Name: ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: למדו שיטה לניתוח כמותי של פגמים בטיפוס ב-Drosophila melanogaster באמצעות מבחן גיאוטקסיס שלילי משופר. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של פגמים קלים בתנועה וסינון מטרות תרופתיות להפרעות ניווניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק צוות של המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR) לד"ר בולדוק (CO-PI) ולד"ר גיא רולו (PI). אנו רוצים להודות לד"ר אוקסנה סוכוברסקי, לד"ר קתרין טוד, לחברי מועדון הזבובים של אוניברסיטת אלברטה ולד"ר קלייטון דיקסון על העזרה בפיתוח השיטה והניתוח הסטטיסטי.

מחקר על תסיסנית melanogaster היה בעמידה באוניברסיטת הנחיות המחקר של אלברטה. 1. טוס אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20 זבובים באמצעות CO 2 הרדמה (ז) ומקום בבקבוקון אוסף 25 מ&quot;מ x 95 מ&quot;מ המכיל מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקונים המכילים חנות זבובים אופקית כדי למנוע השמנה זבובים בכל נוזלים שעלולות להצטבר בתחתית הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זבובים לפחות 21 שעות על 22 מעלות צלזיוס בלחות של 45% בחממה לכ 15 שעות. הגדר את החממה עם אור שעות 12: מחזור כהה. </li></ol> Assay 2. טיפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להעביר 20 זבובים מבקבוקון אחד לכוס 250 מיליליטר סיים גליל. לסמן את המיקום של הגליל כדי לשמור אותו קבוע כל יום. השתמש גליל זכוכית אחד לכל גנוטיפ על מנת למנוע זיהום צולב בין גנוטיפים. לשטוף בסוף כל ניסוי וroטייט בין גנוטיפים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הניסויים באור הסביבה (או אור אדום אם יש פגם פוטנציאלי בחזון) בטמפרטורה ובלחות של 22 מעלות צלזיוס ו -40% בהתאמה. כדי להימנע מלבלבל קצב היממה, תמיד לבצע ניסויים באותו הזמן של יום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החלק העליון של גליל עם סרט מכשול (סרט שעווה) כדי למנוע את בריחתו של זבובים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מצלמת וידאו על חצובה. מצלמה מתמקד בקו 190 מיליליטר של 250 מיליליטר סיימה גליל (17.5 סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר הזבובים מתים בתחתית של הגליל ובבקבוקוני המזון. רשום את המספר הזה כתמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד קל להקיש על הגליל נגד משטח קצף תא סגור שוב ושוב עם מספיק כוח כדי לעקור את הזבובים למשטח התחתון הפנימי. הקש 5 - 10 פעמים, תוך שימוש ביד השנייה כדי ללחוץ שיא במצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;קלט&quot; את המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל vidאיו הקלטה ומצלמה ברז הגליל שש פעמים בתבנית שאינה קצבית מובהקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל כל ניסוי למשך 2 דקות מרגע שזבובי טפח אחרון ולרשום את המספר של זבובים שחצו את הגובה של 17.5 סנטימטר (190 מיליליטר) בכל נקודת זמן שנבחרה (לכמת כל 10 שניות). הערה: מיליליטר סימון על הגליל ישתנה ממודל צילינדר אחד למשנהו בהתאם לקוטר. כדי להימנע משגיאה, למדוד את הגובה על כל גליל בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמשפט הסתיים, להיפטר מהזבובים באתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.9 עד שכל משכפל נבדקו עם זבובים טריים בכל פעם. הערה: למרות 5 משכפל עשוי להיות מספיק עם מוטציה שיש השפעה חזקה על תנועה, 10 חזרות ביולוגיות של 20 זבובים (200 זבובים) מומלץ לזהות הבדלים קטנים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הניסוי, לשטוף את הגלילים במדיח הכלים במעבדה וO היבש / N לשימוש חוזר. </li></ol> 3. ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Analyקטעי וידאו של כל ze לטוס משפט. כל 10 שניות, לרשום את המספר הכולל של זבובים שעוברים את קו היעד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זבוב מטפס בחזרה למטה או נופל שיא שעפים כ-1 ו, לספור את הזבוב הבא לחצות את קו היעד אותו המספר כמו הזבוב שטיפס בחזרה למטה או נפל. לדוגמא, אם זבוב ה -15 נופל מתחת לקו המטרה, הזבוב הבא לחצות את הקו (ה -16 לטוס) נחשב זבוב ה -15 ולא ה -16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את התמותה מהמספר הכולל של זבובים (20) כדי להשיג את מספר הזבובים שנותרו במשפט. בכל נקודת זמן, לקבל את החלק היחסי של זבובים מעל קו היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה כל אחוז בכל נקודת זמן (ראה איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הביצועים בנקודת נתונים 120 שניות ולבצע מבחן t תלמיד כאשר 2 קבוצות נמצאות או ANOVA ופוסט-מבחן להשוואות מרובות (עם שינוי Bonferroni למתוכנן וTukey לשיתוף בלתי מתוכנןmparisons). קולמוגורוב-סמירנוב בדיקות 17 גם מתבצע על מנת לוודא תקינות ושונות שווה אלא גם להשוות את ההפצות של קבוצת המוטציה לשליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להציג את הנתונים על הזדקנות, עלילה אחוז של זבובים לטפס ב 120 שניות עם זבובים בגילים שונים (2 ימים, שבוע 1, 2 שבועות) כדי לראות אם יש גירעון מתקדם (איור 4). </li></ol>

