Name: בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: למד לבודד מקרופאגים פריטונאיים ממקור מוריני לניתוח ביטוי גנים בעקבות גירוי TLR. הפרוטוקול משתמש בתיוגליקולט ברואר להגברת תנועת מונוציטים וזרימה ציטומטריה לאפיון התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC, מענק לא 298,515-2011). AL הוא הנמען של דוקטורט מלגה ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC), ו- MS נתמכה ממענק מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, להעניק אין. MOP123246).

כל הנהלים בוצעו בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים לאחר אישור הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים של מרכז דה משוכלל ונדיר du המרכז הרפואי de l&#39;אוניברסיטת מונטריאול (CRCHUM). 1. בידוד, זיהוי, ותרבות של Murine הצפק המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני thioglycollate של 3.8% ברואר. לשם כך, להשעות 38 גרם של thioglycollate בינוני ב1,000 מיליליטר של מים מזוקקים. להביא פתרון לרתיחה לפזר הבינוני לחלוטין. לעקר ידי מעוקר ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחסן עד 3 חודשים בחושך, בRT 18. הערה: בטל אם עכירות מפתחת המצביעה על זיהום חיידקים. הפתרון יכול להיות כל הזמן לעד שנה בחושך אם שמר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש 1 מיליליטר מזרקים מצורפים 23 מחטי G, להזריק 1 מיליליטר של 3.8% ברואר thioglycollate בינוניים לתוך חלל הצפק של כל mouSE ולחכות 3 ימים. השתמש מזרק ומחט חדשים לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בזריקת intraperitoneal של נתרן pentobarbital (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ולהרדים עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם. לאשר הרדמה תקינה על ידי בדיקת קצב הנשימה. בדרך כלל נשימות מהירות מצביעות על כך שהעכבר לא מורדם עמוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הבטן של כל עכבר עם 70% אתנול. באמצעות מספריים, לבצע חתך לרוחב לאורך קו האמצע התחתון של הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, למשוך בחזרה את עור הבטן כדי לחשוף את עור הצפק השקוף. שימוש במזרקים 5 מיליליטר מצורף 20 מחטי G, להזריק 5 מיליליטר של DPBS הקר לתוך חלל הצפק של כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עיסוי עדין בחלל הצפק ולאחר מכן לשאוב את הנוזל בזהירות מבלי ניקוב כל איבר. הסר את המחט ולוותר נוזל הצפק לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 400 XG בצנטריפוגה בקירור.תאים חייבים להישאר קרים במהלך כל התהליך. בטל supernatant ו resuspend תא גלולה במדיום RPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות hemocytometer, לספור תאים ולהסתגל לצפיפות תאים 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את הפנוטיפ של תאים מבודדים על ידי cytometry זרימה באמצעות 1 x 10 6 תאים לכל עכבר וantibodie נגד F4 / 80 (אנטיגן שטח הביע במקרופאגים). </li></ol> 2. טיפולים סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות, לאחר