Name: בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: למדו שיטה לבידוד והשתלת שתלי הרתי מעכברים תורמים בני שונים לנמקטים חסרי חיסון. שיטה זו מאפשרת ניתוח מעבדה של התפתחות תאי T ובחירת תימית בתנאי גוף חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון שהתקבל מהמכונים הלאומיים לבריאות (1R01AI083269).

המחקרים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;פל היל וכל הטיפול בבעלי החיים היה בהתאם להנחיות IACUC. 1. הכנת היילוד והמבוגרים Thymi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל חומרים כימיים וציוד לפני הרדמת חסד עכברים תורמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירי ניתוח על ידי מעוקר או שיטות מתאימות אחרות. כל הניתוחים חייבים להתבצע בזרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים ולמנוע זיהום. להרכיב את הכלים דרושים להפקת thymi מעכברי תורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת 60 מ&quot;מ עם סטרילי 1X PBS (pH 7.4) ומניח על קרח בתוך מכסה המנוע. זה ישמש לthymi חנות בקצרה נכרת מעכברי תורם לפני ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם להנחיות אתיות, להרדים עכברי תורם יילוד על ידי עכברי עריפת ראש ותורם למבוגרים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לremoval של התימוס: הנח את העכבר במצב שכיבה על גב מגבת נייר סופג סטרילית ולרסס עם אתנול 70% לפני ביצוע חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל הבטן ובית חזה על ידי ביצוע חתך קו האמצע דרך העור. מקפלים את העור מעל החזה וforelimbs כדי לחשוף את חלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חתכים רוחב דרך הסרעפת ובית החזה כדי לחשוף חלל החזה מעולה וקדמי חלל בית חזה. התימוס צריך להיות גלוי כשתי אונות הלבנות מייד לעיל וצמוד ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את רקמות חיבור המקיפות את בלוטת התימוס עם מלקחיים בסדר, מה שהופך את מסוים לא לשבש את הכמוסה. בעוד מתאפק בית החזה עם מלקחיים, להשתמש זוג שני של מלקחיים כדי לחלץ שתי אונות של בלוטת התימוס ידי מיקום מלקחיים מעוקלים מתחת לאיבר ומושך בצורה אנכית. ניתן לעשות זאת באמצעות היקף ניתוחים לחילוץ thymi מעכברים שזה עתה נולד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התימוס בdi 60 מ&quot;מsh מכיל סטרילי 1X PBS (pH 7.4) על קרח ואונות הרתי נפרדות על ידי חיתוך דרך מצר החיבור. הסר את כל פסולת מהאונות הרתי ביצוע מסוים שלא לפגוע בכמוסה, ולחתוך את התימוס למספר המתאים של חלקים להשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל לתפעל thymi התקבל מעכברים שזה עתה נולד. הערה: משמשת למקסימום של שני עכברי נמען (אונה 1 למקבל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלת thymi התקבל מעכברים בוגרים למקסימום של 4-6 עכברי נמען. בעזרת זוג המלקחיים, לתפוס בזהירות אונת הרתי מבוגר אחד, כפי שמוצג באיור 1, חתך התימוס לשלושה חלקים שווים באמצעות מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.3-1.4 עבור כל עכבר תורם. על מנת להגביל את הזמן thymi נחשפים, להכין התימוס תורם 1 בכל פעם. </li></ol> 2. קורנית השרשה תחת הקפסולה הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הציוד מעוקר מראש המפורטים בטבלה 1. ספטית פרופרטכניקה צריכה להיות מנוצלת במהלך ההליך כדי למנוע חשיפת השתלת נמענים לכלים או חומרים כימיים מזוהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההשתלה, לשקול ולתייג כל עכבר נמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרוסקופ לנתח ומעגל הרדמה בזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש במכונת גילוח חשמלי, לגלח את הצד השמאלי של עכבר הנמען ולהבטיח שאין שיער נשאר מסביב לאזור המשמש לחתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מאדה isofluorane ולהרדים את העכבר באמצעות מינון של בין 1-2%. לברר הרדמה מתאימה לפני תחילת ההליך הכירורגי על ידי בדיקת עדר רפלקס הבא קמצוץ הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים כראוי, להחיל משחה וטרינרים לעיניים של העכבר כדי למנוע יובש ולהכין את העכבר להשתלה באופן הבא: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר תחת מיקרוסקופ לנתח במצב שכיבה לרוחב תקין כך שהצד המגולח פונה כלפי מעלה. Starting במרכז אזור הניתוח, לוותר בתנועה מעגלית באמצעות אתנול 70% פיפטה העברה חד פעמית, ואחריו povidone- יוד (בבטאדין). חזור על הטיפול באתנול / בטאדין 3 פעמים לפני ביצוע חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים לנתח באמצעות לעשות חתך אגף 1-2 סנטימטר ישירות מעל הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בינוניים לתפוס רקמות חיבור סמוכות לכליות ועדינות להרים את הכליות, כך שהוא נמצא על גבי השרירים. כדי לשמור על הכליות חשופות ובמקום מעל השרירים, להכניס יד אחת של מלקחיים בינוניים מתחת לכליות, תשומת לב מיוחדת לא לשבש את הכסל הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע התייבשות רקמות, להשקות את הכליות עם סטרילי 1X PBS (pH 7.4) בכל שלב, עד מניפולציה של הקפסולה הכליות וכליות הוא מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר לצבוט ולהרים את הקפסולה בסמוך לקצה של הכליה דיסטלי ביותר לבלוטת יותרת הכליה כדי להפריד אותה מהכליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מד 18מחט לעשות חתך גדול מספיק כדי להכניס את פיסת התימוס תורם (איור 2 א) מוכנה. ודא לשמור חתך קופסית קטן ככל האפשר כדי למנוע פריקה של השתל לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על הכמוסה התרחקה מהכליות, להשתמש זוג שני של מלקחיים בסדר להכניס את השתל מתחת לכמוסה ולדחוף את התימוס ככל קדימה מחתך קופסית ככל האפשר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המלקחיים מתחת לכליה, ובעדינות לחזור הכליות בחזרה למקום דרך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את השרירים על ידי תפירת קיר הבטן ויישום בטאדין נסגר פעם אחת. לאחר התפירה היא מלאה, להחיל קליפים פצע כדי לסגור את הדרמיס ולהחיל בטאדין לסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את העכבר לכלוב שכבר חימם באמצעות מנורת חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג כל עכבר שלאחר ניתוח עד שהוא חוזר להכרה וניידות מלאה ואל תניח tha עכבריםלא לא התאושש הבא הרדמה לתוך כלוב עם בעלי חיים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את העכברים עם תרופות לאחר ניתוח טיפול בכאבים בהתאם לצורך. לספק עכברים עם משככי כאבים שלאחר ניתוח כגון פרצטמול במי השתייה בריכוז של 1.6 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.3-2.9 עבור כל עכבר נמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שתמורת עכברים לפעילות רגילה תוך שלאחר ניתוח 1 שעה. צג משקל לאחר ניתוח, כישורים מוטוריים, כמו גם את פעילות השתייה והאכלה של כל עכבר כדי לקבוע סיבוכים הנובעים כתוצאה מהליך ההשתלה. הערה: ירידה במשקל לאחר ניתוח, בהשוואה למשקל טרום ניתוחי, כמו גם ניידות שינתה או כישלון לאכול או לשתות עשוי להצביע על סיבוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הכינון מחדש של תאי T בדם היקפי על ידי דימום עכברים באמצעות זנב ניק ואחרי הפרדה של לימפוציטים באמצעות מדיה הפרדת תא Lympholyte על פי המפרט של היצרן. להשיג characteriza תא Ttion על ידי צביעה לימפוציטים עם נוגדנים מצומדות fluorescently ספציפיים לתא T סמני CD3, CD4, CD8 ו, כמו גם מאבחן מת חי כגון succinimidyl אסתר מופעלת fluorescently 8. ניתוח כפי שמוצג באיור 3 ניתן להשיג באמצעות gating על singlets, תאי חיים, ותאים חיוביים CD3. </li></ol>

