ניתוח הפונקציות של תאי פיטום ב Vivo באמצעות 'תא התורן לדפוק ב' עכברים
27 במאי 2015
אנו מתארים שיטה ליצירת תאי פיטום שמקורם במבחנה, חריטה שלהם לעכברים חסרי תאים תורניים, וניתוח של פנוטיפ, מספרים והפצה של תאי פיטום חרוטים באתרים אנטומיים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציות של תאי פיטום ב vivo.
המטרה הכללית של השיטה הבאה היא לנתח את תפקודי התאי המסטים in vivo באמצעות עכברים עם נוק-אין (knockin) של תאי מסטים. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת תאי מסטים מתורגליים המופקים ממוח עצם, או BMC MCs, או על ידי השתלה בעכברים עם חסר בתאי מסטים. בשלב השני, ה-BMC MCs מועברים באופן אדופטיבי לאתרים אנטומיים שונים בעכברים עם החסר בתאי המסטים כדי ליצור עכברים עם נוק-אין של תאי מסטים.
בסופו של דבר, מספרם וההפצה האנטומית של תאי המסט שהועברו באופן אדופטיבי מוערכים באמצעות ציטומטריה של זרימה ואנליזה אימונוהיסטוכימית, כדי לבחון באיזו מידה האוכלוסיות שהשתבצו דומות לאלו הנמצאות בעכברי סוג פרא (wild type). היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה ישירה של תפקודי אוכלוסיות תאי המסט מסוג פרא או תאים שעברו שינוי גנטי שהשתבצעו in vivo. לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי המסט, כגון באיזו מידה תאי המסט או תוצריהם יכולים לתרום למאפיינים של מודלים של עכברים בתהליכים פיזיולוגיים, אימונולוגיים או פתולוגיים, כולל מודלים של מחלות אנוש.
בדרך כלל, אנשים הלומדים שיטה זו עשויים להיתקל בקשיים מכיוון שמידת השבת התאים (engraftment) והמחסור בתאי מאסט יכולים להשתנות בהתאם לשיטה המשמשת ליצירת BM CMCs, לאתר ההזרקה, למספר ה-BMC MCs שהוזרקו ולמספר השבועות שממתינים לאחר השבת התאים לפני ביצוע ניסויי in vivo. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהיבטים של הליך השבת התאים קשים ללמידה אלא אם כן רואים בדיוק כיצד הם מבוצעים. כדי להוציא תחילה את מחולל הגג (bone marrow), השתמשו בכלי ניתוח סטריליים כדי להוציא את ה-femur, ה-tibia וה-fibula מעכברים מסוג wild type, מבלי לפגוע באפפיזות של העצמות.
במהלך נתיחתו של כל עצם, אחזו בה בעזרת פינצטה וגרדו את כל הרקמות העודפות. לאחר מכן, הניחו את העצם ב-PBS על קרח. כאשר כל העצמות נאספו, העבירו אותן למנדף סטרילי לתרביות רקמה, ולאחר מכן, אחת אחת, אחזו בכל עצם בעזרת פינצטה וחתכו את שני האפיפיזות (epiphyses) כדי לחשוף את חללי המוח (medullary cavities). בשלב הבא, באמצעות מזרקים של 3 mL, המצוידים במחטים בכיול 30 gauge ובשטיפה של מצע קר, שטפו את כל המוח האדום מכל עצם אל תוך צלחת פטרי חדשה. לאחר שכל העצמות שטופו, השתמשו באותו מזרק כדי להפריד את מקבצי תאי מח העצם באמצעות שאיבה ופליטה עדינה חוזרת.
לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר. מלאו את המבחנה בתהליל שטיפה קר וצנטריפוגו את התאים. השעיו את משקע התאים ב-10 מיליליטר של תווך תרבית.
לאחר מכן, העבירו את תאי מחולקת הגב (bone marrow) לבקבוק תרבית רקמה בגודל מתאים. לאחר יום עד יומיים של תרבית, העבירו את התאים שאינם נצמדים לבקבוק חדש יחד עם 10 milliliters של מצע תרבית טרי לכל עכבר במהלך השבועות הבאים. האכילו את התאים כל שלושה עד ארבעה ימים כפי שהודגם.
העבר את התאים שאינם נצמדים לבקבוק חדש פעם בשבוע, עד שלא יישארו תאים נצמדים, לצורך השתלה תוך-עורית בתוך ה-ear pinner Resus. השהה את ה-BMC MCs בריכוז של ארבעה כפול 10 ל raised 7 תאים ל-milliliter ב-DMEM קר. לאחר מכן, שאב את התאים למזרק של 1 milliliter המצויד במחט gauge 30 והנח את המזרק על קרח.
