Name: ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: חקור את השימוש ב-assay כינונה רך באגר לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד באמצעות BB-Cl-amidine. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של יכולת התאים להתרבות במטריצות חצי-מוצקות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לד"ר ריצ'רד סריון, ד"ר מארק אנטוניאק וקלי סאליבן מאוניברסיטת קורנל, על מתן ייעוץ טכני, ולד"ר ג'רלינד ואן דה וול, אוניברסיטת קורנל, על שיתוף המיקרוסקופ ההפוך Olympus CKX41 שלהם.

1. הכנה של 3% 2-Hydroxyethyl Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתוך בקבוק נקי, יבש 100 מיליליטר זכוכית, להוסיף 0.9 גרם של agarose 2-hydroxyethyl (Agarose VII) ואחריו 30 מיליליטר של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל את התערובת במשך 15 שניות ועדינות מערבולת. חזור על שלב זה לפחות עוד שלוש פעמים עד שאבקת agarose מתמוססת באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי הבקבוק המכיל פתרון במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון agarose להתקרר לRT לפני שימוש נוסף. אחסן את הפתרון בRT. </li></ol> 2. הכנת השכבה התחתונה: 0.6% Agarose ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם 5 מיליליטר ו -10 מיליליטר בטפטפות 37 ° C חממה כמה למנוע agarose לחיזוק בפיפטה בעת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקית לשחרר את מכסה הבקבוק ומיקרוגל 3% פתרון agarose 2-hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. ואז, בעדינות מערבולת הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות. זהירות: היזהרי בעת מתערבלת agaroפתרון se כי הפתרון עולה כאשר נחשף לאוויר ויכול לגלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש ג&#39;ל השייר המוצק בבקבוק, מיקרוגל לעוד כמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הבקבוק המכיל את פתרון agarose באמבט מים C ° 45 במהלך השלבים הבאים כדי למנוע את פתרון agarose מהגיבוש בטרם עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת MCF10DCIS חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: תקשורת MCF10DCIS מורכבת DMEM / F12, 5% בסרום סוס, 5% סטרפטומיצין פניצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 3 מיליליטר של פתרון agarose 3% באמצעות טפטפות המחוממות מראש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף 12 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה ועדינות להפוך את צינור חרוטי לערבב agarose עם התקשורת. נסה לא ליצור בועות כפי שיפריע למושבה ספירה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תערובת זו לכל גם צלחת תרבות 6 היטב בלי להרכיב את כל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה horizonta צלחת תרבות 6 היטבlly על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר את התערובת לביסוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה למשך 30 דקות. השכבה התחתונה היא מוכנה לשימוש. </li></ol> 3. הכנת השכבה המכיל הנייד: 0.3% Agarose ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Trypsinize MCF10DCIS ולדלל אותם לריכוז תא של 4 x 10 4 מיליליטר /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 מיליליטר של agarose 3% באמצעות טפטפות מחוממות מראש ולהעביר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף 8 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS לצינור חרוטי ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יצירת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 מיליליטר של תאי MCF10DCIS (4 x 10 4 / מיליליטר) ולטפל עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדילול 1: 1, לערבב את התאים עם agarose 0.6%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מיליליטר של תערובת התא-agarose ועדינות להוסיף על השכבה התחתונה של עמ &#39;תרבות 6 היטב(2 x 10 4 תאים / מיליליטר) מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את השכבה העליונה כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתמצק התערובת, מניח את הצלחת לתוך 37 ° C חממה במשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה. </li></ol> 4. הכנת שכבת המזין: 0.3% Agarose ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל 3% פתרון agarose 2-Hydroxyethyl שהוכן מראש, במשך 15 שניות. מערבולת בעדינות את הפתרון ומיקרוגל לעוד 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את בקבוק פתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את תקשורת MCF10DCIS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 מיליליטר של 3% פתרון agarose עם 9 מיליליטר של תקשורת MCF10DCIS החמה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ועדינות להפוך לערבב agarose עם התקשורת. הימנע יוצר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את התערובת עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 1 מיליליטר של תערובת זו (בלי למינג בועות) לבאר כל צלחת תרבות 6 היטב המכילה את החלק התחתון ושכבות רכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת תרבות 6 היטב אופקי על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את התערובת לביסוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכבת המזין מתמצקת, למקם את הצלחת לתוך 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור שבועי הליך זה על ידי האכלה כיסה 1 מיליליטר של 0.3% פתרון agarose / בינוניים / טיפול על שכבת המזין הקיימת כדי לחדש את התאים עם תקשורת חדשה עד הקמת מושבה הוא ציין. הערה: אגר בשכבות הרכות ומזין היא רכה מאוד, ולכן, חומרים מזינים הגיעו משכבת ​​המזין יהיו מוכנים לפזר את השכבה המכיל תא כדי להגיע לתאים. </li></ol> 5. איסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2.5 שבועות של צמיחת תאים באגרו הרך, לספור את מספר המושבות בכל טוב באמצעות מיקרוסקופ אור. כדי להקל על כימות, להדפיס רשת על שקיפות ולצרף את הרשת ל6-גם צלחת לסיוע באיתור שבו התאים נמצאים בספירה. מאז גודל מושבה (כלכמת ידי הקוטר של כל מושבה) ישתנה, להגדיר מראש גודל מושבה התייחסות כדי לקבוע אילו מושבות יהיה כבש. לדוגמא, כוללים גדלי מושבה של 70 מיקרומטר או גדולים יותר בניתוח הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות ב 4 ° C כדי למנוע היווצרות מושבה נוספת ולספירת עתיד. חותם את צלחת תרבות 6 היטב עם Parafilm כדי למנוע את ג&#39;לי מהתייבשות. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קצב היווצרות מושבה באגרה רך משתנה בהתאם לסוג התא 9. לכן, מספר התאים להתחיל עם צריך להיות מותאם ובהתאם. מגוון התחלה הציע הוא בין 5 x 02-01 אוקטובר x 10 4 תאים לכל גם באמצעות צלחת 6 היטב. בנוסף, גודל מושבה משתנה בהתאם לקצב הצמיחה של כל תא. לכן, יש צורך בחתך מוגדר מראש לגודל מושבה כדי להוסיף הערות מושבות בודדות עבור ניתוחים כמותיים במורד הזרם. כאן, מושבות גדולות יותר מ -70 מיקרומטר היו לכמת כדי למנוע הכללה של תאים מתרבים שאינם נגזרים מהציפוי הראשוני. ...

