Name: מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: למד שיטות מדידה בתפוקה גבוהה לכימות שחרור NET מנויטרופילים אנושיים במבחנה. השיטות מאפשרות חקר מסלולי מעבר אותות ומולקולות מעכבות או מגרות NET במחלות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה מיוחדת לצוות המעבדה של מרכז הבריאות של אוניברסיטת ג'ורג'יה על תמיכתם המתמשכת בעבודתנו על בידוד נויטרופילים אנושיים. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הסטארט-אפ של ד"ר ראדה שסופקה על ידי משרד סגן הנשיא למחקר של UGA.

הדירקטוריון סקירה מוסדיים מאוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה אישרה את המחקר הסובייקט האנושי לאסוף דם היקפיים ממתנדבים בריאים (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 מתנדבים חתם על טופס הסכמה מדעת נדרש לפני לקיחת הדם. המחקר מבוצע במאמר זה תואם עם הקווים המנחים האתיים מחקר רפואי, כולל בבני אדם של הצהרת הלסינקי. 1. ניתוק של נויטרופילים מן היקפיים ודם (איור 1) הערה: ישנן מספר דרכים כדי לבודד נויטרופילים מדם היקפי. הפרוטוקול הבא מספק אפשרות אחת. פרוטוקול זה מניב כמויות גדולות של נויטרופילים אדם שאינו מופעל מסוגל לשחרר נטס על גירוי חיצוני. השתמש 40 מ&quot;ל דם מלא המתקבל מתנדבים בריאים ידי venipuncture. 7,9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot דם 20 מ&quot;ל לשני צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מ&quot;ל 6% Dextran. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 דקות העברה לויקוציטים-ריקיםהשלב העליון h בלי לקחת שום כדוריות דם אדומות pelleted לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל נקי, למלא אותו עם PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 XG 10 דקות. Resuspend גלולה ב 4 מ&quot;ל סטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שיפוע Percoll 5 שלבים של 85% -80% -75% -70% -65% בשני צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל ההשעיה לויקוציטים מ&quot;ל שכבת 2 על גבי אחד שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 800 XG במשך 30 דקות עם בלמים כבויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל התאים (נויטרופילים) בשכבות על% 75% / 80 ו -70% / 75% ממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים שטפו תאים PBS (350 XG, 10 דקות, RT) ולספור תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> מדידה 2. קינטיקה של תאי DNA שחרור שימוש microplate fluorimeter הערה: שיטה זו מאפשרת מדידה של שינויים הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר מעיד על שחרור DNA על פורמט microplate 96-היטב (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השעיה של נויטרופילים במדיום assay (HBSS +1% (v / v) עצמיים סרום + 5 גלוקוז מ&quot;מ) בריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μmol / L של צבע DNA מחייבת קרום חדיר. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים האדם Aliquot (50 μl / טוב) על 96-היטב בתחתית שחור, שקוף microplates. ודא מדיום assay מכסה את כל תחתית הבאר. אם לא, הקש על צלחת בעדינות בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את נויטרופילים המכיל צלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין תמיסות של גירויים במחיר כפול של הריכוזי הסופי שלהם כדי לשמש (37 ° בינוני assay החם C). כביקורת חיובית נטו להשתמש נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר phorbol-myristate-אצטט (PMA) עבור 4 שעות כדי לעורר שחרור NET מקסימלי. 5,8 גירוי PMA עבור 4 שעות מבטיחה שחרור NET מקסימאלי, תוך היווצרות NET ספונטנית נשאר 5,8 נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את microplate fluorimeter לשקילה (4 שעות, 37 ° C, 530 ננומטר עירור 590 ננומטר עבור פליטה). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר נויטרופילים ידי הוספת פתרון הגירוי 50 μl 50 השעיות נויטרופילים μl. השתמש 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​saponin אחד טוב כדי למדוד אות שחרור DNA מקסימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת בקורא ולמדוד שינויים הקרינה עבור 4 שעות ב כל 2 דקות עם לא רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נתונים, לחשב עליות מנורמלות קרינה לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרינת בסיס פחת מן ערכי נקודות קצה עבור כל הבארות כולל saponin (איור 2 א &#39;, ב&#39;). עליית קרינת saponin צריכה להיות האות הגבוהה ביותר. זה נקרא &quot;שחרור DNA המקסימאלי&quot; (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי שחרור DNA בדגימות ידועות על ידי חלוקת עליות קרינה של דגימות ידועות על ידי שחרור DNA מקסימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע תוצאות של משכפל ולהציגם כמו &quot;% של שחרור DNA המקסימאלי&quot; (איור 2 ג). </li></ol></li></ol> 3. כימות של בנטוation ידי MPO-דנ&quot;א-DNA HNE מבחני ELISA הערה: אלה מבחנים שונים (דנ&quot;א MPO) או הקים (HNE-DNA) במעבדה שלנו לכמת היווצרות NET ידי מדידת רמות של מתחמי MPO-דנ&quot;א HNE-DNA 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 96-היטב גבוהה יכולת קשירה צלחות ELISA לילה עם נוגדנים לכידת (50 μl / טוב): אנטי-MPO (דילול 1: 2,000) או אנטי-HNE (1: 2,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות לשטוף ELISA שלוש פעמים עם PBS (200 μl / טוב) ולחסום אותם עם BSA 5% ו -0.1% אלבומין בסרום אדם עבור שעה 2 ב RT (200 μl / טוב). לשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים זרע על 96 גם microplates בצפיפות של 100,000 תאים / היטב במדיום assay 100 μl, וממריץ היווצרות NET. דגירת תאים: 4 שעות עבור 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עיכול DNase מוגבל על ידי הוספת 2 U / DNase מיליליטר supernatants נויטרופילים, לערבב אותם היטב. שמור אותם ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את DNase לאחר 15 דקות על ידי הוספת 11 μl 25 מ&quot;מ EGTA (הריכוז הסופי 2.5 מ&quot;מ). לערבב היטב. אסוף supernatants צינורות microfuge נקי. דגימות ספין להיפטר פסולת התא XG ב 300 דקות 5 ב RT. העבר supernatants שלהם לתוך צינורות microfuge נקיים. ולשמור אותם על הקרח עד מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquot של &quot;תקן NET&quot; שהוכן קודם לכן. הערה: הסטנדרטית NET הוא שילוב של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים PMA מגורה המתקבלים לפחות 5 תורמים אנושיים שונים, עצמאיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש באותה רמה במשך זמן רב, לאסוף aliquot נפח גדול של supernatants נויטרופילים מכל תורם יחיד. איסוף למשל 2 מ&quot;ל של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים מגורה PMA תגרום 200 aliquots (10 μl כל אחד) מספיק 200 צלחות ELISA. נתונים המאפיינים את תקן NET נמצאים איור 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר PMA עבור 4 שעות ולהחיל DNase לעכל כדי supernatants שלהם על פי השלבים 3.4-3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף, בריכה, aliquot (10 μl) וחופשיze (-20 ° C) supernatants נויטרופילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את &quot;NET סטנדרטי&quot;, הפשרה אחד aliquot / תורם המתקבל לפחות חמישה תורמים נפרדים, לערבב אותם ולשמור אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל דגימות מופשרות ולהשתמש נרות חדשים לניסוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1: דילול סדרה 2 של התקן-NET ב PBS + EGTA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות מתעכלות DNase1 (סטנדרטי supernatants הידוע) פי 20 ב PBS + EGTA ו aliquot אותם על צלחות ELISA מצופות נוגדנים ללכוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ELISA במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פתרון נוגדן איתור (100 μl / טוב): נוגדן אנטי DNA מצומדות peroxidase חזרת (1: 500, העכבר). דגירה עבור שעה 1 בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ארבעה שוטף עם PBS להוסיף מצע peroxidase TMB: 100 μl / היטב, 30 דקות. צבע הכחול הוא אינדיקציה לפעילות peroxidase (רשתות נוכחיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור תגובה על ידי הוספת 100 μl / טוב 1 M HCl. הפתרונות כחולים יצהיבו (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו ספיגה ב 450 ננומטר באמצעות פוטומטר microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נתונים, לחשב את כמות MPO-DNA או מתחמים-DNA HNE בהשוואת לתקן NET. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את ערך צפיפות אופטית רקע של המדיום assay מכל המדגמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הערכים הספיגים (ציר ה- X) של דגימות תקן בדילול נגד תוכן NET היחסי (ציר ה- Y) (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מגוון nonsaturated של עקומת סטנדרט זה להקים קו המגמה (להשתמש בכושר מעריכי הטוב ביותר מהתוכנה בשימוש) (איור 5 א). המשוואה של קו מגמה זו קובעת את ההמרה של ערכי OD כדי כמותיים סכומי נטס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את ערכי OD המדודים של האלמונים למשוואת המגמה אונליין מ 3.13.3 זה תיתן את כמות הרשתות במדגם הידוע כאחוז התקן-NET (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשבממוצעים של משכפל (triplicates) ולהציג את הנתונים הסופיים כמו &quot;כמות MPO-DNA או מתחמי-DNA HNE (% לסטנדרטים)&quot; (איור 5 ג). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