בידוד, להוסיף 1 x 10 6 תאים לכל אחד. השאר את מקרופאגים הצפק עכברי לדבוק לתוך צלחות 6-היטב על ידי culturing אותם ל1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הסרת תאים שאינם חסיד בעדינות על ידי שטיפת 3 פעמים עם PBS החם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, תאי תרבות בסרום ללא DMEM 900 μl למשך 24 שעות בנוכחות ligands TLR הבא: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (מ&quot;ג 0.5 / מיליליטר); פולי (אני: C) -TLR3 (10 מ&quot;ג / מיליליטר) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagellin-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 מיקרוגרם / מיליליטר); ODN1826-TLR9 (1 מיקרומטר). הערה: הכן לכל יגנד פתרון 10x המניה. להוסיפם של אלה 100 μl היטב כל אחד, ובכך מבצע דילול של פי 10. </li></ol> בידוד 3. RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל התאים בינוניים וlyse ישירות בצלחות שש היטב על ידי הוספת 1 מיליליטר TRIzol היטב כל אחד ועובר lysate התא מספר פעמים באמצעות פיפטה. דגירה דגימות homogenised במשך 5 עד 10 דקות ב RT, על מנת לאפשר לניתוק של מתחמי nucleoprotein המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate לתוך 1.5 מיליליטר RNase- וצינורות microcentrifuge ללא DNase. להוסיף 0.2 מיליליטר כלורופורם לTRIzol 1ml. Shake צינורות במרץ ביד במשך 15 שניות ודגירתם על RT במשך 5 עד 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שים לב לתערובת מפרידה לשלב אדום (פנול, כלורופורם) נמוך, הביניים ושלב מימיים עליון חסר צבע. RNA נשאר אך ורק בשלב המימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראןספיר בזהירות את השלב מימי העליון לצינור טרי מבלי להפריע הביניים. לזרז את הרנ&quot;א מזה על ידי ערבוב עם 0.5 מיליליטר של אלכוהול איזופרופיל. דגירה דגימות ב RT במשך 10 דקות ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. RNA משקעים יוצר גלולה לבנה בצד והחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant. שטוף את כדור פעם אחת RNA עם 1 מיליליטר של אתנול 75%. מערבבים את הדגימות על ידי vortexing ו צנטריפוגות ב 7500 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. בקצרה לייבש את RNA (אוויר יבש במשך 10 דקות). לפזר RNA ב 0.1 מיליליטר DEPC (מים חופשיים RNAse) ודגירה של 10 דקות על 55 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. כדי לעשות זאת, לדלל דגימות במי DEPC 100 פעמים ולקרוא באורכי גל של 260 ננומטר. אז ריכוז RNA יהיה: OD 260 x 40 ng ul x גורם לדילול /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות ריכוזי RNA וסינתזה cDNA לפי הוראות יצרן באמצעות מערכת RT-PCR לערכת ראשון סטרנד cDNA סינתזה. כלפי הוראות יצרן, למדוד את רמות ה- mRNA של הגן על ידי בזמן אמת PCR (45 מחזורים) במערכת זיהוי DNA בזמן אמת. לנרמל את רמות ביטוי גנים עם גן שני משק למשל β-אקטין וGAPDH. הערה: נרמל ריכוז RNA 500 מיקרוגרם / מיליליטר ולהשתמש 0.5 מיקרוגרם לסינתזת cDNA. </li></ol>