<ol><li>Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+tolerance+by+clonal+elimination+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell tolerance by clonal elimination in the thymus.</a> Cell. 49 (2), 273-280 (1987).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%E2%80%99t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see).</a> Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li>
<li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+immunologic+self-tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acquisition of immunologic self-tolerance.</a> Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).</li>
<li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+central+tolerance+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A defect in central tolerance in NOD mice.</a> Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+central+tolerance+with+reaggregate+thymus+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures.</a> Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+development+of+autoreactive+T+cells+in+NOD+mice+is+regulated+in+an+age-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner.</a> J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+6.+Immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Chapter 6. Immunophenotyping.</a> Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Rice, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+transplantation+for+complete+DiGeorge+syndrome%3A+medical+and+surgical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations.</a> J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).</li>
<li>Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarkert%2C+ML+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 341, 1180-1189 (1999).</li>
<li>Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus transplantation.</a> Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).</li>
<li>Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+peripheral+T-cell+depletion+in+transplantation+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).</li>
<li>Albuquerque, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FOXN1-Deficiency+is+associated+with+ab+double-negative+and+FoxP3%2B+T-cell+expansions+that+are+distinctly+modulated+upon+thymic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation.</a> PLoS One. 7 (5), e37042(2012).</li>
<li>Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+transplantation+restores+the+repertoires+of+forkhead+box+protein+3+%28FoxP3%29%2B+and+FoxP3-+T+cells+in+complete+DiGeorge+anomaly%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly.</a> Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).</li>
<li>Savino, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymus+is+a+common+target+organ+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The thymus is a common target organ in infectious diseases.</a> PLoS Pathog. 2 (6), e62(2006).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.

