Name: הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: חקור את השפעתם של כימיקלים רעילים על נדידת תאי אנדותל באמצעות מבחני נדידה שונים. למדו שיטות לניתוח דינמיקת תאים ומנגנוני פגיעה במיטוכונדריה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה הגרמני (מענק מס' M-SAB1-6-A009).

הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות לחקירה של נדידת תאי אנדותל המוקדמת. הטיפוח הנכון של תאי האנדותל של כלי דם דורש מראש ציפוי של צלוחיות תרבית תאים עם ג&#39;לטין כדי להבטיח שגשוג ותחזוקה נאותים של פנוטיפ האנדותל. 1. טרום ציפוי של צלוחיות תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים ג&#39;לטין ב 0.1 M PBS לריכוז סופי של 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי הפתרון עם פרמטרים למעוקר נוזלי (לפרטים ראו הוראות של החיטוי הספציפי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נפח מספיק של פתרון ג&#39;לטין autoclaved לבקבוק תרבות תא סטרילי (למשל, לפחות 5 מיליליטר לבקבוק תרבית תאי T25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלוחיות לחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אינו נדרש אבל לא מפריע) לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון ג&#39;לטין שנותר. השתמש בצלוחיות מצופים מראש לאחר מכן (ראה טיפוח תא) או שלקרע בתנאים סטריליים עד לשימוש. </li></ol> 2. טיפוח תא של תאי האנדותל מוקדמים הערה: תאי האנדותל מוקדמים בתאי גזע עובריים נגזרים (EEC) התקבלו מגופי embryoid עכברי מובחנים על ידי מיון תא מופעל מגנטי של שבריר התא החיובי PECAM-1 כמתואר לעיל 10,11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות EEC על תרבות מנות תא ג&#39;לטין המצופה DMEM בתוספת 15% FCS, 50 U / פניצילין מיליליטר, 50 U / ml סטרפטומיצין, L-גלוטמין 200 מיקרומטר, SS-mercaptoethanol 100 מיקרומטר ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות. לטפל בתאים בתנאים סטריליים. לטפח את התאים עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס ולחות של 95% עד תת-מפגש (מקסימום. 80%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתת-מפגש, לפצל את התאים ביחס של 1: 5. הערה: הפלוגה של תאי האנדותל היא שלב קריטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התאים עם Accutase RT. הסר את המדיה, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של Accutase 25 סנטימטר ל <sup&gt; 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבקבוק ב RT עבור 2-10 דקות, עד שהתאים מנותקים. לפזר את התאים ולהעביר אותם ליישום הרצוי. הערה: נטרול כימי של Accutase אינו נדרש כפי שהוא מתרחש כאשר תאי זרע מאוחסנים בחממה על 37 מעלות צלזיוס. עם זאת, Accutase פעילות יכולה גם להיות ירידה על ידי הוספת DMEM FCS המכיל. </li></ol></li></ol> 3. וידן קאמרית הערה: מבחני קאמריים בוידן מבוצעים על ידי השימוש במערכות הכנס terephthalate פוליאתילן אור-אטומה עם גודל נקבובית 8 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל מוסיף מסנן (נכון שבתוך בארות תרבית תאים ובכך ליצור חדר וידן) על ידי הוספת 500 μl של ג&#39;לטין 0.1% מומס ב0.1 M PBS לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תאים הם להיחשף לחומרים כימיים רעילים, לחשוף על פי תכנון הניסוי הספציפי לפני קצירת תא. הערה: תאים נחשפו ל12.5 מיקרוגרם כלוראמבוציל / מיליליטר DMEMלמשך 24 שעות. בכל קשור לתכנון הניסוי הספציפי, הוראות עשויות להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר EEC ולקבוע את המספר הסלולרי באמצעות תא תא ספירה. הערה: ניתן להשתמש במכשירי ספירה אוטומטיים, אך יש להשתמש בזהירות: ספירת תאים במדריך היא מדויקת יותר ומומלצת מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 בינוני תרבית תאי μl לתוך תא התא התחתון של לשכת וידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בדיוק 10 4 EEC ב 500 בינוני תרבית תאי μl להוספת מסנן בתא התא העליון. לחסל את הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מוסיף מסנן בחממה במשך 8 שעות בדיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS אחת ולהחליף בינוניים עם paraformaldehyde 0.5 מיליליטר 4% בשני התאים במשך 25 דקות לקיבוע תא. שטוף את המסנן בהרחבה אבל לפחות 3 פעמים עם 0.1 M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הקרומים עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הקרום בין שני תלושי כיסוי זכוכית עם הרכבה בינונית מכילים DAPI לstainin הגרעיניז. שים לב לנטייה. ודא כי תאים רק שהגרו לכיוון צד התא התחתון של הקרום נספרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים שהגרו לכיוון צד התא התחתון של הקרום עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 400X. אל תבלבלו את הנקבוביות קרום עם תאים נדדו (איור 1 א, 1 ב &#39;). לחקור מספר סביר של חזרות ביולוגיות (לפחות 3 משכפל ביולוגי למצב). </li></ol> 4. ריפוי פצע Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לציוד זמין, לבחור בקפידה את מנות תרבית תאים או צלחות: בעת השימוש במיקרוסקופ דסק&quot;ש, להימנע ממאכלים המבוססת תרבות משטח פלסטיק או צלחות טובות, אבל להשתמש במכשירים מבוססים זכוכית במקום. הערה: אם באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד, יכולות