<ol><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+macrophages+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trophic macrophages in development and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Koury, M. J., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+erythropoiesis%3A+the+roles+of+folate%2C+vitamin+B12%2C+and+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron.</a> Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).</li>
<li>Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-heme+induction+of+heme+oxygenase-1+does+not+alter+cellular+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism.</a> J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).</li>
<li>Hershko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+iron+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Hematol%22%5BJournal%5D)">Storage iron regulation.</a> Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).</li>
<li>Collins, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Withholding+iron+as+a+cellular+defence+mechanism--friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe.</a> Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).</li>
<li>Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+reticulo-endothelial+cell+in+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism.</a> Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).</li>
<li>Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signal+adaptor+protein+MyD88+is+required+for+sustained+endotoxin-induced+acute+hypoferremic+response+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).</li>
<li>Zumerle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+hepcidin+in+the+liver+recapitulates+the+hemochromatotic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype.</a> Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).</li>
<li>Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+expression+and+iron+transport+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).</li>
<li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin%2C+a+putative+mediator+of+anemia+of+inflammation%2C+is+a+type+II+acute-phase+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein.</a> Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).</li>
<li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+regulates+cellular+iron+efflux+by+binding+to+ferroportin+and+inducing+its+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization.</a> Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).</li>
<li>Constante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+Hfe+in+basal+and+induced+hepcidin+levels+in+iron+overload+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+thioglycolate+on+phagocytic+and+microbicidal+activities+of+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages.</a> Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).</li>
<li>Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+thioglycollate+on+macrophage+lysosomal+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes.</a> Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).</li>
<li>Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+products+in+aged+thioglycollate+medium+enhance+the+elicitation+of+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).</li>
<li>Layoun, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+wall+constituents+induce+hepcidin+expression+in+macrophages+through+MyD88+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling.</a> Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).</li>
<li>Oppenheim, J. J., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarmins%3A+chemotactic+activators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alarmins: chemotactic activators of immune responses.</a> Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).</li>
<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li>
<li>Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+gene+expression+in+activated+and+resting+primary+macrophages+by+IL-10%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10.</a> J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+murine+macrophages+from+bone+marrow%2C+spleen+and+peritoneum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum.</a> BMC Immunol. 14 (6), (2013).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Cannon, G. J., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+capacity+for+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The macrophage capacity for phagocytosis.</a> J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).</li>
<li>Wang, Y., Harris, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in renal disease.</a> J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).</li>
<li>Schleicher, U., Bogdan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+culture+and+flow-cytometric+characterization+of+primary+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages.</a> Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