גם תאים לא מותמרים (נורמליים) וגם תאים שעברו טרנספורמציה יכולים להתרבות בקלות בתרבית חד-שכבתית דו-ממדית. צורה זו של גידול תאים דבקים שונה למדי מזו המתרחשת in vivo שבה, בהיעדר גירוי מיטוגני, תאים אינם מתחלקים לעתים קרובות במהירות בתוך סביבת המיקרו שלהם. מבחן האגר הרך לעומת זאת שונה ממערכות תרבית דו-ממדיות מכיוון שהוא מכמת את הגידול על ידי מדידת יכולתו של התא להתרבות וליצור מושבות בתרחיף בתוך ג'ל אגרוז מוצקלמחצה 1. בסביבה זו, תאים שלא עברו טרנספורמציה אינם מסוגלים להתפשט במהירות בהיעדר עיגון למטריצה החוץ-תאית (ECM) ועוברים אפופטוזיס, תהליך המכונה אנויקיס. לעומת זאת, תאים שעברו טרנספורמציה ממאירה מאבדים את התלות שלהם בעיגון עקב הפעלת מסלולי איתות כגון פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)/Akt ו-Rac/Cdc42/PAK. לכן, תאים אלה מסוגלים לגדול וליצור מושבות בתוך מטריצת אגר רכה חצי מוצקה2.
שימוש נפוץ בבדיקת אגר רך הוא לבדוק אם תרכובות ספציפיות, כגון מעכבי PADI, מסוגלות לדכא את צמיחת הגידול במבחנה. באופן כללי, ספירת מושבות או גדלי מושבות הם קריאות כמותיות מהבדיקה שניתן להשוות בין קבוצות ביקורת וטיפול כדי להעריך את ההבדלים בגידול תאי. לכן, אם מוצאים כי היווצרות מושבה נמצאת בקורלציה הפוכה עם עלייה בריכוז התרופה, ניתן להסיק כי התרופה היא מעכב יעיל של גידול במבחנה. מצד שני, אם התרופה אינה משפיעה על היווצרות המושבה, התרופה אינה במינון המתאים או שהיא אינה מעכבת גידול יעילה. מלבד שימוש בבדיקת אגר רכה לבדיקת ההשפעה האנטי-גידולית של תרופה, ניתן להשתמש בבדיקה זו גם כדי לחקור את הקשר בין גן ספציפי לגידול. לדוגמה, ניתן לטפל בהשפעה של דיכוי ביטוי PADI2 על גידול על ידי טיפול siRNA ספציפי ל-PADI2.
PADIs הם אנזימים תלויי סידן המשנים חלבונים לאחר תרגום על ידי המרת שאריות ארגינין טעונות חיובית לציטרולין טעון ניטרלי בתהליך המכונה ציטרולינציה או דה-דימינציה3-5. לאחרונה מצאנו כי פפטידילרגינין דימינאז 2 (PADI2) עשוי לתפקד כסמן ביולוגי חדש לסרטן השד וכי מעכבי PADI מייצגים טיפולים מועמדים לסרטן שד בשלב מוקדם6. לדוגמה, הראינו בעבר כי מעכב "פאן-PADI", Cl-אמידין, מדכא את התפשטות תאי סרטן השד באמצעות חד-שכבות דו-ממדיות וכי המעכב דיכא את הצמיחה של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול6. בדוח זה, אנו מרחיבים את המחקרים הללו, ומדגישים את התועלת של בדיקת האגר הרך, על ידי בדיקת היעילות של מעכב PADI חדש, BB-CLA, בדיכוי הצמיחה של מושבות סרטן השדMCF10DCIS. נציין שהשתמשנו בתאי MCF10DCIS לניסוי זה מכיוון שהם נגזרות אונקוגניות של תאי MCF10A אנושיים שלא עברו טרנספורמציה ומכיוון שהם מכילים רמות גבוהות של חלבון PADI2 במצב יציב8. אנו משערים כי פעילות אנזימטית של PADI2 ממלאת תפקיד מפתח בגידול של קו תאים זה וכי עיכוב פעילות PADI2 בתיווך BB-CLA ידכא את התקדמות הסרטן.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot</td><td>Carl Zeiss מיקרוסקופיה</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Donor Horsene Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-הידרוקסיאתילאגרוז: סוג VII, טמפרטורת ג'ל נמוכה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