אירועים המסדירים את הברירה התימית אינם מובנים היטב. מחקרים אחרונים הראו שינויים אונטוגניים ביעילות הברירה. צימוד גישה זו עם עכברים שונים של תורם ותימוס טרנסגני יקל עוד יותר על מחקרים לזיהוי האירועים והפרמטרים המווסתים את הברירה התימית. יש לציין כי השתלת בלוטת התימוס משמשת לטיפול וניהול של תאי T והפרעות תימיות הנראות למשל בתינוקות אתימיים חסרי תאי T תפקודיים ובחולים עם תסמונת דיג'ורג', המאופיינים בהיפופלזיה תימית או אפלזיה תימית9-10. השתלת בלוטת התימוס, כמו רוב השתלות האיברים, אינה חפה מסיבוכים, הנובעים בעיקר מ...

התימוס הוא איבר שבו אירועים קריטיים בהתפתחות תאי T להתרחש 1. thymocytes התושב, עם סידורו מחדש של הקולטן תא T α (TCR) וגני β, לעבור סדרה של אינטראקציות עם תאי lymphostromal והצגת אנטיגן (APC) באזורים בקליפת המוח והלשדיים של בלוטת התימוס 2. בחירה חיובית הרתי מתווכת על ידי תאי אפיתל הרתי קליפת המוח (TEC) לייצר thymocytes שמכיר פפטידים אנטיגני בהקשר של מעמד מארח גדול המורכב histocompatibility (MHC) I ו- II מולקולות 2-3. סלקציה שלילית הרתי לאחר כרוכה טיהור של thymocytes אוטוריאקטיבים, מונעת על ידי אינטראקציה עם TEC הלשדי או תאים דנדריטים (DC) שפפטידים ההווה נגזרים מחלבונים עצמיים מחויבים אני כיתת MHC והשני מולקולות 3. התוצאה הסופית של תהליכים אלה היא הקמת מאגר של תאים בוגרים מסוג CD4 + CD8 + T ומסוגל להגיב לקשת רחבהשל אנטיגנים זרים ואילו בתערוכת תגובתיות מינימאלית לחלבונים עצמיים 4. היעילות של אירועי בחירת הרתי מושפעת על ידי שורה של גורמים, כולל התבגרות הרתי, תדירות לשדית וTEC בקליפת המוח, הרכב משנה של DC הרתי, והמקור של מבשרי הרתי 3. יש לציין, בחירת הרתי חריגה יכולה לגרום לפתולוגיות אוטואימוניות 5 או immunodeficient, שנובעות מסלקציה שלילית או חיובית פגומה, בהתאמה. האירועים המולקולריים המסדירים בחירת הרתי, לעומת זאת, הם הבינו היטב. במבחנה גישות כגון תרבויות איבר הרתי reaggregate (RTOC) 6, הוכיח להיות שימושי לניתוח אירועים בסיסיים הקשורים לבחירת הרתי, אבל לא מצליחים לשחזר באופן מלא את הדינמיקה של שוטף באירועי vivo. כתוצאה מכך, גישה המבוססת על השתלת הרתי זה הוקמה לאירועי מבחר thymocyte מחקר טובים יותר in vivo 7 </sעד&gt;. פרוטוקול זה מתאר השתלת thymi מעכברי תורם יילוד והמבוגר לעכברים נמען SCID immunodeficient. טכניקה זו מאפשרת לחקר מנגנונים המווסתים את הבחירה חיובית ושלילית הרתי, כמו גם תפוקת הרתי של תת תא T השונים במהלך ontogeny. לאחרונה, גישה זו הייתה בשימוש על מנת להוכיח כי היעילות של בחירת הרתי מוגבלת המוקדמת לאחר הלידה בעכברים המובילה לפיתוח מוגבר של תאי T אוטוריאקטיבים, ורפרטואר של תאי T ספציפי למופחת אנטיגנים זרים 7.