לשמש גם צלחות פלסטיק מבוססת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח EEC במכשיר תרבית תאים מתאים (למשל, צלחת פטרי 4 סנטימטר זכוכית תחתונה מתאים להדמיה תא חי) עד מפגש 80%. חשוב: לא לטפח את התאים כדי להשלים מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את monolayers עם 10 טיפים פיפטה μl סטרילי. דחף את הקצה בעדינות בלי יותר מדי לחץ על פני השטח הצלחת ולהעביר אותו בקו ישר בצורה חלקה מצד אחד לother.Wash התאים פעמיים עם 0.1 M PBS להסיר תאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מספק של מדיום למנה התרבות. במידת צורך, להוסיף תרכובות שיש לחקור. הערה: 1.5 מיליליטר בינוני מכיל 15 ng / ml אלפא חומצה לינולנית נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ מסוגל הדמיה תא חי. ודא 5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס ואווירת humidified. הערה: לחות חשוב במיוחד כדי למנוע אידוי בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות זמן לשגות מעל 24 שעות ב 10 דקות במרווחים. תכנית לגדלי קבצים גדולים. הערה: רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים היא בדרך כלל מספיק; עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בתמונות של לפחות 1,024 x 1,024. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את רוחב הפער בזמן t = 0 שעה ובזמן t = 24 שעות באמצעות כלי האורך של התוכנה המסופק עם מיקרוסקופ או להשתמש בתוכנת קוד פתוח (לדוגמא, ImageJ). הערה: בתוכנת רכישת תמונה וניתוח ספציפית כללית מסופק על ידי היצרן. לכן, לפרטים טכניים בנוגע לשימוש בתוכנה, עיינו במדריך. </li></ol> מעקב 5. סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לציוד זמין, לבחור בקפידה את מנות תרבית תאים או צלחות: בעת השימוש במיקרוסקופ דסק&quot;ש, להימנע ממאכלים המבוססת תרבות משטח פלסטיק או צלחות טובות, אבל להשתמש במכשירים מבוססים זכוכית במקום. הערה: אם באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד, יכולות לשמש גם צלחות פלסטיק מבוססת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 5 x 10 4 EEC DMEM בתוספת במכשיר תרבית תאים מתאים (למשל, צלחת 24 multiwell) ולטפח את התאים עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 95 במשך 1-2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים גדלו עד 80מפגש%, להסיר את המדיה ותרבות התאים עם המדיה חדשה בנוכחות חומרי הבדיקה המתאימות (למשל, 12.5 מיקרוגרם כלוראמבוציל / מיליליטר DMEM). תמיד כוללים תאי שליטה (שטופלו בממס, למשל, אתנול) על 37 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן מסוים (24 שעות, בהתאם למערכת assay הבודד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ מסוגל הדמיה לחיות תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולחות של 95%). לרכוש תמונות זמן לשגות מעל 24 שעות במרווחים מוגדרים מראש. לרכוש תמונות במרווחים של 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע באופן ידני מעקב של השוק האירופי המשותף על ידי השימוש בתוסף ImageJ MTrackJ. בחר 10 תאים באופן אקראי משדה הראייה ולעקוב אחר תנועותיהם על ידי הוספת נקודה לכל נקודת נתונים בזמן באמצעות &quot;הוסף&quot; הפקודה של MTrackJ. </li></ol> הערה: MTrackJ זמין בחינם ובImageJ הוא availab [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le ב[ Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. במדריך מפורט על תוסף MTrackJ זמין ב&quot; http://www.imagescience.org &quot;. 6. הדמיה של תא חי / הערכה של מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח EEC במכשיר תרבית תאים מתאים (למשל, 4 סנטימטר צלחת זכוכית תחתונה פטרי מתאימה להדמיה תא חי) עד מפגש 80%. חשוב: אל לטפח את התאים כדי להשלים מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לחשוף את התאים לכימיקלים. הערה: תאים נחשפו לכלוראמבוציל / מיליליטר 12.5 מיקרוגרם למשך 24 שעות. בכל קשור לתכנון הניסוי הספציפי, הוראות עשויות להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 10 מ&quot;מ מניות של tetramethylrhodamine (TMRM) בDMSO. להגן מפני אור. הערה: פתרון המניות ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון המניות במדיום תרבית תאים לפתרון עובד עם ריכוז של 10 מיקרומטר (1: 1,000 דילול). להגן מפני אורולהשתמש בהקדם האפשרי. הערה: הפתרון עובד יכול להיות כל הזמן בRT לכמה זמן (HR&gt; 1), לעומת זאת, הכנה של פתרון עובד טרי מומלצת מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של הפתרון עובד עד 1 מיליליטר בינוני (פתרון טעינה) תרבית תאים טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התאים על ידי החלפה בינוני תרבית תאים עם פתרון הטעינה. דגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ואווירה humidified (חממה). זהירות: כמעט כל האינדיקטורים הקרינה מיוצאים על ידי תאי חיים לאורך זמן; לכן להימנע מהעמסה ממושכת או ניתוח מתעכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא שטיפה, מניח את הצלחת תחת מיקרוסקופ המתאים להדמיה תא חי. חשובה: מדדי הקרינה הם רגישים מאוד לאור, ולכן, יש להימנע מחשיפה לאור מיותרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות מבלי לשנות את הפרמטרים הרכישה כדי להבטיח השוואתיים בין תמונות שונות. </li></ol>