רשתות מייצגי מנגנון חדשני מרתק שבו נויטרופילים להרוג פתוגנים. 1 למרות שהספרות של הנטס כבר ברציפות ההרחבה בעשר השנים האחרונות מאז גילויין, מספר שאלות חשובות הקשורות לתפקידם בביולוגיה, מנגנון ויסות עדיין אינן ברורות. יש במתודולוגיה שתפותח למדוד נטס, זה מנגנון מיקרוביאלית מאוד ייחודי. מאמר זה מתאר את השיטות שבהן ניתן להשתמש כדי לכמת נטס באופן תפוקה גבוהה. את assay הראשון כדלקמן קינטיקה של הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר. assay זה מספק כמות גדולה של מידע על המדרון ומהיר...

היווצרות NET היא מנגנון חדשני שבאמצעותו נויטרופילים נלחמים בפתוגנים. 1 הליבה של NETs היא DNA גרעיני. 1 רשת DNA זו קשורה לחלבוני גרגירי נויטרופילים והיסטונים. 1 הצורה העיקרית של היווצרות NET דורשת מוות של נויטרופילים המאופיינים בעיבוי כרומטין, היעלמות ממברנות גרגיריות וגרעיניות, העברה של נויטרופילים אלסטאז לגרעין, ציטרולינציה של היסטונים ולבסוף דליפה של NETs מבוססי DNA. 2 NETs לוכדים והורגים מגוון רחב של חיידקים ומהווים חלק חיוני מרפרטואר הנשק החיסוני המולד. עם זאת, היווצרות NET בלתי מבוקרת נקשרה למחלות אוטו-דלקתיות רבות. 3,4 למרות הרלוונטיות ההולכת וגוברת שלהם, מעט ידוע על המנגנון והרגולציה של שחרור NET. 
נויטרופילים שמתים על ידי שחרור NETs שונים מנויטרופילים אפופטוטיים או נמקיים. 3.5 נויטרופילים משחררי NET מראים מספר תכונות האופייניות להיווצרות NET. רכיבי גרגירים קשורים ל-DNA ב-NETs. 1 מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים אנושי (HNE) נמצאים שניהם בגרגירים ראשוניים בתאים במנוחה, אך מועברים לגרעין כדי להיקשר ל-DNA ב-NETs. 1 קומפלקסים של MPO-DNA ו-HNE-DNA הם ספציפיים ל-NETs, אינם מופיעים בנויטרופילים אפופטוטיים או נמקיים. 1,3,5 עיבוי כרומטין הוא תכונה נוספת האופיינית ל-NETosis. 2 שחרור NET דורש גם ציטרולינציה של היסטונים על ידי פפטידיל אמינידאז 4 (PAD4). 6 היסטונים ציטרולינים הם סימני היכר של נויטרופילים שעברו שחרור NET. 6
כאן מוצגות שלוש שיטות המספקות בשילוב כלים מצוינים לכימות NETs בסולם תפוקה גבוה. הבדיקה הראשונה שימשה בשטח עם שינויים שונים ומכמתת שחרור DNA חוץ-תאי בפורמט מיקרו-צלחת. הבדיקות השנייה והשלישית מספקות אישור ל-NETs על ידי מדידת קומפלקסים MPO-DNA ו-HNE-DNA ספציפיים ל-NET.

<table><tbody><tr><td>נויטרופילים אנטי אנושיים אלסטאז&nbsp; ארנב Ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2,000x מצופה</td></tr><tr><td>אנטי-מיאלופרוקסידאז Ab (ארנב)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2,000x מצופה</td></tr><tr><td>DNase-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181; גרם/מ"ל משמש לעיכול</td></tr><tr><td>20 מ"מ EGTA / PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2.5 מ"מ EGTA/PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>זיהוי מוות תאי ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Eon Microplate ספקטרופוטומטר</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 All-in-One תוכנת מיקרו-פלטות</td><td>Biotek</td><td></td><td>כלי אנליטי (ELISA)</td></tr> <tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0.2% ריכוז/נפח סופי</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>השתמש בריכוז סופי של 10 מ"מ.</td></tr><tr><td>1 M גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td></td><td>השתמש בריכוז סופי של 5 מ"מ.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 ננומטר בשימוש סופי</td></tr><tr><td>ELISA Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>Thermoscientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>פרקול (pH 8.5-9.5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>נתרן כלורי, סיגמא, S7653-250G</td></tr><tr><td>ספקטרום דקסטרן</td><td></td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 מדיה</td><td>קורנינג Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת בדיקה היטב צלחת שחורה תחתית שקופה</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור dna תאי והיווצרות net כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