<table><tbody><tr><td>אתנול&nbsp;</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>תמיסת בטדין</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td></td></tr><tr><td>מחט 18 מד</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>תפרים (1.0 מטרי)</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>18 אינץ' (45 ס"מ)</td></tr><tr><td>קליפס פצע AUTOCLIP (9 מ"מ)</td><td>קליי אדמס&reg; מותג</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-20</td><td>סטרילי, חד פעמי</td></tr><tr><td>עכבר anti-CD3 Ab</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-85</td><td>שיבוט: 1452C11</td></tr><tr><td>עכבר anti-CD4 Ab</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td>שיבוט: RM4-5</td></tr><tr><td>עכבר anti-CD8 Ab</td><td>eBioscience</td><td>25-0081-82</td><td>שיבוט: 53-6.7</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Medipoint</td><td>Goldenrod 4 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>פסיפיק תפוז Succinimidyl Ester, מלח טריאתילאמוניום</td><td>Invitrogen</td><td>P30253</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחות פוליפרופילן בוטון עגולות</td><td>קורנינג</td><td>3365</td><td></td></tr><tr><td>1.2 מ"ל צינורות אשכול פוליפרופילן</td><td>קורנינג</td><td>4401</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים</td><td>BD</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>40uM תא ניילון מסננת</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 16%,</td><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> בדרגה EM <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>משחה אופטית מסוכנת Puralube</td><td>פישר NC0138063</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי לימפוליט</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 60 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430196</td><td>60 מ"מ x 15 מ"מ, סטרילי</td></tr></tbody></table>

בידוד והשתלה של שתלי הרתי murine בני שונים.

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

המנגנונים המסדירים את היעילות של בחירת הרתי יישארו לא מוגדר. השיטה שהוצגה כאן מאפשרת in vivo ניתוחים של הפיתוח והבחירה של תאי T ספציפיים לעצמית ואנטיגנים זרים. הגישה כרוכה השתלה של שתלי הרתי נגזרים מעכברים בגילים שונים למקבלי SCID immunodeficient. על פני תקופה קצרה יחסית של זמן הנמענים מחדש באופן מלא עם תאי T הנגזרים משתל התימוס המושתל. רק thymocytes זריעת התימוס בעת הבידוד לעבור בחירה ולהתפתח לתאי T בשלים. ככזה, שינויים באופי והספציפיות של תאי T engrafted כפונקציה של אירועי הרתי תלוי גיל ניתן להעריך. למרות שנדרשה מומחיות טכנית להשתלה הרתי מוצלחת, שיטה זו מספקת אסטרטגיה ייחודית ללמוד in vivo מגוון רחב של פתולוגיות המגיעות לי או תוצאה של פונקצית הרתי חריגה ו / או homeostasהוא.

ההצלחה של הליך זה תלויה בטראומה כירורגית מינימאלית, כמו גם את המיקום מדויק של השתל מתחת לכמוסה בכליות. שתל הרתי יש לחתוך כדי להבטיח כראוי בגודל חלקי הרתי להשתלה הבאה, כפי שמוצג באיור 1. בעקבות סכמטי באיור 1, thymi מעכברים שזה עתה נולדו או מבוגר יכול לשמש להשתלת subcapsular מוצלחת עם תוצאות engraftment תא T עקביות ושחזור. כאמור, מיקום המתאים של השתל תחת הקפסולה הכליות הוא חשוב בשמירה על הישרדות לטווח ארוך, פונקציה, וכלי דם של השתל. כפי שניתן לראות ...

