ניתוח הפונקציות של תאי פיטום ב Vivo באמצעות 'תא התורן לדפוק ב' עכברים

המטרה הכוללת של השיטה הבאה היא לנתח את התפקודים של תאי פיטום in vivo באמצעות עכברי נוקין של תאי פיטום. זה מושג על ידי יצירת תאי פיטום מתורבתים שמקורם במח עצם, או BMC MCs או השתלה בעכברים חסרי תאי פיטום. בשלב השני, ה-BMC MCs מועברים באופן מאומץ לאתרים אנטומיים שונים בעכברים חסרי תאי פיטום כדי ליצור עכברי נוקין של תאי פיטום.

בסופו של דבר, המספרים וההתפלגות האנטומית של תאי הפיטום המועברים באימוץ מוערכים על ידי זרימה ציטומטרית וניתוח אימונוהיסטוכימי כדי להעריך באיזו מידה האוכלוסיות המושתלות דומות לאלו שנמצאות בעכברים מסוג בר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה ישירה של התפקודים של סוג הקיר המושתל או אוכלוסיות תאי MA מהונדסים גנטית in vivo. לכן שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי MA, כגון באיזו מידה תאי MA או תוצריהם יכולים לתרום לתכונות של מודלים עכבריים של תהליכים פיזיולוגיים, אימונולוגיים או פתולוגיים, כולל מודלים של מחלות אנושיות.

בדרך כלל, אנשים הלומדים שיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהשתלת תאי פיטום ומחסור יכולים להשתנות בהתאם לשיטה המשמשת ליצירת BM CMCs, שורש ההזרקה, מספר ה-BMC MCs המוזרקים ומספר השבועות במשקל אחד לאחר ההשתלה לפני ביצוע ניסויי in vivo. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד היבטים של הליך ההשתלה אלא אם כן רואים בדיוק כיצד הם מבוצעים. כדי לחלץ תחילה את מח העצם, השתמש בכלי דיסקציה סטריליים כדי לקצור את עצם הירך, השוקה והפיבולה מעכברים מסוג בר מבלי לקלל אפיפיזה של עצם.

כאשר כל עצם מנותחת, אבטח אותה בעזרת מלקחיים וגרד את כל הרקמה החיצונית. לאחר מכן הניחו את העצם ב-PBS על קרח כאשר כל העצמות נאספו, העבירו אותן למכסה מנוע סטרילי של תרבית רקמות, ואז אחת בכל פעם, אבטחו כל עצם במלקחיים וחתכו את שתי האפיפיזות כדי לחשוף את החללים המדולריים. לאחר מכן, באמצעות שלושה מזרקים של מיליליטר, המצוידים במחטים בגודל 30 ומדיום קר שוטף, כל המח האדום מכל עצם לצלחת פטרי חדשה לאחר שכל העצמות נשטפו, השתמש באותו מזרק כדי לנתק את אשכולות תאי מח העצם על ידי שאיפה ופליטה עדינה חוזרת ונשנית.

לאחר מכן העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. מלאו את הצינור במדיום שטיפה קרה וצנטריפוגה את התאים להחייאה. השעו את גלולת התא ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית.

לאחר מכן העבירו את תאי מח העצם לבקבוק תרבית רקמה בגודל מתאים. לאחר יום עד יומיים של תרבית, העבירו את התאים שאינם נדבקים לבקבוק חדש יחד עם 10 מיליליטר של תרבית טרייה, בינונית לכל עכבר במהלך השבועות הבאים. האכלת התאים כל שלושה עד ארבעה ימים רק מודגמת.

העברת התאים שאינם נצמדים לבקבוק חדש פעם בשבוע עד שלא נותרו תאים נצמדים לחריטה תוך עורית לתוך סיכת האוזן Resus. השעו את ה-BMC MCs בארבע פעמים 10 לשבעת התאים למיליליטר ב-DMEM קר. לאחר מכן שאפו את התאים למזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 30 והניחו את המזרק על קרח.

לאחר מכן, אשר את עומק ההרדמה המתאים על ידי צביטה עליונה של עכבר נמען בן ארבעה עד שישה שבועות עם מחסור בתאי פיטום ומרח משחת עיניים כדי להזריק את התאים. השתמש באצבע המורה כדי לחשוף ולמתוח את הפנים הגחוניות של סיכת האוזן, וליצור לחץ אנכי על הפנים הגביות של האוזן. לאחר מכן יש להזריק 1 25 מיקרוליטר תוך עורי של פעם אחת פי 10 לששת ה-BMC MCs לאמצע האוזן, והזרקה שנייה של 25 מיקרוליטר לכיוון קצה הסיכה.