המקרופאגים הם חיוניים להישרדות ולספק יעד מפתה כדי לתפעל את המארח למטרות חיסוניות. הגילוי של TLRs ומולקולות הכרה אחרות שנערך מקרופאגים למרכז דיון חיסוני. המקרופאגים להגיב למגוון של גירויים, כולל ציטוקינים, מולקולות הקשורים נזק מולקולרי דפוס (damps) 20 ומולקולות הקשורות לקבוצות של פתוגנים (PAMPs) 21. תגובות לגירויים שונות אלה מייצגים במהלך הפעלת מקרופאגים, והם בדרך כלל קשורים בשינויים פתאומיים בביטוי גנים 22. <p class="jove_content" style=";text-...

מערכת phagocytic הרטיקולואנדותליאלית מורכבת מתאים ברקמות שונות ואיברים כמו מוח עצם, דם, כבד וטחול. המקרופאגים מופצים באופן נרחב ברחבי הגוף, שבו הם בעיקר להשתתף במולד אדפטיבית תגובות חיסוניות לשלוט וזיהומים ברורים. בנוסף לתפקידם בהגנת מארחת, מקרופאגים גם לשחק תפקיד חשוב בריפוי פצעים ובשמירה על הומאוסטזיס רקמות 1,2. יתר על כן, מקרופאגים הם לא רק חשובים לתפקוד מערכת חיסון, אלא גם להשתתף באופן פעיל בברזל הומאוסטזיס 3. בגוף, כ -80% מברזל נמצאים בהמוגלובין בתוך אריתרוציטים, שכאשר הם מזדקנים phagocytosed ידי מקרופאגים 4. יומי, מקרופאגים אלה למחזר 25 מ&quot;ג של ברזל המופק כדורית אדומה ולספק התחבורה שלה לפלזמה 5. יתר על כן, במהלך זיהום ודלקת, מקרופאגים פרו-דלקתיים לעקל ברזל בסרום להפחתת availabili הברזלטאי לפתוגנים, בשתי הרמות המערכתיות ומקומיות 6-8. כמו כן, מחקרים הראו כי מקרופאגים ובעיקר hepatocytes לייצר פפטיד מיקרוביאלית שם hepcidin שנחשב הרגולטור הראשי של ברזל חילוף חומרים 9, 10. Hepcidin הוא גדל בעיקר על ידי גירויים דלקתיים, והוא אחראי באופן חלקי לקיבוע ברזל במקרופאג על דלקת כרונית 11-13. כביטוי hepcidin במקרופאגים אינו מובן היטב, שחקרנו את התפקיד האפשרי של קולטני-כמו אגרה (TLRs) בתקנה זו. TLRs נמצא בעיקר במקרופאגים ולשחק תפקיד מרכזי בהפעלתם. בנוסף, ביטוי hepcidin המושרה LPS בכבד תלוי בTLR4 13. לכן, כדי לבצע המחקר שלנו, השתמשנו בשיטה המבוססת על הבידוד של מקרופאגים הצפק עכברי. שורות תאי מקרופאג משמשות באופן נרחב בהרבעת מקרופאגies; בכל זאת תרבות המורחבת יכולה לעורר אובדן גן וירידה בתפקודים חיסוניים בשורות תאים אלה. לפיכך, בידוד של מקרופאגים מחלל הצפק הוא קריטי. חלל הצפק העכבר מציג אתר אידיאלי למסוק מקרופאגים 13-15. מקרופאגים הצפק עכברי מבודדים נוחים לכמה מחקרים לגבי התפקוד החיסוני שלהם. עם זאת, מספר מקרופאגים בהצפק אינו מספיק למחקרים מקיפים והערכה הוא סביב 1 x 10 6 מקרופאגים לכל עכבר. לכן, כדי להעלות את תפוקת מקרופאג, סוכן לעורר סטרילי כגון thioglycollate הוזרק לתוך חלל הצפק שקדמו לבציר התא. לאחר הזרקת thioglycollate, התשואה של מקרופאגים לכל עכבר שעלתה בפי 10. למרות העלייה בתשואת מקרופאגים, המעשים בינוניים thioglycollate של ברואר כמטרד שגורם תגובה דלקתית, וכתוצאה מכך הגיוס של מקרופאגים, שmay אבל לא הכרחי משפיע על ביטוי גנים. לפיכך, קבוצת שליטה בהיקף של מקרופאגים שאינם מטופלים חייבת להיות כלולה בכל ניסוי. בידיים שלנו, ביטוי hepcidin שהמגורה מאוד על ידי דלקת לא זוהה בthioglycollate שאינו מטופלים שהושרו מקרופאגים הצפק. יתר על כן, מחקרים הראו כי thioglycollate של ברואר מגייס מקרופאגים רבים, אבל לא להפעיל אותם 16. מצד השני, thioglycollate של ברואר שהושרו מקרופאגים הראו עלייה באנזים lysosomal אבל ירידה בהרג מיקרואורגניזמים בלע 17. עם זאת, יכולת phagocytic לא הושפעה בהשוואה למקרופאגים-הושר לא 16. ברגע תרבותי במנות, מקרופאגים הצפק להיות חסיד, ובכך מאפשרים הפרדתם מסוג אחר של תאים מבודדים מחלל הצפק. בהמשך לכך, מקרופאגים המבודדים היו תיגר עם אגוניסטים TLRs שונים.לבסוף, mRNA היה שחולץ מהתאים בתרבית וביטוי גנים נותח באמצעות תגובת שרשרת כמותי הפוכה transcriptase-פולימראז (qRT-PCR).