<ol><li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+protein+synthesis+in+Drosophila+fragile+X+mutants+impairs+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory.</a> Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).</li>
<li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+synaptic+plasticity%2C+courtship+behavior%2C+and+mushroom+body+defects+in+a+Drosophila+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome.</a> Neuron. 45, 753-764 (2005).</li>
<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187, 523-534 (2011).</li>
<li>Marley, R., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+persistent+Na%2B+current+contributes+to+seizure+in+the+slamdance+bang-sensitive+Drosophila+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant.</a> Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Mutants+Of+Drosophila+Isolated+By+Countercurrent+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Ganetzky, B., Flanagan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+senescence+and+age-related+changes+in+two+wild-type+strains+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster.</a> Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+Drosophila+melanogaster+geotaxis%2C+a+complex+behavioral+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait.</a> Nature genetics. 31, 349-353 (2002).</li>
<li>Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+simple+gravity+sensing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster.</a> Nature protocols. 5, 20-25 (2010).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Botella, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+carbonyl+reductase+sniffer+prevents+oxidative+stress-induced+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration.</a> Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Chakraborty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Drosophila+Alzheimer%27s+disease+model%3A+pharmacological+rescue+of+cognitive+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects.</a> PLoS One. 6, e20799(2011).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-related+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+are+ameliorated+by+treatment+with+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine.</a> J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).</li>
<li>Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehmann%2C+EL+%22Nonparametrics+%3A+statistical+methods+based+on+ranks%22">Nonparametrics : statistical methods based on ranks</a>. , 1st edn, Springer. (2006).</li>
<li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429(2004).</li>
<li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תסיסנית כבר הוכיחה להיות מודל מצוין ב1,2 המחלה 14 ותנאים ניווניות אחרים של פרקינסון. בנוסף לכלים הגנטיים הזמינים בדרוזופילה, הגנום שלו הוא שמור ביותר לגנים מעורבים בהפרעות נוירולוגיות 19. כניסתו של שיטות הגנום רחבות סינון גנטי (כוללים רצף exome שלם) עשויה להמשיך ולספק רשימה גדולה יותר של גנים הקשורים להפרעות מועמד תנועה אנושיות. פיתוח טיפולים לתנאים אלה יחייב מודלים של בעלי חיים כדי להגדיל את ההבנה של פתולוגיה מעורבת בשלבים המוקדמ...