<ol><li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%2C+vasculogenesis%2C+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research.+Europaische+Chirurgische+Forschung.+Recherches+Chirurgicales+Europeennes%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li>
<li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation.+1%3A+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li>
<li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+progenitor+cell+mobilization%2C+and+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li>
<li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li>
<li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+mustard+%28Chlorambucil%29+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorambucil+%28nitrogen+mustard%29+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li>
<li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).</li>
<li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry+%3A+Official+Publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חשיפת עור לחומרים כימיים רעילים לעתים קרובות תוצאות הפרעה בריפוי פצע חמורה. המנגנונים הם במידה רבה לא ידועים. ריפוי פצע הוא תהליך מורכב הכולל שלבים שונים (עצירת דימום, דלקת, שגשוג ושיפוץ). נדידת תאים מעורבת בכל שלב, לעומת זאת, זה הוא בעל חשיבות עליונה ליצירת רקמת פרור. הנה, כלי דם חדשים נוצרים גם על ידי angio- או vasculogenesis. שני התהליכים דורשים הגירה מושפעת של מבשר ותאי האנדותל מוקדמים. הערכה של נדידת תאים וה...

נדידת תאים היא חשובה בתהליכים פיסיולוגיים רבים וpathophysiological כוללים פיתוח, מחלות שונות, וריפוי פצעים לאחר פציעת עור. בעקבות פציעת עור, דלקת מסירה כונני רקמה ופרור פגומים או נמקי סגירת פצע ראשונית ומאפשרת היווצרות של רשת של נימי דם חדשים באמצעות vasculogenesis (היווצרות רומן) או אנגיוגנזה (הנבטה של שלפוחית ​​הקיימת) 1-3. שני vasculo- ואנגיוגנזה דורשת הגירה של תאי האנדותל. הרשת הולכת והגדלה של כלי דם חיונית להובלת חמצן וחומרים מזינים למתרבה קרטינוציטים שסופו של דבר לעבור קרטיניזציה, יוצר האפיתל חדש ולספק סגירת פצע. הגירה לקויה של תאי האנדותל היא סיבה בסיסית של ריפוי פצע הפרעת 4,5. הגירה כך, שיטות להערכה של תאי האנדותל מוקדמים נדרשות לחקור את pathophysiology של הפרעות נדידת תאים ולזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית. חשיפת עור לסוכני אלקילציה (למשל, גופרית וחנקן חרדל) גורמת ריפוי פצע הפרעה 6. תרכובות כאלה היו בשימוש כחומרי לחימה כימית במספר עימותים במאה ה -20 ולהישאר סיבה לדאגה חזקה בשל מאגרים קיימים באזורים לא יציבים מבחינה פוליטית וסינתזה פשוטה יחסית. למרות שגז החרדל היה מסונתז ראשון בשנת 1822, פתולוגיה המולקולרית והקלינית של חשיפת SM אינה מובנת בפירוט ולא תרופה לחשיפת SM זוהתה. מספר מחקרים שנערכו להבין ומודל ריפוי פצע לקוי לאחר חשיפת SM ולבדוק לתרכובות מועמד פוטנציאליות מסוגלים להזמין השפעה ש. שמידט ואח &#39;. (2009) בדק את ההשפעה של כלוראמבוציל, מתחם אלקילציה עם מאפיינים דומים לSM בmouדגמי SE גוף embryoid ומצא לפעמים ירידה בהיווצרות כלי 7 דרמטית, יותר מ 99%. השפעה שלילית זו בולטת ביותר בשלב של פיתוח אשר, בתנאים פיסיולוגיים, הוא נשלט על ידי ההתפשטות והנדידה של תאי האנדותל של כלי דם מבשר. כך, תאים אלה זוהו להיות רגישים במיוחד לאלקילציה סוכנים. Steinritz et al. (2010) נבדק אוכלי נבלות של מיני חמצן מגיבים (ROS), ב, N-acetylcysteine ​​מסוים (NAC) וחומצת אלפא לינולנית (ALA) ביכולתם להפחית את רעילות SM במודלי גוף עכבר embryoid ובפרט, ל לשחזר היווצרות כלי 8. השפעות מגנות זמניות נצפו, מצביעה על כך שהיווצרות ROS מוגזמת עשוי לתרום להשפעות השליליות של SM בריפוי פצעים. תופעות אלה לא היו קבועות ותרכובות שני המועמד לא יכולות להיות מסוגלים להחזיר היווצרות כלי וריפוי פצע בטווח הארוך 8. However, ניסויים אלה בוצעו במודל 3D מורכב שעשה יאפשר חקירה של נדידת תאים. לפיכך, אנו לאחר מכן נבדקו NAC וALA להשפעות מועילות על נדידת תאים של השוק האירופי המשותף שיש להם תפקיד מפתח בתהליך של היווצרות כלי 9. יתר על כן, יש ראיות כי קוטביות התא נדרש לנדידת תאים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה המובילה להיווצרות ROS הוצג לפגוע בקוטביות תא ועלול להשפיע לרעה על כך נדידת תאים. לכן, הדמיה תא חי בכל קשור לתפקוד המיטוכונדריה בוצעה ואת ההשפעות של אוכלי נבלות ROS נבדקו. הפרוטוקול הבא מתאר דרישות כלליות לגידול של השוק האירופי המשותף, assay קאמרי בוידן, ריפוי הפצע assay כולל ניתוח מעקב תא והשימוש בTMRM להערכה של תפקוד המיטוכונדריה בפירוט. היבטים חשובים של פרוטוקולי ניסוי לגידול וההגירה EEC מודגשים.