עבור תוך-צפק, השתלה משעה מחדש את ה-BMC MCs בפעם אחת 10 לשבעת התאים למיליליטר ב-DMEM קר. לאחר מכן השתמש במזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 25 כדי להזריק פעמיים 10 לששת ה-BM CMCs ב-200 מיקרוליטר של מדיום לחלל הצפק של הנמענים החסרים בתאי פיטום לצורך השתלה תוך ורידית. השעו מחדש את ה-BM CMCs ב-2.5 כפול 10 לשבעת התאים למיליליטר ב-DMEM קר, ולאחר מכן הזריקו חמש פעמים 10 לששת ה-BMC MCs ב-200 מיקרוליטר של מדיום דרך וריד הזנב.

ארבעה עד שישה שבועות לאחר חריטה תוך-צפקית, השתמש במזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט בגודל 25 כדי להזריק חמישה מיליליטר PBS קר לחלל הצפק של החיה המקבלת. עסו את הבטן למשך 20 שניות כדי לקצור את תאי הצפק. לאחר מכן השתמש במזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט בגודל 22 כדי לשאוב לאט את שטיפת הצפק.

לאחר מכן ניתן להעריך את אחוז תאי הפיטום ומספר התאים הכולל בנוזל שטיפת הצפק על ידי ציטומטריית זרימה או כימיה היסטו. כדי להעריך את תאי הפיטום בחלונות מזנטריים, חתכו את קרום הצפק כדי לחשוף את מערכת העיכול. סדר ארבעה עד חמישה חלונות מזנטרי לכל עכבר על שקופית ואחריה קיבוע של שעה בתמיסת רעש לרכב.

מוסיפים את טמפרטורת החדר בסוף הדגירה, מייבשים את השקופיות באוויר ומסירים את המעי. החלונות המזנטרים הקבועים יישארו מחוברים לשקופיות. לבסוף, צבעו את התכשירים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם תמיסת צביעת צ'אבה מייצגים ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה כחולה אודין של BM CMCs לאחר 15 ו-45 יום של תרבית ב-DMEM, בתוספת IL שלושה מוצגים BMCs בתרבית במשך 45 יום ו-95% טהורים ומכילים מספר גבוה של גרגירים ציטופלזמיים.

לכן, תאים מתרביות אלה מתאימים לניסויי השתלה, בעוד שתאים שגודלו במשך 15 יום אינם נמצאים בתמונות אלה. חריטה מוצלחת של פני האוזן ארבעה שבועות לאחר ההשתלה התוך-עורית, החריטה חלונות מזנטריים, חלל הצפק שישה שבועות לאחר ההשתלה התוך-צפקית והריאה 12 שבועות לאחר ההשתלה התוך-ורידית מוצגות כצפוי. תאי פיטום נמצאים בדגימות הרקמה שבודדו מעכברים מסוג בר, בעוד שלא זוהו תאי פיטום בבעלי חיים חסרי תאי פיטום בעכברי נוקין של תאי פיטום.

עם זאת, ה-BMC MCs שהועברו באימוץ מופיעים במקומות דומים לאלה שנצפו בחיות הבר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי המרווח בין ההשתלה ללימוד הניסוי ישתנה בהתאם לאתר הזרקת תאי הפיטום. חשוב מאוד לכבד מרווחים כאלה על מנת לאפשר מספיק זמן לתאים המושתלים להבשיל ולתפוס את המיקום הסופי vivo.

גישה זו סיפקה וממשיכה לספק מידע חשוב על מה שתאי מסה והמוצר שלהם יכולים לעשות או לא יכולים לעשות in vivo. אנא זכור תמיד שעבודה עם בעלי חיים דורשת הכשרה ספציפית, בדיקה ואישור מתאימים של פרוטוקולי ניסוי והקפדה על הסטנדרטים הגבוהים ביותר של טיפול בבעלי חיים, כולל הקפדה על הפחתת הכאב והלחץ של בעל החיים בעת ביצוע הליכים אלה.