בהתחשב בקשיים האינהרנטיים בחקירת המנגנונים של התקדמות הגידול in vivo, בדיקות מבוססות תאים כגון בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה (להלן בדיקת אגר רכה), המודדת את יכולתם של תאים להתרבות במטריצות מוצקות למחצה, נותרו סימן ההיכר של חקר הסרטן. יתרון מרכזי של טכניקה זו על פני מבחני תרבית תאים דו-שכבתיים או תלת-ממדיים קונבנציונליים הוא החיקוי הקרוב של הסביבה התאית התלת-ממדית לזו הנראית in vivo. חשוב לציין, בדיקת האגר הרך מספקת גם כלי אידיאלי לבדיקה קפדנית של ההשפעות של תרכובות חדשות או תנאי טיפול על התפשטות תאים ונדידתם. בנוסף, בדיקה זו מאפשרת הערכה כמותית של פוטנציאל הטרנספורמציה של התאים בהקשר של הפרעות גנטיות. לאחרונה זיהינו את פפטידילרגינין דימינאז 2 (PADI2) כסמן ביולוגי פוטנציאלי לסרטן השד ומטרה טיפולית. כאן אנו מדגישים את התועלת של בדיקת האגר הרך למחקרים אנטי-סרטניים פרה-קליניים על ידי בדיקת ההשפעות של מעכב PADI, BB-Cl-amidine (BB-CLA), על הגידול של תאים ממוקדים (MCF10DCIS).

Assay הקמת המושבה אגר הרך יכול לשמש למגוון רחב של יישומים המתעדים את tumorigenicity של תאים סרטניים. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שמטריצת חצי מוצקה סלקטיבי מעדיפה את הצמיחה של תאים שיכולים להתרבות באופן עצמאי מעגן-. תכונה זו היא בעיקר הפגינה תאים סרטניים אך לא בתאים נורמלים. אנחנו בעיקר להשתמש בטכניקה זו כדי לבדוק את היעילות של עיכוב צמיחת גידול על ידי תרופות ולבדוק את ההשפעה של ביטוי יתר או דלדול של הגנים שלנו של עניין, כוללים גני PADI, בtumorigenicity של תאי סרטן השד. כאן, אנו הער...