<table><tbody><tr><td>בוידן צ'יימבר&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוספות שטופלו בתרבית רקמות Corning FluoroBlok (TC), 24 באר - 3 ומיקרו; m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC) תוספות מטופלות, 24 באר - 8 ומיקרו; m</td><td>Life Sciences</td> <td>#351152</td><td></td></tr> <tr><td>(לשימוש עם Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&nbsp; Healing Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr> Glass <tr><td></td><td>Bottom Instruments Word Precision, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>הערכת הפוטנציאל</td><td></td><td></td><td></td>המיטוכונדריאלי</tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methylester)</td> <td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>תרבית</td><td></td><td></td><td></td>תאים</tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, אוסטריה</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&-חומצה לינולנית</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, גרמניה</td><td>&nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>כלורמבוציל</td><td>פלוקה (סיגמא), שטיינהיים, גרמניה</td> <td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא-אולדריץ', שטיינהיים, גרמניה</td> <td># G2500-100 גרם</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

חשיפה לחומרים כימיים (כוללים חומרי לחימה כימית אלקילציה כמו חרדל גופרית וחנקן) לגרום לשפע של תסמינים קליניים כוללים הפרעת ריפוי פצע. התהליך הפיזיולוגי של ריפוי פצע הוא מורכב ביותר. ההיווצרות של רקמת פרור היא צעד מפתח בתהליך זה וכתוצאה מכך סגירת פצעים ראשונית ומתן רשת של כלי דם נימים חדשים - בין אם באמצעות vasculogenesis (היווצרות רומן) או אנגיוגנזה (הנבטה של ​​כלי קיימים). שני vasculo- ואנגיוגנזה דורשת הגירה פונקציונלית, בבימויו של תאי האנדותל. כך, החקירה של הגירה מוקדם תא האנדותל (EEC) חשובה להבין הפתופיזיולוגיה של פצע כימי הנגרם על ריפוי הפרעות ופוטנציאל לזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית. חוקרים הערכנו ריפוי פצע לקוי לאחר אלקילציה חשיפת סוכן ונבדקו תרכובות מועמד פוטנציאליות לTReatment. אנחנו השתמשנו בסט של טכניקות שתוארו בפרוטוקול זה. קאמרי בוידן שונה כדי לחקור כמותית chemokinesis של השוק האירופי המשותף מתואר. יתר על כן, השימוש בריפוי הפצע assay בשילוב עם ניתוח מסלול להעריך הגירה איכותית בא לידי ביטוי. לבסוף, אנחנו מדגימים את השימוש בTMRM הצבע פלואורסצנטי לחקירת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לזהות מנגנונים של נדידת תאים מופרעת. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות בסיסיות שהותאמו לחקירת EEC.

חשיפת עור לסוכני אלקילציה מעוררת אודם, היווצרות כיב כיב עורי ושמזוהה עם הפרעת ריפוי פצע. ריפוי פצע דורש vasculogenesis angio- ואשר מבוססים על הגירה של תאי האנדותל. הגירה כמותי יכולה להיות מוערכת על ידי שימוש של assay קאמרי בוידן. כפי שניתן לראות בתרשים 1C חשיפה של השוק האירופי המשותף לכלוראמבוציל סוכן אלקילציה הביא לירידה משמעותית בתא הגירה 9. תוספת של חומצת אלפא-ROS הנבלות לינולנית (ALA) מייד לאחר החשיפה לכלוראמבוציל למשך 24 שעות הצילה באופן משמעותי פנ...

חקירה של נדידה מוקדמת של תאי אנדותל (EEC) חשובה להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות מסוימות וכדי לזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות להערכת נדידת תאים שהותאמו לחקר EEC.