בשלב הבא, ודאו את עומק ההרדמה המתאים באמצעות צביטה בחלק העליון של עכבר מקבל בן ארבעה עד שישה שבועות עם חסר בתאי מאסט, ומרחו משחה לעיניים לפני הזרקת התאים. השתמשו באצבע המורה כדי לחשוף ולמתוח את הפאה הוונטרלית של סחוס האוזן, תוך הפעלת לחץ אנכי על הפאה הדורסלית של האוזן. לאחר מכן, בצעו הזרקה תוך-עורית של 25 µL המכילה 1×10⁶ BMC MCs למרכז האוזן, והזרקה שנייה של 25 µL מאותו תמיסה לכיוון קצה הסחוס.
עבור השתלה תוך-פריטונית, השביו את ה-BMC MCs בריכוז של 1*10⁷ תאים למיליליטר ב-DMEM קר. לאחר מכן, השתמשו במזרק של 1 מיליליטר המצויד במחט Gauge 25 כדי להזריק 2*10⁶ BM CMCs ב-200 µL של מצע אל תוך החלל הפריטוני של מקבלי התאים הנחסרים בתאי מאסט. להשתלה תוך-ורידית, השביו את ה-BM CMCs בריכוז של 2.5*10⁷ תאים למיליליטר ב-DMEM קר, ולאחר מכן הזריקו 5*10⁶ BMC MCs ב-200 µL של מצע דרך וריד הזנב.
ארבע עד שש שבועות לאחר השתלה תוך-peritoneum, השתמש במזרק של 5 mL המצויד במחט gauge 25 כדי להזריק 5 mL של PBS קר לחלל ה-peritoneum של החיה המקבלת. עסה את הבטן במשך 20 שניות כדי לאסוף את תאי ה-peritoneum. לאחר מכן, השתמש במזרק של 5 mL המצויד במחט gauge 22 כדי לשאוב באיטיות את נוזל השטיפה מה-peritoneum.
ניתן להעריך את אחוז התאי המסטים ואת מספר התאים הכולל בנוזל השטיפה הפריטוניאלית באמצעות ציטומטריה של זרימה או היסטוכימיה. כדי להעריך את התאי המסטים בחלונות מסנטריים, חתכו את הקרומי הפריטוניאלי כדי לחשוף את מערכת העיכול. סדרו ארבעה עד חמישה חלונות מסנטריים לכל עכבר על גבי סלייד, ולאחר מכן בצעו קיבוע למשך שעה אחת בתמיסת car noise.
החזירו לטמפרטורת החדר בסוף הדגירה, ייבשו את השקופיות באוויר והסִירו את המעי. חלונות הגריד המקובעים יישארו צמודים לשקופיות. לבסוף, צבעו את התכשירים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם תמיסת צביעה chaba המייצגת ניתוח ציטומטרי זרימתי, וצביעת odine blue של BM CMCs לאחר 1, 15 ו-45 ימי תרבית ב-DMEM, בתוספת IL three מוצגים. BM CMCs שגודלו למשך 45 ימים הם בטוהר של 95% ומכילים מספר רב של גרנולות ציטופלזמיות.
לפיכך, תאים מתרבויות אלו מתאימים לניסויי השתלה, בעוד שתאים שגודלו במשך 15 ימים אינם כאלה בתמונות אלו. כפי שצפוי, מוצגת השתלה מוצלחת באוזן ארבעה שבועות לאחר השתלה תוך-עורית, בחלונות מסנטריים, בחלל הפריטונאום שישה שבועות לאחר השתלה תוך-פריטונאלית ובריאה 12 שבועות לאחר השתלה תוך-ורידית. תאי מאסט נמצאים בדגימות הרקמה שבודדו מעכברי wild type, בעוד ששום תא מאסט לא זוהה בבעלי החיים החסרים תאי מאסט ובעכברי המאסט knockin.
עם זאת, תאי ה-MC מה-BMC שהועברו באימוץ מופיעים במיקומים דומים לאלו שנצפו בבעלי החיים מסוג הבר (wild type). בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ההפסק בין השתלת התאים לבחינת הניסוי תשתנה בהתאם לאתר הזרקת התאים התורניים. חשוב מאוד להקפיד על מרווחי זמן אלו כדי לאפשר זמן מספיק לתאים המשתלים להבשיל ולהגיע למיקומם הסופי in vivo.
גישה זו סיפקה וממשיכה לספק מידע חשוב לגבי מה שתאי מסה והתוצרים שלהם יכולים או אינם יכולים לעשות in vivo. אנא זכרו תמיד שעבודה עם בעלי חיים חיים דורשת הכשרה ספציפית, סקירה ואישור מתאימים של פרוטוקולי הניסויים והקפדה קפדנית על הסטנדרטים הגבוהים ביותר של טיפול בבעלי חיים, כולל נקיטת אמצעים להפחתת הכאב והסטרס של בעל החיים בעת ביצוע הליכים אלו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להפקת תאי מאסט המגודלים במעבדה (in vitro) והשתלתם בעכברים החסרים תאי מאסט. המחקר מתמקד בניתוח הפנוטיפ, המספרים וההתפלגות של תאי מאסט מושתלים אלו באתרים אנטומיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של תאי מאסט
רקע
- תאי מאסט ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- הבנת תפקודי התאים התופים (mast cells) במודלים חיים (in vivo) חיונית לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.
