ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את יכולת הטיפוס של זבובים מסוג בר (wild type) ושל זבובים עם מוטציות בגנים המעורבים בתנועה. הדבר מבוצע תחילה על ידי העברת הזבובים למשורה מזכוכית. השלב השני הוא דחיפת הזבובים לתחתית המשורה על ידי הקשה קלה על המשורה על גבי ריפוד ספוג.

הזבבים הבאים החוצים את קו היעד נרשמים באמצעות מצלמה למשך שתי דקות. השלב הסופי הוא ניתוח הסרטונים ושרטוט מספר הזבבים שמעל קו היעד בכל 10 שניות. בסופו של דבר, בדיקת הטיפוס משמשת לזיהוי פגמים ביכולת הטיפוס של קווי מוטציה של זבוב פירות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו, או של טכניקות קיימות, כגון שיטת ה-wild, הוא היכולת שלה לזהות הבדלים מינוריים ביכולת הטיפוס. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההפרעות הנוירודגנרטיביות, כגון תפקידם של גנים ספציפיים ב-hereditary spastic paraplegia בירידה פרוגרסיבית ביכולת ההליכה. המשמעות של טכניקה זו היא נטייה לקדם את הפיתוח של טיפולים תרפויטיים.

בדיקת טיפוס (IP) עבור הפרעות נוירולוגיות משמשת כבדיקה כמותית פשוטה לבחינת תגובה לתרופות ומוטציות בגנים מועמדים למחלות נוירודגנרטיביות. התחילו בהרדמת 20 זבובים באמצעות פחמן דו-חמצני והעבירו את כל הזבובים למבחנה לאיסוף בגודל 25 מילימטר על 95 מילימטר המכילה מזון. לאחר מכן, אחסנו את המבחנה עם הזבובים במצב אופקי במגש קרטון כדי למנוע את לכודם בנוזל שעלול להצטבר בתחתית המבחנה. הניחו את הזבובים באינקובטור למשך 21 שעות לפחות תחת מחזור של 12 שעות אור וחושך. למחרת בבוקר, הכינו את בדיקת הטיפוס על ידי העברת הזבובים מהמבחנה למשורה מזכוכית בנפח 250 מיליליטר, ואטמו את החלק העליון בסרט שעווה כדי למנוע בריחה של זבובים.

בצע את הניסוי בתאורה סביבתית, בטמפרטורה של 22 °C ובלחות של 40%. בצע תמיד את הניסויים באותה שעה של היום כדי למנוע משתנים מתערבים הקשורים למחזורי שינה. כמו כן, סמן את מיקום הגליל על גבי משטח העבודה כדי לשמור עליו קבוע מדי יום.

ספרו את מספר הזבובים המתים בתחתית הגליל ובמבחנות המזון, ורשמו מספר זה כשיעור התמותה. לאחר מכן, הגדירו את מצלמת הווידאו על חצובה. התמקדו בעזרת המצלמה בקו ה-190 milliliter של גליל המדידה בנפח 250 milliliter בעדינות רבה.

הקישו את הגליל חמש עד 10 פעמים כנגד רפידה ספוגית בעלת תאים סגורים, בעוצמה מספקת כדי להזיז את הזבובים אל פני השטח התחתונים הפנימיים. לאחר מכן, השתמשו ביד השנייה כדי ללחוץ על כפתור ההקלטה במצלמה. לאחר מכן, הקישו על הגליל שש פעמים בדפוס ברור שאינו קצבי בזמן שהמצלמה מקליטה.

בצעו כל ניסוי במשך שתי דקות מרגע ההקשה האחרונה על הזבובים. לבסוף, העבירו את הזבובים ל-95% ethanol לצורך השמדה. לאחר השלמת הניסוי, חזרו על בדיקת הטיפוס זו 10 פעמים, תוך שימוש ב-20 זבובים טריים בכל פעם, וזאת כדי לזהות הבדלים קטנים בתנועה בין הקבוצות.

שטפו את הגלילים במדיח כלים וייבשו אותם למשך לילה כדי שניתן יהיה להשתמש בהם שוב. לאחר סיום הניסוי, כדי לנתח את ביצועי הזבובים, התחילו בצפייה בסרטוני ההקלטה של כל ניסוי בזבוב. רשמו את המספר הכולל של הזבובים שעוברים את קו היעד בכל 10 שניות. אם זבוב מטפס חזרה למטה או נופל, רשמו זבוב זה כמינוס אחת, וספרו את הזבוב הבא שיחצה את קו היעד באותו מספר של הזבוב שטיפס חזרה למטה או נפל.

לדוגמה, אם הזבוב ה-15 נופל מתחת לקו היעד, הזבוב הבא שיחצה את הקו ייחשב כזבוב ה-15 ולא כזבוב ה-16. לאחר מכן, החסיר את שיעור התמותה מהמספר הכולל של הזבובים כדי לקבל את מספר הזבובים שנותרו בחלקת הניסוי. בבדיקת אחוז הזבובים שמעל לקו היעד בכל נקודת זמן בעבודה עם מוטציות חמורות, ניתן להבחין בדרגות שונות של פגם בטיפוס באמצעות בדיקות טיפוס שונות.

כאן, נרשם מספר הזבובים בני שמונה ימים שטיפסו לחלק העליון של מבחנת מזון ריקה לאחר 18 שניות, מה שהראה כי אין הבדל משמעותי בהתנהגות הטיפוס בין שתי הקבוצות. לעומת זאת, בשימוש במבחן הטיפוס מפרוטוקול זה, זבובים מוטנטים של Bastin 17 dash seven over TM three מראים ליקוי בביצועים בהשוואה לקבוצות הביקורת. מכיוון שהפרעות מוטוריות רבות הן פרוגרסיביות, חשוב לעקוב אחר התפתחות הזבובים לאורך זמן.

בגיל יומיים, קיים הבדל משמעותי במספר הזבובים המטפסים מעל לקו היעד, בהשוואה לקבוצות הביקורת. ביצועי טיפוס אלו ממשיכים לרדת ככל שהזבובים המוטנטיים מזדקנים מגיל יומיים והלאה.

ברגע שהניסוי והניתוח יישלטו, ניתן להשלימם תוך שלוש שעות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת פגמים לוקומוטוריים במודלים של מוטנטים של זבב הפירות (drosophila) להפרעות נוירולוגיות.