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את השפעתם של כימיקלים רעילים על נדידה של תאי אנדותל באמצעות בדיקות נדידה שונות. ראשית, בניסוי הבא מוצגת השימוש בבדיקת תא הימנעות (avoidant chamber assay) משופרת לבחינת הכימוקינזיס של תאי אנדותל שנחשפו לחומרים. בדיקת ריפוי פצע (wound healing assay) משולבת עם מעקב אחר תאים כדי לספק מידע מעמיק נוסף על הדינמיקה של נדידת התאים.בבדיקה הסופית, מוצגת בדיקה של פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה לצורך זיהוי המנגנונים העומדים בבסיס פגיעה בנדידה של תאי אנדותל. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בבדיקות נדידה אלו כדי להעריך את השפעתם של חומרים אלקילציה רעילים מאוד על פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה ועל נדידת תאי אנדותל. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של הפרעות בריפוי פצעים הנגרמות מחומרים כימיים רעילים מאוד, תוך הדגמה של הפרוצדורות. ramat, voer ו-Stefan Miller, כולם טכנאים מהמעבדה שלי, יבצעו את הפעולה. כדי להכין את בקבוקי תרבית התאים, התחילו בהוספה של נפח מספיק של ג'לטין שהוכן טרי, כך שיכסה בדיוק את תחתיתו של בקבוק סטרילי לתרבית תאים.הנח את הבקבוק באינקובטור לתרביות תאים למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הג'לטין שנותרה והעבר את התאים האנדותליאליים המוקדמים המופקים מתאי גזע עובריים (EEC) בכמות מספקת של מצע גידול כדי לגדל את התאים עד להגעה ל-80% co fluency כאשר התאים הגיעו למצב של sub confluence. הסר את המצע, שטוף את התאים ב-PBS והדגר אותם במיליליטר אחד של Accutane לכל 25 square centimeter למשך שתיים עד 10 דקות.כאשר התאים התנתקו, פצלו אותם ביחס של אחת לחמש במצע טרי לצורך ניתוח נדידה של תאי אנדותל באמצעות בדיקת תא בוידן (Boyden chamber assay). רפפו מראש את התבתי המסנן ב-500 microliters של ג'לטין 0.1% שהוכן טרי. לאחר איסוף תאי ה-EEC כפי שהודגם זה עתה, ספרו את התאים והוסיפו 500 microliters של מצע גידול תאים לתאים התחתונים של תא הבוידן.בשלב הבא, הוסיפו לכל מסנן בדיוק 10⁴ EEC ב-500 µL של מצע. לאחר הסרת בועות אוויר, הכניסו את תא בוידן (Boyden chamber) לאינקובטור למשך שמונה שעות בדיוק. בתום האינקובציה, שטפו את המסננים פעם אחת ב-PBS.לאחר 20 דקות, קבעו את התאים על ידי הוספה של 0.5 milliliters של 4% para formaldehyde לשני התאים. שטפו את המסננים לפחות שלוש פעמים עם 0.1 molar PBS והוציאו את הממברנות באמצעות סכין מנתח. השתמשו בתווך קיבוע (mounting medium) מועשר ב-DPI כדי לקבע כל ממברנה בין שתי זכוכיות כיסוי.שימו לב לכיוון של המסננים. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 400 x כדי לספור רק את התאים שנדדו לעבר התא התחתון. הקפידו שלא להתבלבל בין הנקבים לבין התאים המנדדים.