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 עכברים</td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר, בע"מ (ווילמינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>475</td><td></td></tr><tr><td>תיוגליקולט</td><td>סיגמא-אולדריץ', (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>19032-500G</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% נתרן פנטוברביטל (משמש להרדמת עכברים (80 מ"ג/ק"ג, i.p.))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS), מונחת על קרח ותשמש לקצירת מקרופאגים</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (תוסף עם פניצילין, סטרפטומיצין, L-גלוטמין ו-10% סרום עגל עוברי).</td><td>WISENT INC קנדה (QC)</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים 1 ו-5 מ"ל</td><td>BD ארה"ב (ניו ג'רזי)</td><td></td><td></td></tr>309659 <tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>Corning Incorporated (ניו יורק, ארה"ב)</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>ליפופרוטאין חיידקי Pam3CSK4 (0.5 מ"ג/מ"ל)</td><td>InvivoGen (סן דייגו, ארה"ב)</td><td>TLRL-pm25</td><td></td></tr><tr><td>פולייונוסין&ndash; חומצה פוליציטידילית (Poly(I:C)) (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>InvivoGen (סן דייגו, ארה"ב)</td><td>TLRL-PIC</td><td></td></tr><tr><td>LPS מ-Escherichia coli 055:B5 (100 ננוגרם/מ"ל)</td><td>InvivoGen (סן דייגו, ארה"ב)</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>פלאגלין מטוהר מסלמונלה טיפימוריום (100 ננוגרם/מ"ל)</td><td>InvivoGen (סן דייגו, ארה"ב)</td><td>TLR-FLIC-10</td><td></td></tr><tr><td>ליפופרוטאין סינתטי FSL1 (100 ננוגרם/מ"ל)</td><td>InvivoGen (סן דייגו, ארה"ב)</td><td>TLR-FSL</td><td></td></tr><tr><td>ssRNA שמקורו ב-HIV-1 ssRNA40 (1 &mu; גרם/מ"ל)</td><td>InvivoGen (סן דייגו, ארה"ב)</td><td>TLR-LRNA-40</td><td></td></tr><tr><td>סוג B CpG ODN1826 אוליגונוקלאוטיד (1 &mu; M)</td><td>InvivoGen (סן דייגו, ארה"ב)</td><td>11B16-MM</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen, (ברלינגטון, אונטריו, קנדה)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 20 גרם ו-23 גרם</td><td>BD ארה"ב (ניו ג'רזי)</td><td></td><td></td></tr>305175 <tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים המונחים על קרח</td><td>Sarstedt (ניוטון, MA, ארה"ב)</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזיס של תאי דם אדומים</td><td>סיגמא-אולדריץ', (סנט לואיס, מיזורי)</td> <td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>מקוררת</tr><tr><td>המוציטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80 נוגדן</td><td>BIO-RAD (קליפורניה, ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr>MCA497APC <tr><td>נוגדנים CD16/CD32</td><td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר</td> <td>זרימהCoulter Epics Elite counter, קולטר, (היאליה, פלורידה, ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל שפופרות אפנדורף</td><td>Axygen Scietific (קליפורניה, ארה"ב)</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר סיינטיפיק (ON, קנדה)</td><td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>JT Baker (PA, ארה"ב)</td><td>70566</td><td></td></tr><tr><td>75% אתנול (במים שטופלו ב-DEPC)</td><td>אלכוהולים מסחריים (QC, קנדה)</td><td>17394</td><td></td></tr><tr><td>0.01% דיאתיל פירוקרבונט (DEPC) מים מטופלים (נותנים לעמוד לילה ואוטוקלאב)</td><td>סיגמא-אולדריץ', (סנט לואיס, מיזורי)</td><td>216.542.8</td><td></td></tr><tr><td>מערכת RT-PCR Omniscript</td><td>Qiagen, (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה)</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>רוטור גן 3000</td><td>מונטריאול ביוטק, (קירקלנד, QC, קנדה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכות QuantiTect SYBR Green I PCR</td><td>Qiagen, (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה)204141</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של הצפק murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

במהלך זיהום ודלקת, מונוציטים במחזור לעזוב את זרם הדם ונודדים לרקמות, שבו הם להתמיין מקרופאגים. המקרופאגים לבטא קולטנים משטח-כמו אגרה (TLRs), אשר מזהים דפוסים מולקולריים נשמרים באמצעות אבולוציה במגוון רחב של מיקרואורגניזמים. TLRs לשחק תפקיד מרכזי בהפעלת מקרופאג אשר בדרך כלל משויכת לשינוי ביטוי גנים. המקרופאגים הם קריטיים במחלות רבות וצמחו כיעדים אטרקטיביים לטיפול. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים הליך לבודד מקרופאגים הצפק עכברי באמצעות מדיום thioglycollate של ברואר. האחרון יהיה להגביר את הגירת מונוציטים לצפק, בהתאם זה יעלה תשואת מקרופאג ידי פי 10. מספר מחקרים בוצעו באמצעות מח עצם, טחול או מקרופאגים הצפק נגזר. עם זאת, מקרופאגים הצפק הוצגו להיות בוגר יותר על בידוד ויציב יותר בהם תפקודיity ופנוטיפ. לפיכך, מקרופאגים מבודדים מחלל הצפק עכברי להציג אוכלוסיית תא חשובה שיכול לשמש במחקרים חיסוניים וחילוף חומרים שונים. ברגע בודד, מקרופאגים היו מגורה עם ligands TLR שונה וכתוצאה מכך ביטוי גנים הוערך.

