Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההשלכות הראשונות של מוטציות בגורמי התחלת התרגום ללא הפרעה של mRNA חדש או של בעיות יעילות טרנספקציה המתרחשות לעתים קרובות במחקרי תאים אוקריוטיים. זה מושג על ידי סינתזה ראשונה של סוג בר מוטנטי ובקרה או GFP mRNA מפלסמידים מתאימים. ה-RNA המסונתז הבא מוזרק מיקרו לציטים של XUS Lavis בשלב השישי, וההתבגרות שלהם מגורה עם פרוגסטרון.

לאחר מכן מעריכים את הבשלת הציטים על ידי הדמיה של פירוק שלפוחית הנבט וחלק מהמרכיבים של מפל MA קינאז שהפעלתו תלויה בביטוי חלבון טחב מנותחים על ידי כתם מערבי. לבסוף, נחקרים mRNA Polyadenylation של טחב ו-mRNA אחרים הנחוצים להתאוששות מיוזה של ציטי XPO. בסופו של דבר התבגרות ציטים קינטיים.

ניתוחי כתמים מערביים ופוליאדנילציה משמשים כדי להראות השפעה פוטנציאלית של ביטוי חלבון כאשר גורם התחלת תרגום עובר מוטציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות שלנו או מערכת תאית משוחזרת המופקת באופן שווה עם חיידק או רטיקולוציט ארנב, הוא שההשפעות של מוטציה שהוחדרה ב-MR. NA יהיה ניתן לצפייה במהירות ויילמד בקלות במספר היטלי XOP. ציטים באופן כללי יותר.

למודל זה יתרונות הפשטות עם תאי הענק הבודדים שלו, והשימוש בו מוביל לכמות ניכרת של חומר לניסויים ביוכימיים. תהליך זה גם חסכוני בזמן בהשוואה ליצירת קו תאים יציב. מיסו זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח במחקרי תרגום כגון להבין טוב יותר את תפקידם של תחומים ספציפיים של גורמי תרגום או לחקור שחבור של גורמים אלה.

הוספנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר רצינו לחקור את ההשפעה של גורם התחלת תרגום מוטנטי על סינתזת חלבון ללא הפרעה של שעתוק. בדרך זו, אנו נמנעים מלולאות משוב פוטנציאליות בין שני מנגנוני ה-ome הללו. אכן, תמלול החומר מאוחסן ומונח.

ניתן להפעיל תרגום עם פרוגסטרון לאחר עשיית צרכים, xus lavos cytes והכנת CRN על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-10 x מגבים ו-6.6% פורמלדהיד כדי להטיל ג'ל 1.5% AROS. הכינו דגימות בשפופרת של 0.2 מיליליטר עם 8.8% פורמלדהיד, 60 אחוז עבור AMIDE 0.1 נפחים של 10 x מגבים ומיקרוליטר אחד של CRNA דגרו בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות והניחו את הצינורות על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב-5,000 פעמים G למשך מספר שניות לפני הוספת שני מיקרוליטרים של מאגר טעינת ג'ל.

הפעל את הדגימות ב 90 וולט למשך 20 דקות כדי לזלזל בג'ל. השרו אותו במים נטולי נוקלאז למשך הלילה. לאחר מכן נתח אותו כדי לבדוק את איכות ה-CNA.

השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז ה-CNA ולאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לבצע הזרקת מיקרו של RNA. השתמש במדיום ND 96 למילוי צלחת פטרי מגורדת שעה עד שעתיים לאחר הסרת העלים. מסדרים את הצייטים לאורך נתיב מגורד בצלחת.

לאחר מכן, באמצעות מיקרו פיפטה נימית עם קצה שבור המונח בזווית של 45 מעלות. הכנס את קצה הנימים כ-150 עד 200 מיקרון עמוק לאזור קו המשווה מתחת לאזור החיה הפיגמנטית. יש להזריק 30 ננוגרם של CRNA ב-60 ננוליטר לתוך הביצית הראשונה.

לאחר מכן המתן חמש עד 10 שניות לפני הסרת קצה הנימים כדי למנוע מהדגימה לדלוף החוצה. כדי להזריק את הצייט הבא הזז את המנה ידנית. העבירו את הציטים המוזרקים ל-24 לוחות תרבית בארות מלאים בשלושה מיליליטר של מדיום ND 96 והובילו אותם ב-19 מעלות צלזיוס כדי לעורר התבגרות מיטוטית.

דגרו את הביציות ב-ND 96 עם שני מיקרוגרם למיליליטר של פרוגסטרון או PG ב-19 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות. בדוק את השפעת התרגום של CRNAs מסוג EIF 4G אחד על הפנוטיפ המוטנטי בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כדי לקבוע את היקף התמוטטות שלפוחית הנבט תחת מיקרוסקופ סטריאו.