הפרעות ניווניות הרסניות כגון מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, וparaplegia ספסטי התורשתי מוכרות יותר ויותר. למרבה הצער, רוב ההפרעות ניווניות אלה עדיין ללא טיפולים. השימוש הקליני הנרחב ב, בדיקות גנטיות משוחדת הגנום כגון רצף exome כל הוביל למספר גדל והולך של גנים שמעורבים בהפרעות קטר אנושיות. למרות התקדמות זו, ההתקדמות פתולוגיים ממוקדם לשלבים מאוחרים, נותרת חמקמקה בהפרעות אלה. תסיסנית מספקת אחד עם הכלים הגנטיים ללימוד דרישת גן באופן מרחב ובזמן בשליטה. בנוסף, תסיסנית הוכיחה שימושית בסינון תרופות לתנאי נוירולוגיות כמו פרקינסון 1, אלצהיימר 2, נכות אינטלקטואליות 3,4 ואפילפסיה 5,6 בין יתר. המטרה שלנו הייתה לפתח חסכוניוassay אמין שיאפשר ניתוח תפוקה גבוה שעדיין יהיה רגיש מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בביצועי מנוע. ישנם מספר מבחני המשמשים לכמת את ההשפעות של מוטציה גנטית ו / או תנאי סביבה על תסיסנית טיפוס התנהגות. רוב מבחני לנצל את הנטייה הטבעית של זבובים לטפס, הידוע בשם geotaxis השלילית, או assay הטיפוס. 7 Benzer הציע בשנת 1967 כי המנגנון נגד זרם המשמש למחקר של Phototaxis יכול לשמש גם כדי ללמוד gravitaxis. מאז, Ganetsky 8 ועוד רבים אחרים 9 -12 שנבנו על assay הראשוני. העיקרון הוא למקם מספר ידוע של זבובים בבקבוקון ולהקיש על הבקבוקון בחריפות נגד משטח קשה, גורם לזבובים ליפול לתחתית של הבקבוקון. כפי שהוא התנהגות מולדת, הזבובים ינסו לטפס לחלק העליון של הבקבוקון, בניגוד לכוח המשיכה. assay זה הוא כמותי וmeasuמיל כמה זבובים טיפס עבר סמן על הבקבוקון במהלך תקופת זמן מוקצב. מדידה של מהירות במקום מספר הכולל של טיפוס זבובים הפכה פרמטר אמין ולראות פגמים במקרים בהם מספר קריטריוני זבובים לא היה משמעותי 13. Assay הטיפוס הוכיח שימושי בחקר הפרעות ניווניות רבות, כולל מחלת פרקינסון 14. עם זאת, ציינו כי ליקויי קטר לא יכולים להיות לזיהוי בזמן שבו ניוון של מערכת עצבים נראים כבר במחקרים פתולוגיים 14. לפיכך, שימוש של assay המסורתי עלול להגביל את היכולת ללמוד המוקדמים של היווצרות מחלה בשלבים. המראה של פגמי קטר בשלבים מאוחר יותר של פתולוגיה עשוי לשקף מחלה ההתקדמות שלו הוא מתקדם מדי להצלה שלמה. זה מעלה בעיה פוטנציאלית עם הרגישות של assay הטיפוס המסורתי. חוסר היכולת הפוטנציאלית של tradiניתן לייחס tional טיפוס assay כדי לזהות פגמי קטר קלים עד הגובה שאליו הזבובים נדרשים לטפס. Assay 15,16 האמצעים המסורתיים מספר הזבובים לטפס בהצלחה מעל לגובה של 2 עד 5 סנטימטר ב 10 עד 20 שניות.