- שיטה זו מאפשרת להעריך את תרומתם של תאי מאסט במודלים של עכברים.
- ניתן לנתח תאי מאסט שהשתבצו כדי לבחון את דמיותם לאוכלוסיות מסוג בר.
מטרת המחקר
- לניתוח תפקודי התאים המסטים in vivo.
- ליצירת עכברי knockin של תאים מסטים לצורך הערכה תפקודית.
- להערכת ההשפעה של תאים מסטים על תהליכים פיזיולוגיים ואימונולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפקה של תאי מאסט מתורבתים המופקים ממחית העצם (BMC MCs).
- העברה אדופטיבית של BMC MCs לעכברים חסרי תאי מאסט.
- הערכה של תאי מאסט שהשתבצו באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- ניתוח אימונוהיסטוכימי להערכת ההפצה והפנוטיפ.
תוצאות עיקריות
- השתרה מוצלחת של תאי מאסט (MCs) המופקים מ-BMC לאתרים אנטומיים שונים.
- ציטומטריה של זרימה אישרה את נוכחותם והפצתו של תאי המאסט.
- האוכלוסיות המשתרות הראו דמיון לתאי מאסט מסוג בר (wild type).
- השיטה מספקת תובנות לגבי תפקודי תאי מאסט in vivo.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת הערכה ישירה של תפקודי התאים התופים (mast cells).
- היא יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של התאים התופים.
- הממצאים עשויים לתרום להבנת מודלים של מחלות בבני אדם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל עכבר ה-knock-in לתאי מאסט מאפשר ניתוח תפקודי ישיר in vivo של תאי מאסט ותוצריהם, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרי אימונולוגיה ודלקת. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי עבור תיקוף מטרות ובדיקה של מסלולים ביולוגיים, המנחים החלטות בשלבים מוקדמים של תיקי פיתוח בתוכניות למחלות ממקור חיסוני. יכולתו לשחזר פנוטיפים של תאי מאסט ספציפיים לרקמה משפרת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תרומתם של תאי מאסט לתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים in vivo.
- תומך בתיקוף תפקודי של אוכלוסיות תאי מאסט מהסוג הפראי (wild-type) או כאלו שעברו מודיפיקציה גנטית.
- מבהיר את התפקיד המכניסטי של תאי מאסט במודלים רלוונטיים למחלה.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים עבור מטרות במסלולי מערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות in vivo מתוקשפות עבור בדיקות אימונולוגיות המשך.
- מאפשר השתרה (engraftment) ושכימות הניתנות לשחזור וכימות של אוכלוסיות תאי מאסט ברחבי רקמות שונות.
- תומך בסטנדרטיזציה של פרוטוקולים להעברת תאים ולניתוח לצורך פיתוח בדיקות.
- מספק תוצרים כמותיים באמצעות ציטומטריה של זרימה והיסטוכימיה לצורך מוכנות לסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם את תפקוד התאים המאסטים in vivo עם מיקרו-סביבות רקמה הרלוונטיות למחלה.
- מאפשר הערכה של תוצרים המופקים מתאים מאסטים במודלים פרה-קליניים של מחלות אנושיות.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הבהרת תרומות ספציפיות לסוג התא.
- מספק רציפות מגילוי מכניסטי לוולידציה פרה-קלינית במחקר חיסוני.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשרת בדיקת היפותזות, הבהרת מסלולים ותיקוף תפקודי של מטרות במודלים של מחלות ממחקרים חיסוניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס עבור תפקוד תאי מאסט ומעורבות של מסלולים in vivo.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור השתרבות תאים והתפלגות ברקמות.
- אנליטיקה: מספק נתוני ציטומטריה זרימה ואימונוהיסטוכימיה לצורך ניתוח השוואתי של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים של מחלות על ידי שחזור פנוטיפים של תאי מאסט ספציפיים לרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכה פונקציונלית של תאי מאסט ווריאנטים גנטיים שלהם במספר תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי השתלה (engraftment) ואנליזה in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של תרומתם של סוגי תאים שונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומסלולים חיסוניים לצורך קידומם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי מח עצם, טיפול בבעלי חיים וטכניקות של העברת תאים in vivo.
- מחייב גישה לציוד של ציטומטריה של זרימה, היסטוכימיה ותשתיות של מתקן לבעלי חיים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי השתלה (engraftment) ולוחות זמנים לניתוח.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור אתרים אנטומיים שונים או מודלים של מחלות.
- יש לקבוע באופן אמפירי את יעילות ההשתלה ואת מרווחי הבשילה עבור כל יישום.
שאלות נפוצות בביופרמה
Chapters in this video
0:05
Title
5:30
Peritoneal Mast Cell Engraftment Analysis
8:08
Conclusion
1:59
Generation and Characterization of Bone Marrow-derived Cultured Mast Cells (BMCMCs)
3:48
Engraftment of Mast Cell-deficient Mice with BMCMCs
6:50
Results: Representative BMCMC In Vitro Culture and In Vivo Engraftment