כדי להתחיל את בדיקת ריפוי הפצע (wound healing assay), יש להסיר ידנית את התאים מתוך צלחת תרבית EEC בנשיאות (confluence) של 80% על ידי דחיפה עדינה של טיפ סטרילי של פיפט בנפח 10 microliter על פני השטח של התרבית, בקו ישר וחלק מצד אחד של הצלחת לצד השני. יש לשטוף את הצלחת פעמיים ב-0.1 molar PBS כדי להסיר את התאים שהסתרו. לאחר מכן, יש להוסיף למכל התרבית מצע השריה (medium) מועשר בתרכובת הנחקרת.לאחר מכן, מקמו את צלחת התרבית תחת מיקרוסקופ המסוגל לבצע דימות תאים חיים בתנאי תרבית תאים, ורכשו תמונות time-lapse לאורך 24 שעות במרווחים של 10 דקות, ברזולוציה של לפחות 1024 על 1024 בסיום סבב הדימות. השתמשו בכלי התוכנה המתאים למדידת רוחב המרווח בנקודת הזמן 0 ובשעה 24 לביצוע בדיקת מעקב תאים (cell tracking assay). ייבאו את רצף התמונות ל-ImageJ והפעילו את התוסף MTtrackJ ב-ImageJ.לאחר מכן, באמצעות פקודת add, בחרו 10 תאים באופן אקראי בשדה הראייה כדי לעקוב ידנית אחר תנועת התאים במהלך תקופת הדמיון של 24 שעות. השתמשו בפקודת measure כדי להציג את התוצאות. לאחר מכן, השתמשו בפקודת movie כדי לייצא את נתיבי המעקב לצורך הערכת פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה של התאים לאחר טיפול בתרכובת הניסויית הנבדקת; החליפו את מצע תרבית התאים ב-2 µL של TMRM שהוכן טרי ב-1 mL של מצע תרבית תאים טרי.מדיום, ולאחר מכן, ללא שטיפה ומייד, הניחו את הצלחת תחת המיקרוסקופ והוציאו תמונות של תאי הביקורת והתאים שעברו טיפול ניסויי מבלי לשנות את פרמטרי הרכישה. כדי להבטיח השוואה בין הקבוצות השונות, ריפוי פצעים דורש אנגיוגנזה, התלויה בנדידה של תאי אנדותל כפי שמוצג בגרף של חשיפת EEC לסוכן אלקיליציה. Chlorambacil גורם לירידה משמעותית בנדידת התאים כפי שנמדדה בבדיקת תא בוידן (Boyden chamber assay). הוספה של חומצה אלפא-לינולנית, המשמשת כסורקת של מיני חמצן רעילים (ROS), מיד לאחר חשיפה ל-Chlorambacil למשך 24 שעות, מצילה באופן משמעותי את הפנוטיפ כמעט לרמות של הביקורת.עם זאת, בדיקת תאי בוידן (Boyden chamber assay) אינה מספקת מידע על התנהגות הנדידה של התאים בבדיקת הפצע והריפוי המייצגת זו. תאי ה-EEC שלא נחשפו הצליחו לסגור את הפער תוך 24 שעות, בעוד שתאי ה-EEC שטופלו ב-chlorambacil לא הצליחו בכך. יתרה מכך, מעקב אחר תאי EEC בודדים גילה כי התאים שנחשפו ל-chlorambacil הפגינו תנועה מועטה, שחזרה למצבה לאחר טיפול בלוכד ROS.למעשה, תאי EEC שנחשפו לכלוראמבסיל (chlorambacil) מראים התפרקות של פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה, כפי שמעיד היעדר הביטוי של TMRM. עם זאת, טיפול ב-EEC באמצעות סורק ROS מנע נזק מיטוכונדריאלי זה ושמר על פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד לנתח נדידה של תאי אנדותל שהופרו כימית באמצעות בדיקת תאית נקודתית (point in chamber assay) מותאמת, תוך שימוש בבדיקת שריטה (scratch wound assay), וכיצד להעריך את פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה שלהם.