<table><tbody><tr>מניות <td></td><td></td><td>דרוזופילה</td><td>המניות נבחרות בהתאם לניסויים. הטמפרטורה והלחות בחדר ובחממה חייבות להיות מבוקרות ועקביות כדי למנוע מהזבובים להיות סטטיים מדי או רטובים מדי.</td></tr><tr><td>מצלמת</td><td></td><td></td> וידאו <td>כל מצלמת וידיאו דיגיטלית תתאים. ודא שהם יכולים להתמקד באובייקט קרוב.</td></tr><tr><td>צילינדר בוגר</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>דגמים שונים של צילינדר מדורג עשויים להיות בעלי קוטר שונה. לכן חובה למדוד את הגובה.</td></tr><tr><td>מחשב</td><td></td><td></td><td>כל דגם יעשה. השתמשנו במחשב כדי לעקוב אחר הטיפוס של הזבובים ולרשום את מספר הזבובים בכל נקודת זמן.</td></tr></tbody></table>

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

פגמי קטר הנובעים מהפרעות ניווניות יכולים להיות סימפטום מאוחר של מחלה, לאחר שנים של ניוון תת-קליני, ואסטרטגיות טיפול טיפוליות וכך הנוכחיות אינן מרפאים. באמצעות השימוש ברצף exome כל, מספר גדל והולך של גנים זוהה לשחק תפקיד בתנועה אנושית. למרות זיהוי גנים אלה, זה לא ידוע כמה גנים אלה הם חיוניים לתפקוד נורמלי קטר. לכן, assay אמין, אשר מנצל אורגניזמים מודל על מנת להבהיר את תפקידם של גנים אלה כדי לזהות מטרות רומן של עניין טיפולי, יש צורך יותר מתמיד. יש לנו תוכנן גרסה רגיש של assay geotaxis השלילית המאפשר לגילוי פגמים קלים יותר מוקדם ויש לו היכולת להעריך ליקויים אלה לאורך זמן. Assay מבוצע בכוס סיים גליל, אשר חתום עם סרט מכשול שעווה. על ידי הגדלת מרחק הסף להיות טיפס ל -17.5 גמ &#39;ולהגדיל את משך הניסוי 2 דקות שראינו רגישות רבה יותר באיתור בעיות בתפקוד ניידות קלה. Assay הוא עלות אפקטיבי ואינו דורש הכשרה מקיפה כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור. זה עושה את זה טכניקה מעולה לסינון תרופות מועמד במוטציות תסיסנית עם מומי תנועה.

טיפוס הוא התנהגות חזקה ושחזור. ואכן, זבובים בר-סוג ישנים יום אחד להגיע לביצועי מרחק יעד הטיפוס במהירות (25 - 30 שניות). זבובים מוטנטים להציג מגוון של ביצועים בין מתון (או מאוחר) כדי להשלים חוסר יכולת לטפס ליעד. אנו להמחיש זאת כאן עם שני אללים מוטציה שונים. הראשון הוא אלל חמור של spastin הגן שנגרם על ידי מחיקה של גן spastin (ספא 5.75) 18 מלאה. בקו הזה (ספא 5.75 עם TM6b) יום אחד זבובים ישנים לא להגיע לביצועי טיפוס WT גם לאחר 2 דקות. קו מוטציה זה מציג עם מומים ח...

אנו מציגים בדיקת גיאוטקסיס שלילית אופטימלית, זולה ואמינה ב-Drosophila melanogaster כמודל להפרעות ניווניות. בהיותה רגישה יותר לפגמים תנועתיים קלים, בדיקה זו תעזור לסנן אינטראקציות גנטיות פוטנציאליות ומטרות תרופתיות.