כאן, אנו מתעדים את השימוש בבדיקת היווצרות מושבת אגר רכה כדי לבדוק את ההשפעות של מעכב אנזים פפטידילרגינין דימינאז (PADI), BB-Cl-amidine, על גידול סרטן השד במבחנה.

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע באופן כמותי את השפעת הטיפול על יכולתם של תאים להתרבות במטריצות חצי-מוצקות, שכן יכולת מוגברת היא סימן היכר לגנוגניות תאים סרטניים. באמצעות מבחן הסופט-אגר (soft agar assay), נמדדת הגנוגניות הסרטנית דרך יכולתו של תא להקים מושבות בתוך ג'ל AROS חצי-מוצק. מכיוון שתאים שאינם טרנספורמיים אינם מסוגלים להתרבות במהירות בסביבה זו, ג'ל ה-AROS החצי-מוצק מובנה תחילה על ידי יצירת שכבת בסיס של 0.6% AROS. לאחר מכן, מתווספת מעל שכבת הבסיס שכבת ג'ל של 0.3% AROS המכילה תאים.בבדיקה זו, התאים הניסוייים מטופלים במעכב של אנזים peptidyl, arginine, dase, או pad שפותח על ידי ד"ר Subramanian. מדי שבוע מתווסף שכבת הזנה נוספת, המהווה ג'ל agar בריכוז 0.3% עם או ללא טיפול. השלב הסופי הוא ספירת מספר המושבות שגודלן עולה על 70 micrometers לצורך ניתוח.בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך כדי להראות את ההבדל במספר המושבות בין קבוצת הביקורת לקבוצת הטיפול. שלום, שמי אכי הוטה. אני סטודנט לתארים מתקדמים במעבדה של ד"ר סקוט קרוס במכון בייקר לבריאות בעלי חיים.באוניברסיטת קורנל, בדיקת הרכבת מושבות של "טיגר רך" (soft tiger colony formation assay) יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון הערכת הגנויות התסומורית (tumor genicity) של מגוון רחב של תאי סרטן ביחס לרגישותם לתרופות, הורמונים ושורה של תנאי טיפול אחרים. התחילו את ההליך על ידי הכנת 3% two hydroxyethyl aros בתוך בקבוק זכוכית נקי ויבש בנפח 100 milliliter. הוסיפו 0.9 grams של two hydroxyethyl aros, ולאחר מכן 30 milliliters של מים מזוקקים.חמם את התערובת במיקרוגל למשך 15 שניות וסובב אותה בעדינות. חזור על שלב זה עד להמסה מלאה של אבקת ה-AROS. לאחר מכן, בצע אוטוקלב לבקבוק המכיל את התמיסה למשך 15 דקות.המתינו עד שתמיס ה-agros תתקרר לטמפרטורת החדר. לפני כן, חממו מראש מספר פיפטים של 5 מיליליטר ו-10 מיליליטר באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי למנוע מה-aros להתמצק בתוך הפיפט. בעת טיפול חלקי, שחררו את מכסה הבקבוק וחממו במיקרוגל את תמיס ה-3%two HYDROXYETHYL aro המוכנה מראש למשך 15 שניות.לאחר מכן, סובבו בעדינות את התמיסה וחממו במיקרוגל למשך 15 שניות נוספות. יש להיזהר בעת סיבוב תמיסת ה-ARO, מכיוון שהתמיסה עולה כאשר היא נחשפת לאוויר ועלולה להישפך אם נותר ג'ל מוצק בבקבוק במיקרוגל. במהלך השלבים הבאים, השאירו את הבקבוק המכיל את תמיסת ה-ARO במקלחת מים בטמפרטורה של 45 °C למשך מספר שניות נוספות כדי למנוע מהתמיסה להתמצק בטרם עת.בשלב הבא, העבירו 12 milliliters של מצע מוחמם באמצעות פיפטות Prewarm לתוך מבחנה קונית סטרילית של 50 milliliter. הוסיפו מיד שלושה milliliters של תמיסת 3%aros והפכו בעדינות את המבחנה הקונית כדי לערבב את ה-aros עם המצע. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות שני milliliters של תערובת זו לכל באר בצלחת תרבית בעלת שש בארות, תוך הקפדה על אי-יצירת בועות אוויר.דגרו את פלטת השש בורות באופן אופקי על משטח שטוח בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת כדי לאפשר לתערובת להתמצק. לאחר שהתערובת התמצקה, העבירו את הפלטה לאנקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. השכבה התחתונה מוכנה כעת לשימוש.היבט מאתגר של פרוצדורה זו הוא להבטיח שכל התאים יפוזרו באופן שווה ושהמעטפת המומסת לא תקריש לפני ההוספה לכל באר, כדי להבטיח שהתאים יערבבו במצע לפני הוספת הג'ל הנוזלי. בנוסף, השואבים מחוממים מראש כדי למנוע התגבשות של התמיסות בזמן הטיפול. להכנת השכבה המכילה תאים, ראשית מבצעים trypsinization לתאי MCF 10 DCIS ומדללים אותם לריכוז של 40,000 תאים למיליליטר, ולאחר מכן לוקחים שמונה מיליליטרים של מצע באמצעות פיפטות שחוממו מראש ומעבירים לשפופרת קונית סטרילית של 50 מיליליטר.