אנו מאופיינים ראשון מקרופאגים הצפק עכברי המבודדים על ידי cytometry זרימה. לשם כך, השתמשנו (F4 80 /) נוגדנים שבמיוחד להכיר סמנים לידי ביטוי רק על ידי מקרופאגים. אפיון זה נדרש כדי לקבוע את אחוז מקרופאג המבודד וכדי להבדיל ביניהם בין תאים המתקבלים בתהליך הבידוד. כפי שניתן לראות ב( איור 1), אחוז התאים המבטא את האנטיגן F4 / 80 נמצא באופן עקבי להיות מעל 95%. בשלב הבא, ללמוד ביטוי גנים במקרופאגים, טופלו התאים המבודדים עם כמה ligands TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) וF...

אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט לבידוד מקרופאגים צפקיים של עכברים. לאחר הליך זה מיצוי RNA לביצוע ניתוח ביטוי גנים על גירוי קולטנים דמויי טול.

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד מקרופגים פריטוניאליים של עכבר ולבצע אנליזה של ביטוי גנים בעקבות גירוי של קולטנים דמויי טול (toll-like receptors). דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת 3.8% של מצע גליקוגן של שמרים (brewer thi glyco medium) לחלל הפריטונאום של העכבר כדי להגביר את נדירת המונוציטים אל הפריטונאום ובכך להגדיל את תנובת המקרופגים. לאחר שלושה ימים, יש להקריב את העכבר ולהזריק PBS (phosphate buffer saline) קר לחלל הפריטונאום כדי לאסוף את התאים.לאחר עיסוי עדין של חלל הפריטוניום, נוזל הפריטוניום נשאב בזהירות. לאחר מכן, התאים שהתקבלו מרובעים, והמקרופאגים הפריטוניים שגויסו מאופיינים באמצעות ציטומטריה של זרימה. השלב הסופי הוא גירוי מקרופאגים אלה באמצעות ליגנדים שונים של קולטנים דמויי טול (toll-like receptor או TLR) ובידוד ה-RNA מהדגימות.בסופו של דבר, נעשה שימוש בתגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותית (quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction) כדי למדוד את הביטוי של הגן הנחקר. מטרתה של הפרוצדורה הבאה היא לבודד מקרופאגים פריטוניאליים באמצעות מצע TIO glycol של brewer. מצע זה יגביר את נדירת המונוציטים אל תוך הפריטוניאום ובכך יעלה את תנובת המקרופאגים.לאחר הבידוד, המקרופאגים יגרנו בעזרת ליגנדים שונים של קולטנים דמויי טול (Toll-like receptor) כדי לחקור את הוויסות המולקולרי של hepcidin כגן הנבדק. ראשית, הכינו מצע 3.8% brewer's bio glyco eight כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, באמצעות מזרקים של 1 mL המחוברים למחטים במידה 23G. מזריקו 1 mL של מצע 3.8% brewer's bio glycol eight לחלל הפריטונאום של כל עכבר, והמתינו שלושה ימים.השתמשו במזרק ובמחט חדשים עבור כל עכבר לאחר הרדמה והטלה במישור (euthanasia) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, והספיגו את בטנו של כל עכבר ב-70% ethanol. בצעו חתך צידי לאורך קו האמצע התחתון של הפריטונאום באמצעות מספריים. השתמשו בפינצטה כדי למשוך לאחור את עור הבטן ולחשוף את עור הפריטונאום השקוף.לאחר מכן, הזרקו חמישה מיליליטר של phosphate buffered saline קר של ECCOs לחלל הפריטונאום של כל עכבר, באמצעות מזרקים של חמישה מיליליטר עם מחטים בכיסוי 20 gauge. בצעו עיסוי עדין של חלל הפריטונאום ואז שאבו את הנוזל בזהירות, ללא דקירה של אף איבר. הסירו את המחט והעבירו את נוזל הפריטונאום למבחנות צנטריפוגה קוניות של 50 מיליליטר.בשלב הבא, סנטריפוגו את נוזל הפריטונאום שנאסף למשך 10 דקות ב-400 ×g או 1500 RPM בסנטריפוגה מקוררת; יש לשמור על התאים בקור לאורך כל הפרוצדורה. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלהו מחדש את משקע התאים במצע RPMI 1640. בעזרת המוסימטר (hemocytometer), ספרו את התאים והתאימו את הדגימות לצפיפות של 1 מיליון תאים למיליליטר.