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את יכולת הטיפוס של זבובים מסוג בר (wild type) ושל זבובים עם מוטציות בגנים המעורבים בתנועה. הדבר מבוצע תחילה על ידי העברת הזבובים למשורה מזכוכית. השלב השני הוא דחיפת הזבובים לתחתית המשורה על ידי הקשה קלה על המשורה על גבי ריפוד ספוג.הזבבים הבאים החוצים את קו היעד נרשמים באמצעות מצלמה למשך שתי דקות. השלב הסופי הוא ניתוח הסרטונים ושרטוט מספר הזבבים שמעל קו היעד בכל 10 שניות. בסופו של דבר, בדיקת הטיפוס משמשת לזיהוי פגמים ביכולת הטיפוס של קווי מוטציה של זבוב פירות.היתרון העיקרי של טכניקה זו, או של טכניקות קיימות, כגון שיטת ה-wild, הוא היכולת שלה לזהות הבדלים מינוריים ביכולת הטיפוס. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההפרעות הנוירודגנרטיביות, כגון תפקידם של גנים ספציפיים ב-hereditary spastic paraplegia בירידה פרוגרסיבית ביכולת ההליכה. המשמעות של טכניקה זו היא נטייה לקדם את הפיתוח של טיפולים תרפויטיים.בדיקת טיפוס (IP) עבור הפרעות נוירולוגיות משמשת כבדיקה כמותית פשוטה לבחינת תגובה לתרופות ומוטציות בגנים מועמדים למחלות נוירודגנרטיביות. התחילו בהרדמת 20 זבובים באמצעות פחמן דו-חמצני והעבירו את כל הזבובים למבחנה לאיסוף בגודל 25 מילימטר על 95 מילימטר המכילה מזון. לאחר מכן, אחסנו את המבחנה עם הזבובים במצב אופקי במגש קרטון כדי למנוע את לכודם בנוזל שעלול להצטבר בתחתית המבחנה. הניחו את הזבובים באינקובטור למשך 21 שעות לפחות תחת מחזור של 12 שעות אור וחושך. למחרת בבוקר, הכינו את בדיקת הטיפוס על ידי העברת הזבובים מהמבחנה למשורה מזכוכית בנפח 250 מיליליטר, ואטמו את החלק העליון בסרט שעווה כדי למנוע בריחה של זבובים.בצע את הניסוי בתאורה סביבתית, בטמפרטורה של 22 °C ובלחות של 40%. בצע תמיד את הניסויים באותה שעה של היום כדי למנוע משתנים מתערבים הקשורים למחזורי שינה. כמו כן, סמן את מיקום הגליל על גבי משטח העבודה כדי לשמור עליו קבוע מדי יום.ספרו את מספר הזבובים המתים בתחתית הגליל ובמבחנות המזון, ורשמו מספר זה כשיעור התמותה. לאחר מכן, הגדירו את מצלמת הווידאו על חצובה. התמקדו בעזרת המצלמה בקו ה-190 milliliter של גליל המדידה בנפח 250 milliliter בעדינות רבה.הקישו את הגליל חמש עד 10 פעמים כנגד רפידה ספוגית בעלת תאים סגורים, בעוצמה מספקת כדי להזיז את הזבובים אל פני השטח התחתונים הפנימיים. לאחר מכן, השתמשו ביד השנייה כדי ללחוץ על כפתור ההקלטה במצלמה. לאחר מכן, הקישו על הגליל שש פעמים בדפוס ברור שאינו קצבי בזמן שהמצלמה מקליטה.בצעו כל ניסוי במשך שתי דקות מרגע ההקשה האחרונה על הזבובים. לבסוף, העבירו את הזבובים ל-95% ethanol לצורך השמדה. לאחר השלמת הניסוי, חזרו על בדיקת הטיפוס זו 10 פעמים, תוך שימוש ב-20 זבובים טריים בכל פעם, וזאת כדי לזהות הבדלים קטנים בתנועה בין הקבוצות.שטפו את הגלילים במדיח כלים וייבשו אותם למשך לילה כדי שניתן יהיה להשתמש בהם שוב. לאחר סיום הניסוי, כדי לנתח את ביצועי הזבובים, התחילו בצפייה בסרטוני ההקלטה של כל ניסוי בזבוב. רשמו את המספר הכולל של הזבובים שעוברים את קו היעד בכל 10 שניות. אם זבוב מטפס חזרה למטה או נופל, רשמו זבוב זה כמינוס אחת, וספרו את הזבוב הבא שיחצה את קו היעד באותו מספר של הזבוב שטיפס חזרה למטה או נפל.לדוגמה, אם הזבוב ה-15 נופל מתחת לקו היעד, הזבוב הבא שיחצה את הקו ייחשב כזבוב ה-15 ולא כזבוב ה-16. לאחר מכן, החסיר את שיעור התמותה מהמספר הכולל של הזבובים כדי לקבל את מספר הזבובים שנותרו בחלקת הניסוי. בבדיקת אחוז הזבובים שמעל לקו היעד בכל נקודת זמן בעבודה עם מוטציות חמורות, ניתן להבחין בדרגות שונות של פגם בטיפוס באמצעות בדיקות טיפוס שונות.כאן, נרשם מספר הזבובים בני שמונה ימים שטיפסו לחלק העליון של מבחנת מזון ריקה לאחר 18 שניות, מה שהראה כי אין הבדל משמעותי בהתנהגות הטיפוס בין שתי הקבוצות. לעומת זאת, בשימוש במבחן הטיפוס מפרוטוקול זה, זבובים מוטנטים של Bastin 17 dash seven over TM three מראים ליקוי בביצועים בהשוואה לקבוצות הביקורת. מכיוון שהפרעות מוטוריות רבות הן פרוגרסיביות, חשוב לעקוב אחר התפתחות הזבובים לאורך זמן.בגיל יומיים, קיים הבדל משמעותי במספר הזבובים המטפסים מעל לקו היעד, בהשוואה לקבוצות הביקורת. ביצועי טיפוס אלו ממשיכים לרדת ככל שהזבובים המוטנטיים מזדקנים מגיל יומיים והלאה.ברגע שהניסוי והניתוח יישלטו, ניתן להשלימם תוך שלוש שעות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת פגמים לוקומוטוריים במודלים של מוטנטים של זבב הפירות (drosophila) להפרעות נוירולוגיות.