הוסיפו מיד שני מיליליטר של 3%aros למבחנה הקונית והפכו אותה בעדינות כדי לערבב את ה-aros עם המצע. הימנעו מיצירת בועות. לאחר מכן, קחו שני מיליליטר של תאים ועבדו אותם עם שני מיקרומולר BB chloramine ב-DMSO, או ב-DMSO בלבד כביקורת לטיפול; ערבבו את התאים עם 0.6%aros בדילול של אחד ለአחד כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרומולר אחד של BB chloramine.לאחר מכן, קחו מיליליטר אחד של תערובת התאים והוסיפו אותם בעדינות לשכבה התחתונה של פלטת תרבית בעלת שישה בארות. הניחו את הפלטה באופן אופקי על משטח שטוח בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות לפחות, כדי לאפשר לשכבה העליונה להת굳ב. לאחר שהתערובת הת굳בה, הכניסו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה.התחילו בהכנת שכבת ההזנה על ידי חימום במיקרוגל של תמיסת 3% 2-hydroxyethyl aro המוכנה מראש כפי שנעשה בעבר, והבאת בקבוק תמיסת ה-agro לטמפרטורה שווה בבןאמבט מים בטמפרטורה של 45 °C. ערבבו מיליליטר אחד של תמיסת agro בריכוז 3% עם תשעה מיליליטרים של מצע חימום בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר, והפכו בעדינות כדי לערבב את ה-aros עם המצע. הימנעו מיצירת בועות אוויר. לאחר טיפול בתערובת עם BB chloramine, הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד מהתערובת לכל באר בצלחת תרבית בעלת שש בארות המכילה את השכבות התחתונות והרכות.לאחר מכן, הנח את פלטת השגיוול בעלת שש הלולאות בצורה אופקית על משטח שטוח בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות לפחות, כדי לאפשר לתערובת להתמצק. לאחר התמצקות שכבת התמיכה (feeder layer), העבר את הפלטה לאנקובטור בטמפרטורה של 37 °C. חזור על הליך ההזנה זה מדי שבוע על ידי הוספת 1 mL של תמיסת טיפול בתוך מצע agros בריכוז 0.3% מעל שכבת התמיכה הקיימת, כדי להזין את התאים במצע חדש, עד להופעת מושבות.לאחר שבועיים וחצי של צמיחת תאים באגר רך, סופרים את מספר המושבות בכל באר. כדי להקל על הכימות, מדפיסים רשת על דף שקיפות ומצמידים את הרשת ללוח שש הבארות כדי לסייע באיתור התאים במהלך הספירה. גודל המושבות מכומת על ידי קוטרן של כל אחת מהמושבות והוא יהיה משתנה; הגדירו מראש גודל מושבה מייחסי כדי לקבוע אילו מושבות ייספרו.לדוגמה, במקרה זה, מושבות בגודל של 70 µm או יותר נכללות בניתוח הנתונים. לאחר הספירה, אטמו את פלטת התרבית בעלת שש הבארות באמצעות פאראפילם כדי למנוע מהג'לים להתייבש. שמרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C כדי למנוע היווצרות נוספת של מושבות ולצורך ספירות עתידיות.התוצאות מדגימות כי BB chloramine מעכב באופן משמעותי את היווצרותן של מושבות המופקות מתאי MC 10 DCIS בנוכחות מעכב pad. נרשמה ירידה הן ביצירת המושבות והן בגודלן בהשוואה לבקרת ה-DMSO. גודל המושבות עבור תאי MCF 10 DCIS שעובדו עם BB chloramine היה ברובו בטווח של 20 עד 100 micrometers.בעוד שגודל המושבות בביקורת ה-DMSO הפגין טווח רחב יותר של 70 עד 150 מיקרומטרים לאחר שבועיים וחצי של צמיחה, נספרו ונותחו רק מושבות הגדולות מ-70 מיקרומטרים. בביקורת ה-DMSO נמצא ממוצע של כ-3,500 מושבות, בעוד שבקבוצה שטופלה ב-BB chloramine נצפו כ-2,000 מושבות בלבד. לאחר שבועיים וחצי של גידול בתווך רך, נתון זה מייצג ירידה של 44% בממוצע היווצרות המושבות בנוכחות 1 מיקרומולרי BB Chloramine, מה שמעיד על עיכוב טורמורוגני משמעותי של תאי סרטן השד על ידי מעכב זה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לחמם מראש את כל הרכיבים והציוד כדי למנוע את התגבשות התמיסות בזמן העבודה, ותודה שצפיתם.

utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

סרטון זה מתאר בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה כדי לבדוק את ההשפעות של מעכב אנזים PADI ו- BB-Cl-amidine על גידולים בסרטן השד במבחנה. בדיקה זו מאפשרת גם הערכה כמותית של פוטנציאל התמרת התא בהקשר של הפרעות גנטיות.

בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה: שיטה לבדיקת השפעות של תרכובות חדשות על התפשטות תאים סרטניים

סרטון זה מתאר את בדיקת היווצרות המושבה, המסייעת לקבוע את יכולתם של תאי סרטן הריאה להתרבות ללא הגבלת זמן וליצור מושבות בודדות. אנו יכולים לנתח את ההשפעה של סוכן אנטי-סרטני על התאים יוצרי המושבה על ידי ניתוח השינויים במספר ו / או בגודל של המושבות המתקבלות.

בדיקת היווצרות מושבה: הערכת היעילות של חומרים אנטי-סרטניים על תאי סרטן ריאה יוצרי מושבה

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול של יחידת היווצרות מושבה מבוססת מתיל צלולוז או בדיקת CFU, המסייעת לזהות ולספור את מספר המושבות שנוצרו על ידי תאים לוקמיים בתגובה לטיפול בתרכובות אנטי-סרטניות.

בדיקת CFU מבוססת מתיל תאית: שיטה לקביעת ההשפעה של תרכובות אנטי-סרטניות על היווצרות מושבות בתאים לוקמיים

בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה היא שיטה המשמשת לאישור צמיחה בלתי תלויה בעיגון תאי במבחנה. מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש שיטה מחמירה לאיתור הפוטנציאל הגידולי של תאים שעברו טרנספורמציה וההשפעות מדכאות הגידול של חלבונים על תאים שעברו טרנספורמציה.

Assay גיבוש רך אגר המושבה

הליך זה ידגים כיצד סינתזנו ואפיינו את פעילות תאי הגזע האנטי-NFκB והאנטי-סרטניים של פרו-תרופה אספירין-פומרט.

סינתזה ואפיון של prodrug אספירין-fumarate המעכבת תאי גזע סרטניים פעילות השד NFκB

לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

בשנת מבחנה הפלישה תא מתורבת משמש כדי למדוד את הפוטנציאל של גרורות סרטן על ידי כימות הפוטנציאל התאי עבור פלישה והגירה באמצעות התרבות תאים מוסיף חלבון מטריצה. התאים מאותגרים לעבור דרך מטריצת החלבונים וממברנה נקבובי, לכיוון מיקרוסטנט, ולאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ אור.

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

פרוטוקול ניסויי זה מספק שיטה יציבה, חסכונית ויעילה המשלבת הפלת lncRNA עם בדיקות ליצירת מושבות כדי לכמת את השפעת ה-lncRNA על התרבות תאי האוסטאוסרקומה.

בדיקת היווצרות מושבה לזיהוי יכולת ההתרבות של תאי האוסטאוסרקומה שנגרמו ל-LncRNA

חקור את השימוש ב-assay כינונה רך באגר לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד באמצעות BB-Cl-amidine. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של יכולת התאים להתרבות במטריצות חצי-מוצקות.

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

גלה סרטונים נוספים