אפיין את הפנוטיפ של התאים המבודדים באמצעות ציטומטריה זרימתית כדי לאשר העשרה של מקרופאגים. השתמש ב-1 million תאים עבור כל עכבר ובנוגדנים נגד F4/80, שהוא אנטיגן שטח המבוטא ישירות על מקרופאגים. לאחר הבידוד, הוסף 1 million תאים לכל באר בלוח שש-בארים.פלטת בארות. השאיר את המקרופאגים הפריטוניאליים של העכבר להיקשר לבארות על ידי תרבית במשך שעה עד שעתיים ב-37 °C. לאחר הדגירה, הסר תאים שאינם קשוריים על ידי שטיפה עדינה של שלוש פעמים ב-phosphate buffered saline חמים.לאחר מכן, הוסיפו לתאים 900 µL של DMEM ללא סרום. הכינו תמיסות מלאי בריכוז 10x עבור כל קולטן דמוי-טול (toll-like receptor) או ליגנד TLR, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL מתמיסות המלאי לכל באר, ובכך בצעו תרבית בדילול של פי עשרה.את התאים למשך 24 שעות בנוכחות הליגנדים של TLR. לביצוע בידוד ה-RNA, ראשית יש להסיר את כל המצע ולבצע ליסיס לתאים ישירות בתוך פלטות ששת הבארים, על ידי הוספת מילוליטר אחד של ריאגנט TRIzol לכל באר והעברה של הליסאט התאי מספר פעמים באמצעות פיפטה.לאחר מכן, דגרו את הדגימות ההומוגניזיות במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר דיסוציאציה מלאה של קומפלקסי חלבוני הגרעין. לאחר הדגירה, העבירו את הליזט למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עבור RNA ו-DNA, והוסיפו 0.2 מיליליטר של כלורופורם לכל מיליליטר של ריאגנט TRIzol. נערו את המבחנות בעוצמה באופן ידני במשך 15 שניות לפני הדגרתן בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות.לאחר מכן, סנטריפוגו ב-12,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. צפו בהפרדת התערובת לשכבת פנול-כלורופורם אדומה תחתונה, שכבה בינונית ושכבה מימית עליונה חסרת צבע. ה-RNA נשאר אך ורק בשכבה המימית.העבירו בזהירות את השכבה המימית העליונה למבחנה נקייה מבלי להפריע לשכבת הביניים. השקיעו את ה-RNA ממנה על ידי ערבוב עם 0.5 milliliters של isopropyl alcohol לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צנטריפוגו במהירות של 12,000 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.ה-RNA שוקע ויוצר משקע לבן בדפנות ובתחתית המבחנה. הסירו את הנוזל העליון ושטפו את משקע ה-RNA פעם אחת עם 1 mL של ethanol 75%.לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), ייבשו את ה-RNA באוויר למשך 10 דקות. לאחר מכן, המיסו את ה-RNA ב-100 µL של מים נקיים מ-RNA והדגרימו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 55 °C. לאחר מכן, קבעו את כמות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.יש לדלל את הדגימות פי 100 במים נטולי RNA ולבצע קריאה באורכי גל של 260 ננומטר כדי להשוות את ריכוזי ה-RNA, ולאחר מכן לסנתז cDNA לפי הוראות היצרן, תוך שימוש בערכה לסנתז הגדיל הראשון של ה-cDNA במערכת R-T-P-C-R. לאחר מכן, יש למדוד את רמות ה-Mr.NA של הגן באמצעות real-time PCR במערכת לגילוי DNA בזמן אמת, תוך נרמול של רמות ביטוי הגנים באמצעות שני גנים של בית (housekeeping genes).המקרופאגים הפריטוניאליים המבודדים אופיינו באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את אחוז המקרופאגים המבודדים ולהבדיל ביניהם לבין תאים שהושגו במהלך תהליך הבידוד. נמצא באופן עקבי כי אחוז התאים המבטאים את האנטיגן F4/80 היה מעל 95%. התאים המבודדים טופלו לאחר מכן במספר ליגנדים של TLR וב-mRNA. רמות ההפסידין נמדדו באמצעות RT-PCR בתגובה ל-Toll-like receptor 1 ו-2, וכן Toll-like receptor 4.קולטן חולי שש ושני ליגנדים היו מסוגלים להמריץ את ה-mRNA של הפסידין (hepcidin) במקפגים משקפים. יחד, תוצאות אלו מדגימות את התועלת של פרוטוקול זה לבידוד מוצלח של מקפגים פריטונאליים משקפים ולחקירה מדויקת של הוויסות המולקולרי של ביטוי גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הבידוד, הזיהוי והגידול של מקפגים פריטונאליים משקפים.

