את העצם מכל צד ולאחר מכן אסיר את החלק העליון. אני אבצע זאת שוב ושוב. כעת המוח חשוף לחלוטין.

וכפי שניתן לראות, הפרפוזיה הצליחה היטב מכיוון שהמוח נקי לחלוטין. בבעל חיים שלא עבר פרפוזיה, ניתן היה לראות שהשכבה העליונה של המוח מכוסה לחלוטין בנימי דם אדומות, כך שלא רואים אותן כלל, מה שמעיד על כך שהפרפוזיה הצליחה היטב. כעת אני עומד להוציא את המוח, תוך כדי שביעות רצון מכך שלא השארתי את הבצולת האפיתית מאחור, ואני אשים אותו במבחנה המכילה PBS קר על קרח.

כעת, עדיין מבלי להקפיד יתר על המידה על שמירת השלמות, אני אכניס את המוח לשפופרת עם PBS, אגזור את העצבים האופטיים, ולאחר מכן, בעזרת שפכטל, הוא ייخرج בקלות רבה. כעת אני אסיר את חוט השדרה מאותה חולדה. ושוב, מכיוון שנגזור אותו לחתיכות קטנות, לא אקפיד יותר מדי על הוצאתו בצורה נקייה לחלוטין, כל עוד אצליח להוציא את כולו.

ראשית אני חותך את העור לאורך כל עמוד השדרה, ועמוד השדרה נראה כאן. לאחר מכן אני מסיר את הבשר כאן כדי שעמוד השדרה יהיה חשוף לכל אורכו. וממש כאן ניתן לראות את חוט השדרה.

לכן בעכבר, ניתן לחתוך את שני הקצוות ולהזריק PBS בעזרת מזרק, ואז חוט השדרה ייצא כמעט כיחידה אחת. אך בחולדות זה לא כל כך פשוט. אני חייב לחתוך את המבנה ולגרוף את חוט השדרה החוצה.

כעת אני חותך משני הצדדים, ובדומה למה שעשיתי עם המוח, אני חותך ומסיר את העצם כדי לחשוף את חוט השדרה. בדומה למוח, חוט השדרה לבן לחלוטין, מה שמעיד על כך שהפרפוזיה הלבבית עבדה היטב. אני אבצע זאת לאורך כל עמוד השדרה.

אני יורד עד לגובה של הירכיים הימניות, שנמצאות ממש כאן. לאחר מכן, אשתמש בפינצטה – וזה לא נראה יפה במיוחד – אך אני פשוט אמשוך החוצה את חוט השדרה ואעביר אותו למבחנה יחד עם המוח. כעת, במבחנה שלי, נמצאים גם המוח וגם חוט השדרה של החולדה, ואני מוכן להכין את תרחיף התאים הבודדים.

כעת אני מוכן להכין תרחיף תאים בודדים ממערכת העצבים המרכזית שלי. לשם כך אזדקק לצלחת פטרי בנפח 10 סנטימטר, בתוכה אמקם מסננת תאים של 70 מיקרון. כמו כן, אשתמש בבוכנה של מזרק של 1 מיליליטר, ואזדקק לפינצטה ומספריים.

כעת אעביר את הדגימה למסננת התאים ואוודא שלא נשאר דבר במבחנה. לאחר מכן, אגזור אותה לחתיכות קטנות, כאשר המוח וחוט השדרה מעורבבים יחד. כשכל החומר יהיה קצוץ סופית, אשתמש בבוכנה של מזרק O'Neill ואדחף אותו דרך המסננת.

ניתן יהיה לראות כי ה-PBS מחוץ למסנן התאים הופך לעכור יותר ככל שתאים בודדים עוברים דרכו. כמובן, לו הייתי רוצה לערבב את תרחיף התאים, הייתי עושה זאת בתוך מנדף תרביות רקמה ולא הייתי מכניסה אליו את אצבעותיי. כעת, כאשר ה-PBS עכור, אני אאסוף אותו בפעם הראשונה ואעביר אותו למבחנה של 50 ml.

אך אשמור על ערנות ואוסיף עוד PBS למסנן התאים שלי, ואעביר אותם בלחיצה. מכיוון שה-CNS מכיל כמות גדולה של שומן, זהו אחד האיברים שבהם אני מוצא את הכנת תרחיף התאים בטכניקה זו כקשה ביותר. לכן, העברתי את כל ה-CNS שלי דרך מסנן התאים מספר פעמים, ואספתי את כל תרחיף התאים הבודדים.