quantitative-analysis-climbing-defects-drosophila-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מבחני התנהגות למדידת פונקציות של תנועה, למידה, ויכולות...

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

סרטון זה מתאר שיטה פשוטה לכימות תנועת הזבובים ומציג את בדיקת הטיפוס שבוצעה. מבחן טיפוס הזבובים הוא מבחן כללי של תפקוד מוטורי המסתמך על תגובת גיאוטקסיס שלילית.

בדיקת טיפוס זבובים: שיטה לבדיקת תנועה כללית בדרוזופילה מלנוגסטר

כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA)...

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מנתח התנהגות שלילית geotaxis דרוזופילה באמצעות מערכת אוטומטית צילינדר רב מארח מאות זבובים ומסנכרן פעולתם על ידי מנוע חשמלי. בעת סינכרון, התנהגות לטוס geotaxis שלילי זה לבדיקה, דיגיטלית המוקלט ולאחר שנותחה שימוש בתוכנת RflyDetection בעיצוב עצמי.

וזמינותו אוטומטית מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים מודל דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים

פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

המטרה של הליך זה היא לנתח את רקמת שריר האורך גב (DLM) כדי להעריך את השלמות המבנית של צמתים עצביים שריריים DLM (NMJs) במודלים של מחלות ניווניות באמצעות מלנוגסטר Drosophila.

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

הפרוטוקול הנוכחי מעריך את הפעילות המוטורית של דרוזופילה על ידי מעקב וניתוח תנועת הזבובים בזירה בעבודת יד באמצעות תוכנת קוד פתוח פיג'י, התואמת לתוספים לפלח פיקסלים של כל פריים בהתבסס על הקלטת וידאו בחדות גבוהה כדי לחשב פרמטרים של מהירות, מרחק וכו '.

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

פרוטוקול זה מציג בדיקה למידול עצירות במודל דרוזופילה מבוסס אלפא-סינוקלאין של מחלת פרקינסון.

מדידת עצירות במודל דרוזופילה של מחלת פרקינסון

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

למדו שיטה לניתוח כמותי של פגמים בטיפוס ב-Drosophila melanogaster באמצעות מבחן גיאוטקסיס שלילי משופר. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של פגמים קלים בתנועה וסינון מטרות תרופתיות להפרעות ניווניות.

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

גלה סרטונים נוספים