ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע כמותית את השפעת הטיפול על יכולתם של תאים להתרבות במטריצות מוצקות למחצה, שכן יכולת משופרת היא סימן היכר של גניטיות גידול התא באמצעות מבחן אגר רך גניות הגידול נמדדת באמצעות יכולתו של התא ליצור מושבות בתוך ג'ל AROS מוצק למחצה. מכיוון שתאים שאינם מותמרים אינם מסוגלים להתפשט במהירות בסביבה זו, ג'ל ה-AROS המוצק למחצה נבנה על ידי יצירת שכבה תחתונה של 0.6% AROS. לאחר מכן, תא המכיל 0.3% שכבת ג'ל AROS מתווסף מעל השכבה התחתונה.

בבדיקה זו, תאי הניסוי מטופלים במעכב של פפטידיל, ארגינין, דאז או אנזים פד שפותח על ידי ד"ר סוברמניאן. בכל שבוע מתווספת שכבת הזנה נוספת, שהיא ג'ל 0.3% עם או בלי טיפול. השלב האחרון הוא לספור את מספר המושבות הגדולות מ-70 מיקרומטר לניתוח.

בסופו של דבר, מיקרוסקופיה הפוכה משמשת כדי להראות את ההבדל במספר המושבה בין קבוצת הביקורת לקבוצת הטיפול. היי, שמי אצ'י הוטה. אני סטודנטית לתואר שני במעבדה של ד"ר סקוט קרוס במכון בייקר לבריאות בעלי חיים.

באוניברסיטת קורנל, בדיקת היווצרות מושבת טיגריסים רכה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון הערכת גניבות הגידול של מגוון רחב של תאים סרטניים ביחס לרגישותם לתרופות, הורמונים ושלל מצבי טיפול אחרים. התחל הליך זה על ידי הכנת 3%שני הידרוקסיאתיל ארוס לבקבוק זכוכית נקי ויבש של 100 מיליליטר. הוסף 0.9 גרם של שני הידרוקסיאתיל ארוס, ואחריו 30 מיליליטר מים מזוקקים.

מיקרוגל את התערובת למשך 15 שניות ומערבב בעדינות. חזור על שלב זה עד שאבקת AROS תתמוסס לחלוטין. לאחר מכן, חיטוי התמיסה המכילה בקבוק למשך 15 דקות.

הניחו לתמיסת האגרוס להתקרר לטמפרטורת החדר. לפני כן, השתמש בחימום מראש של כמה פיפטות של חמישה מיליליטר ו-10 מיליליטר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהארוס להתמצק בפיפטה. בעת טיפול חלקי, שחרר את מכסה הבקבוק וחמם במיקרוגל את תמיסת ה-3%two HYDROXYETHYL aro המוכנה מראש למשך 15 שניות.

לאחר מכן סובבו בעדינות את התמיסה והכניסו למיקרוגל למשך 15 שניות נוספות. היזהר בעת סיבוב תמיסת ה-ARO מכיוון שהתמיסה עולה למעלה כאשר היא נחשפת לאוויר ועלולה להישפך אם יש שאריות ג'ל מוצק במיקרוגל הבקבוק. למשך מספר שניות נוספות, שמור את הבקבוק המכיל את תמיסת ה-ARO באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס במהלך השלבים הבאים כדי למנוע מתמיסת האגרו להתמצק בטרם עת.

לאחר מכן, העבירו 12 מיליליטר של מדיה מחוממת באמצעות פיפטות Prewarm לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. הוסף מיד שלושה מיליליטר מתמיסת 3% aros והפוך בעדינות את הצינור החרוטי כדי לערבב את הארוס עם המדיה. לאחר מכן הוסיפו בעדינות שני מיליליטר מתערובת זו לכל באר של צלחת תרבית של שש בארות מבלי ליצור בועות אוויר.

דגרו את צלחת שש הבארות אופקית על משטח ישר בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאפשר לתערובת להתמצק. לאחר שהתערובת מתמצקת, הכניסו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השכבה התחתונה מוכנה כעת לשימוש.

היבט קשה בהליך זה הוא לוודא שכל התאים מפוזרים באופן שווה וכי קליפת האגרה המומסת לא תתמצק לפני הוספה לכל באר כדי להבטיח שהסלץ יתערבב במדיה לפני הוספת הג'ל החקלאי הנוזלי. בנוסף, הצינורות מחוממים מראש כדי למנוע מהתמיסות להתמצק בזמן הטיפול. כדי להכין את התא המכיל שכבת טריפסין תחילה עיני MCF 10 תאי DCIS ולדלל אותם לריכוז תאים של 40,000 תאים למיליליטר, לאחר מכן לקחת שמונה מיליליטר מדיה באמצעות פיפטות חמות מראש ולהעביר לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.