ספרו את מספר הציטים הבוגרים לאחר גירוי PG על ידי נוכחות של נקודה לבנה בקוטב החיה השחורה. חזור על הספירה כל שעה עד השעה ה-24 כדי לבצע בדיקת דם מערבית. השתמש בתנועות קדימה ואחורה של קצה מיקרו פיפטה בארבע מעלות צלזיוס כדי להומוגניזציה של 10 ציטים ב-200 מיקרוליטר של המאגר המוצג כאן.

צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 פעמים G למשך 15 דקות כדי לחלץ את השבר הציטופלזמי באמצע. שלב את השבר העליון השומנים המתאימים ואת התחתון לפסולת תאית. אסוף את השבר הציטופלזמי ואחסן אליקוט כדי לקבוע את ריכוז החלבון.

שלב את הנותרים ביחס של אחד לאחד עם מאגר דגימה צולע או Biss לפני הפעלת דף SDS וכתמים מערביים. על פי פרוטוקול הטקסט. כדי לבצע בדיקת אוורור פולי, הנח חמישה ציטים לכל מצב בצינורות מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של נוקלאז אחד ללא נוקלאז XPBS שוטף את הציטים.

לאחר מכן, מתחת למכסה האדים, השתמש בערכת מיצוי RNA בהתאם להוראות היצרן כדי לבודד את ה-RNA. לאחר בדיקת תקינות ה-RNA וקביעת הריכוז, הכינו שתי תערובות קשירה לכל מצב CRNA עם הריאגנטים הבאים לתערובת הראשונה. הוסף RNA מציטים שאינם מגורים עם pg ולתערובת השנייה.

הוסף RNA מביציות מגורות PG. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לנטרל את האנזים באמצעות ערכת שעתוק הפוך CD NA.

עבור כל דגימה, הכינו את תערובת ה-RT המפורטת כאן. הוסף 10 מיקרוליטר מתגובת הקשירה שהוכנה בעבר ובצע RT בהתאם להוראות היצרן לאחר ביצוע PCR, תוך שימוש בתערובת התגובה והתנאים הבאים לכל תגובה בארבעה מיקרוליטר של מאגר טעינה והפעל 10 מיקרוליטר מכל דגימה על ג'ל אגרוס 3% ב-110 ברגים. לבסוף נתח את הג'ל לאחר 10 ו-20 דקות כדי לראות שינוי בגודל המשקף את אורך זנב ה-polyA ובכך את הבשלת ה-RNA, שהיא תנאי מוקדם לתרגומם.

כפי שמוצג כאן, ההתבגרות הקינטית של ביציות מיקרו המוזרקות בתנאי ביקורת דומה לסוג הבר עם מספרים דומים שעוברים GVBD ב-12 ו-24 שעות לאחר גירוי PG, 24 שעות לאחר גירוי PG. אחוז הביציות המגיעות להבשלה דומה לסוג הבר כמו גם לבקרות שהוזרקו במים ו-GFP מה שמצביע על כך שהזרקת מיקרו עם מים או בקרות או EIF 4G 1 CRNAs הייתה השפעה מועטה על מיקרו-הזרקת מיוזה ביצית עם ה-EIF 4G השלילי הדומיננטי, עם זאת, הביא לירידה דרמטית ב-GVBD גם לאחר גירוי PG. איור זה מראה כי ניתן לשחזר את פגם ההתבגרות CRNA מסוג הבר ככל שהיחס בין סוג הבר ל-EIF 4G השלילי הדומיננטי עולה CRNA.

כך גם אחוז הציטים שעוברים הבשלה כצפוי. לא מתגלה ביטוי טחב אנדוגני בהיעדר גירוי PG וביטוי יתר של EIF 4G שלילי דומיננטי אחד יש השפעה מועטה על טחב אנדוגני בהסכמה עם תוצאות קודמות. בנוסף, Aurora AEEG two, הפועל במעלה הזרם של השראת טחב, אינו מראה עדות לדה-ויסות של חלבון או לצורתו הזרחנית המושרה לאחר גירוי PG.

לעומת זאת, זרחון שני irk, המושרה על ידי טחב, מעוכב בנוכחות ה-EIF 4G השלילי הדומיננטי. לאחר המאסטר, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לחרוג מ-120 ננוליטר של CNA בריכוז מתחת לננוגרמים מסוימים בעקבות הליך זה.

למרות שניתן לבצע שיטה כמו ניתוח פרופיל פוליזום על מנת לענות על שאלה נוספת כמו הגדרת איזה RNA עשוי להיות מתורגם בצורה גרועה או גבוהה.