והנה המבחנה שמילאתי עד 50 mil ב-PBS המכיל את תרחיף התאים הבודדים שהכנתי מה-CNS של הצד הימני. כעת, אסבב את המבחנה זו כדי להכין אותה לגרדיאנט, והתאים סיימו להסתובב. קיבלנו כעת משקע, לכן אשליך את העלייה ואשחפ תאים מחדש ב-20 milliliters של 30% Percoll ב-PBS.

ואני אעביר זאת על גבי 10 µL של 70% Percoll ב-PBS כדי ליצור גרדיאנט נדידה. לפיכך, אני משליך את העל-נוזל. אני מפרק את המשקע כדי לוודא שהתאים נמצאים בתליה בודדת ולא끔 גוש במשקע.

כעת יש לי תמיהה של תאי CNS כתמיהה של תאים בודדים. אני אשעיה את התאים הללו ב-20 mls של 30% Percoll ב-PBS, ואני אניח את ה-20 mls הללו מעל 10 mls של 70% Percoll ב-PBS. לאחר מכן, אני אבצע סבוב בצנטריפוגה.

כעת אקח את 20 ml של תרחיף ה-CNS, ואעביר אותו באיטיות מעל שכבת ה-70% Percoll כדי להקל על התהליך. ניתן להוסיף צבע כמו phenol red לאחת השכבות, אך איני בטוחה מהי השפעתו על התאים, אם בכלל ישנה כזו. לכן, אני מנסה להימנע מכך.

יש להמשיך באיטיות מספיקה כדי שהשתי שכבות לא יתערבבו, ולכן יש להימנע מיצירת טורבולנציה משמעותית בשכבה התחתונה. ככל שהשכבה העליונה הופכת לעבה יותר, ניתן להגביר את המהירות. כעת הוספתי את התאים למדרג.

אם כן, השכבה השקופה כאן למטה היא שכבת ה-70% Percoll, והשכבה העכורה למעלה היא שכבת 30% Percoll המכילה את תרחיף התאים הבודדים שלי. כעת אני אכניס את המבחנה הזו לצנטריפוגה למשך 20 דקות, ואוכל לראות את שכבת תאי המונונוקליאריים אם הפעולה בוצעה כהלכה. כעת סיימנו את סבב הצנטריפוגה של המעבר (Gradient).

כך שבתמיד, סובבים את המדרג (gradient), תוך הקפדה רבה לכבות את הבלם כדי שלא יפריע למדרג על ידי האטה מהירה מדי. וכעת יש לנו את השכבות. בחלקו העליון של המדרג ישנה שכבת שומן שאסיר כדי למנוע זיהום של תרחיף התאים שלי.

ובממשק בין שתי השכבות של perkel 30% ו-70% ניתן לראות שהממשק אינו חד, הוא מטושטש, ושם נמצאים התאים. לאחר שאסיר את התאים, תראו שהממשק יהיה חד בהרבה. לכן, אני פשוט אסיר את רוב השומן מהשכבה העליונה ואשליך אותו לפסייד.

אינני צריך להסיר את כולו, אך אני רוצה להסיר מספיק כדי שלא יכסה לחלוטין את הפ pipette כאשר ארד כדי להוציא את תאי ה-monocle. וכעת, באמצעות pipette העברה אחרת, אגיע לרמת הממשק ואאסוף את התאים שלי. כעת אספתי מספר מיליליטרים מהממשק.

לכן, ככל הנראה קיבלתי שם את כל התאים שניתן להשיג. מספר התאים המונונוקליאריים במערכת העצבים המרכזית (CNS) היה קטן מאוד. כעת, התאים המונונוקליאריים שלי נמצאים במבחנה.

אני אמלא את המבחנה עד 50 ml עם PBS, ואסבב את התאים במ centri-fuge כדי לשקע אותם, ובכך אשטוף את ה-perle. אני ממליץ לשטוף אותם לפחות פעמיים עם מבחנה מלאה ב-PBS כדי לוודא שכל ה-perle הוסר. לאחר מכן התאים מוכנים לכל פרוצדורה שתרצו לבצע איתם.

היום הצגתי בפניכם כיצד לבודד תאים מונונוקליאריים ממערכת העצבים המרכזית של חולדות. כמובן, לאחר קבלת התאים המונונוקליאריים, ניתן לטהר אותם עוד יותר כדי לבודד, לדוגמה, לימפוציטים מסוג T מתוך האוכלוסייה. מה שאעשה עם תאים אלו הוא להריץ בדיקת ציטומטריה זרימה כדי לזהות את אוכלוסיות התאים שהיו במוח שלי.

ובהצלחה בבידוד התאים שלכם.