isolation-murine-peritoneal-macrophages-to-carry-out-gene-expression

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

חלל הצפק ביונקים מכילה אוכלוסיות תאים שונות החיסונית חיוני תגובות חיסוניות מולדות. שיטת בידוד יעיל נדרש ניתוח ביוכימי ותפקודי של תאים אלה. כאן אנו מספקים שיטה מקיפה עבור בידוד של תאים חלל הצפק בתוך העכבר.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

סרטון זה מדגים את ההפעלה של מקרופאגים פריטוניאליים של עכבר באמצעות אימונוגלובולין תוך ורידי וליפופוליסכריד חיידקי. הגירוי המשותף מפעיל את המקרופאגים הצפקיים למקרופאגים אנטי דלקתיים בעלי פעילות ויסות חיסוני.

הפעלת In Vivo של מקרופאגים פריטוניאליים בתגובה לנוגדנים במודל מורין

סרטון זה מדגים הליך לניתוח אפרוציטוזה בתיווך מקרופאגים פריטוניאליים של תימוציטים של עכבר אפופטוטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ניתוח של efferocytosis של thymocytes אפופטוטי על ידי מקרופאגים פריטוניאליים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות להעברה יעילה של קווי תאי מקרופאגים של עכברים עם siRNAs באמצעות מערכת המעבורת Amaxa Nucleofector 96-well, לעורר את המקרופאגים עם ליפופוליסכריד ולנטר את ההשפעות על ייצור ציטוקינים דלקתיים.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

מקרופאגים הם תאי פלסטיק של מערכת hematopoietic כי יש תפקיד מכריע בחסינות מגן הומיאוסטזיס. בדו"ח זה, אנו מתארים אופטימיזציה של טכניקות חוץ גופית כדי phenotypically ופונקציונלית לאפיין להשתלשלים מסתננים מקרופאגים תקינה המצטברים באיבר המושתל בתנאים סובלני.

אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות

נוגדן מבוססי תרופות מהפכה לטיפול במחלות דלקתיות. בנוסף יש השפעה ישירה על מטרות מוגדרות, נוגדנים ניתן להפעיל מקרופאגים להיות אנטי דלקתיות. פרוטוקול זה מתאר איך אנטי דלקתיות מקרופאג ההפעלה יכולה להיות המוערך במבחנה, באמצעות העכבר מח עצם, מאקרופאגים ויוו, באמצעות מקרופאגים הצפק.

הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר תפקוד גנים במקרופאגים שוכנים ברקמת הצפק in vivo, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

למד לבודד מקרופאגים פריטונאיים ממקור מוריני לניתוח ביטוי גנים בעקבות גירוי TLR. הפרוטוקול משתמש בתיוגליקולט ברואר להגברת תנועת מונוציטים וזרימה ציטומטריה לאפיון התאים.

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

גלה סרטונים נוספים