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מציג שיטה לבדיקת נדידת נוירונים בתגובה לרמזים כימותרפיים מתאי אנדותל פריוונטריקולריים (PVEC). תאי עצב פנימיים ממוקמים בתא מרכזי, עם PVEC ותאי בקרה משני הצדדים. הגירה מוגברת לכיוון PVECs מצביעה על תגובה חיובית לאותות הכימותרפיים שלהם.

הערכת תגובה בין-עצבית לרמזים כימותרפיים מתאי אנדותל פריוונטריקולריים

פיתחנו מודל במבחנה המחקה מרכיב חשוב בתגובה הדלקתית החריף במהלך הזיהום של שלפוחית ​​השתן עם חיידקי Escherichia uropathogenic. Assay הגירת נויטרופילים transuroepithelial מאפשר הערכה כמותית של הגירת נויטרופילים אנושיים על פני epithelia שלפוחית ​​השתן, בתרבית על תומך חדיר, בתגובה לזיהום חיידקים או חומרי chemoattractant.

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

מכשיר תא הזרימה תלת ממדים הוא...

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

חקור את השפעתם של כימיקלים רעילים על נדידת תאי אנדותל באמצעות מבחני נדידה שונים. למדו שיטות לניתוח דינמיקת תאים ומנגנוני פגיעה במיטוכונדריה.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

גלה סרטונים נוספים