דוח זה מספק תיאור מפורט של השתלת תימי עכברים מעכברים בגילאים שונים מתחת לקפסולת הכליה של מושתלי עכברים חסרי חיסון. מטרת גישה זו היא למדל התפתחות תאי T ואירועי ברירה תימית in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפשר ניתוח in vivo של סלקציה שלילית של תאי T בנקודת זמן ספציפית במהלך ההתפתחות (ontogeny) של תאי T. הדבר מושג תחילה על ידי קצירת הטימוס מעכבר תורם בגיל הספציפי הרלוונטי. בשלב השני, חושפת הכליה של עכבר skid מקבל, והטימוס התורם מושתל באופן כירורגי תחת הקפסולה של הכליה.בשלב האחרון, סוגרים את מקבל השתלה. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השחזור המוצלח של מדור תאי ה-T הפריפריים באמצעות ציטומטריה זרימה. שיטה זו מאפשרת מחקר זמני של ברירה תימית וייצור תאי T, ובכך מספקת למעשה תמו snapshot של ייצור תאי T בנקודת זמן מסוימת שמעניינת במהלך הצגת האנטיגן לתאי ה-T. כדי להוציא את התימוס מעכבר בוגר או מרכיב, התחילו בהנחת החיה במצב שכיבה על הגב (dorsal recumbent) על נייר סופג סטרילי והתיזו על הפרווה 70% ethanol.לאחר מכן, בצעו חתך בקו האמצע דרך העור כדי לחשוף את חללי הבטן והבית, וקפלו את העור מעל החזה והגפיים הקדמיות כדי לחשוף באופן מלא את חלל הבית. לאחר מכן, בצעו שני חתכים צדיים דרך הסרעפת וכלוב הצלעות. כדי לחשוף את המדיאסטינום העליון ואת חלל הבית הקדמי, יש לוודא שהטימוס נראה כשתי אוניות לבנות מעל הלב ובסמיכות אליו.השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את רקמת החיבור המקיפה את התימוס, תוך הקפדה שלא לפגוע בקפסולה. לאחר מכן, בעודכם מחזיקים את כלוב הצלעות בעזרת פינצטה, מקמו זוג פינ

isolation-and-transplantation-of-different-aged-murine-thymic-grafts

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

סרטון זה מדגים את השראת מחלת השתל נגד המאכסן של המעי, GvHD, בעכבר מושתל המוקרן באופן קטלני באמצעות תאי גזע המטופויטיים אלוגניים ולימפוציטים מסוג T אלוריאקטיביים מעוררי GvHD. פרוטוקול זה מסייע לבסס מודל GvHD חמור במעי כדי להבין את מנגנון המחלה ולפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות.

השראת מחלת השתל לעומת המאכסן במודלים של עכברים באמצעות השתלת מח עצם אלוגנית והשתלת תאים טחול

השתלת עור זנב היא מודל רב עוצמה לחקר דחייה תלויה בתאי T והשראת סבילות במהלך תגובות חיסוניות אלוגניות בעכברים. היתרונות של פרוטוקול זה הם ניתוח פולשני קל, וקלות ניטור ללא צורך להקריב את העכבר המקבל.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

כדי לחקור השתלה משולבת של איברים מוצקים וכלי דם, אנו מתארים מודל חדש של השתלת דופן חזה הטרוטופית, בלוטת התימוס ולב בעכברים באמצעות טכניקת שרוול צוואר הרחם ללא תפרים.

Microsurgical דגם חדשני לHeterotopic, כמקשה אחת בחזה קיר, קורנית, ולב השתלה בעכברים

השתלת עור בעובי מלאת Murine היא מודל ומבוסס ללמוד דחייה בסביבת alloimmune. כאן, אנו מספקים הדרכה של כל שלב המעורב בביצוע BALB / ג - השתלת עור&gt; C57BL / 6 בעובי מלא.

השתלת עור בעובי מלא Murine

המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה להשתלה 2 '-deoxyguanosine שטופלו E 29.7 בלוטת התימוס לתוך כמוסת הכליה של עכבר ערום. שיטה זו צריכה להיות מחקר של תפקוד שני תאים אפיתל הרתי והתבגרות תאים T.

הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

פרוטוקול זה מציג טכניקת אנסטומוזה פשוטה מקצה לצד להשתלת לב צוואר הרחם בעכברים, ומספק מודל חזק וניתן לשחזור ללימוד אימונולוגיה של השתלות.

השתלת לב עכבר הטרוטופית צווארית באמצעות טכניקת אנסטומוזה מקצה לצד לחקר אימונולוגיה של השתלות

למדו שיטה לבידוד והשתלת שתלי הרתי מעכברים תורמים בני שונים לנמקטים חסרי חיסון. שיטה זו מאפשרת ניתוח מעבדה של התפתחות תאי T ובחירת תימית בתנאי גוף חי.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

גלה סרטונים נוספים