הוסף מיד שני מיליליטר של 3% ארוס לצינור החרוטי והפוך בעדינות כדי לערבב את הארוס עם המדיה. הימנע מהיווצרות בועות כלשהן. לאחר מכן, קח שני מיליליטר מהתאים וטפל בהם עם שני כלורמין BB מיקרומולרי ב-DMSO או DMSO בלבד כביקורת לאחר הטיפול, ערבב את התאים עם 0.6% AROS בדילול אחד לאחד כדי ליצור ריכוז סופי של כלורמין BB מיקרומולרי אחד.

לאחר מכן קח מיליליטר אחד מתערובת ארוס התאים והוסף בעדינות על השכבה התחתונה של צלחת התרבות של שש הבארות. הניחו את צלחת שש הבארות אופקית על משטח ישר בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות כדי לאפשר לשכבה העליונה להתמצק. לאחר שהתערובת מתמצקת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה.

התחל בהכנת שכבת ההזנה על ידי חימום במיקרוגל של תמיסת 3%2 הידרוקסיאתיל ארו שהוכנה מראש כמו קודם, ואיזון בקבוק התמיסה החקלאית באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס, ערבב מיליליטר אחד של תמיסת אגרו 3% עם תשעה מיליליטר של מדיה חמה לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר והפוך בעדינות כדי לערבב את הארוס עם המדיה. הימנע מהיווצרות בועות אוויר. לאחר הטיפול בתערובת בכלורמין BB מוסיפים בעדינות מיליליטר אחד מהתערובת לכל באר של שש צלחת תרבית הבאר המכילה את השכבות התחתונות והרכות.

לאחר מכן הניחו את צלחת התרבות של שש הבארות בצורה אופקית על משטח ישר בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות כדי לאפשר לתערובת להתמצק. לאחר ששכבת המזין מתמצקת, הנח את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס. באדר, חזור על הליך האכלה זה מדי שבוע על ידי כיסוי מיליליטר אחד של תמיסת טיפול בינונית של 0.3% אגרוס על שכבת ההזנה הקיימת כדי לחדש את התאים במדיה חדשה עד לצפייה בהיווצרות מושבה.

לאחר שבועיים וחצי של צמיחת תאים באגר הרך, מספר המושבה בכל באר נספר. בעזרת מיקרוסקופ אור כדי להקל על הכמות, הדפיסו רשת על שקף והצמידו את הרשת ללוח שש הבארות כדי לסייע באיתור היכן נמצאים התאים במהלך הספירה. גודל המושבה מכומת על ידי הקוטר של כל מושבה וישתנה מראש להגדיר מראש את גודל מושבת הייחוס כדי לקבוע אילו מושבות יקבלו ניקוד.

לדוגמה, כאן, גדלי מושבה של 70 מיקרומטר ומעלה כלולים בניתוח הנתונים. לאחר הספירה אטמו את צלחת התרבות של שש הבארות עם פרפורם כדי למנוע את התייבשות הג'לים. אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע היווצרות מושבה נוספת ולספירה עתידית.

התוצאות מדגימות כי כלורמין BB מעכב באופן משמעותי את היווצרותן של מושבות שמקורן בתאי MC 10 DCIS בנוכחות מעכב פד. הייתה ירידה הן בהיווצרות המושבה והן בגודל המושבה בהשוואה לבקרת DMSO. גודל המושבות לתאי MCF 10 DCIS שטופלו בכלורמין BB היה בעיקר בטווח של 20 עד 100 מיקרומטר.

בעוד שגודל המושבות לבקרת DMSO הראה טווח גדול יותר של 70 עד 150 מיקרומטר לאחר שבועיים וחצי של גדילה, מושבות גדולות מ-70 מיקרומטר נספרו ונותחו. היו בממוצע כ-3,500 מושבות בביקורת DMSO, בעוד שרק כ-2000 מושבות נצפו בקבוצה שטופלה בכלורמין BB. לאחר שבועיים וחצי של חקלאות רכה, זה מייצג ירידה של 44% בהיווצרות המושבה הממוצעת בנוכחות כלורמין BB מיקרומולרי אחד, מה שמעיד על עיכוב גידולי משמעותי של תאי סרטן השד על ידי מעכב הפד.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחמם מראש את כל הריאגנטים והציוד כדי למנוע מהתמיסות להתמצק בעת הטיפול, ותודה על הצפייה.