גרנולוציטים נויטרופילים הם הלויקוציטים הנפוצים ביותר בדם האדם. נויטרופילים הם הראשונים להגיע לאתר ההדבקה. נויטרופילים פיתחו מספר מנגנונים אנטי-מיקרוביאליים כולל פגוציטוזיס, דה-גרנולציה ויצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). NETs מורכבים מפיגום DNA מעוטר בהיסטונים ומספר סמני גרגירים כולל מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים אנושי (HNE). שחרור NET הוא תהליך פעיל הכולל שינויים מורפולוגיים אופייניים של נויטרופילים המובילים לגירוש ה-DNA שלהם לחלל החוץ-תאי. NETs חיוניים למלחמה בחיידקים, אך שחרור בלתי מבוקר של NETs נקשר למספר הפרעות. כדי ללמוד עוד על הרלוונטיות הקלינית ומנגנון היווצרות ה-NET, יש צורך בכלים אמינים המסוגלים לכמת NET. 
כאן מוצגות שלוש שיטות שיכולות להעריך שחרור NET מניטרופילים אנושיים במבחנה. הראשון הוא בדיקת תפוקה גבוהה למדידת שחרור DNA חוץ-תאי מנויטרופילים אנושיים באמצעות צבע קושר DNA אטום לממברנה. בנוסף, מתוארות שתי שיטות נוספות המסוגלות לכמת היווצרות NET על ידי מדידת רמות של קומפלקסים MPO-DNA ו-HNE-DNA ספציפיים ל-NET. שיטות אלה המבוססות על מיקרו-פלטות בשילוב מספקות כלים נהדרים לחקר יעיל של המנגנון והוויסות של היווצרות NET של נויטרופילים אנושיים.

הנתונים בכתב היד הזה לתאר את שיטת בידוד נויטרופילים, פרוצדורות, ותוצאות נציג נוכחיות עם הסבר של ניתוח נתונים. איור 1 מציג את צעדי סדרתי של הכנת נויטרופילים אדם. פרוטוקול זה מייצג רק דרך אפשרית אחת של בידוד נויטרופילים. זה מניב כמויות גדולות של נח נויטרופילים מסוגל לשחרר נטס על גירוי. איור 2 מראה כיצד assay לשחרור DNA מבוסס-הקרינה עובד. באמצעות קינטיקה קורא microplate קרינה של שחרור דנ&quot;א נויטרופילים אדם המיושמי...

מוצגים מבחני תפוקה גבוהים המספקים בשילוב כלים מצוינים לכימות שחרור NET מנויטרופילים אנושיים.

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים, או NETs, המשתחררות מנויטרופילים אנושיים בקנה מידה של סריקה רחבה (high throughput). השיטות המוצגות כאן יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הדלקת ושינוי מחלות דלקתיות, באמצעות חקר המנגנון והוויסות של היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים in vitro בנויטרופילים אנושיים. השלכות טכניקה זו כוללות זיהוי של נתיבי איתות מרכזיים המתווכים על ידי NET ומולקולות מעכבות או מעוררות NET.כדי לבודד נויטרופילים מדם, העבירו מנות של 20 milliliters של דם אנושי לתוך מבחנות קוניות של 250 milliliter. הוסיפו 10 milliliters של 6% dextran, ערבבו בעדינות והשאירו את התמיסות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. העבירו בזהירות את השכבה העליונה העשירה בלוקוציטים למבחנות קוניות נקיות של 50 milliliter, ומלאו את המבחנה עד למעלה באמצעות PBS סטרילי.לאחר מכן, סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך עשר דקות והשתמש ב-15 mL של PBS סטרילי כדי לסבסב את המשקע. חזור על שלב שטיפה זה פעם נוספת. לאחר מכן, הכן מדרגי Percoll בעמי 85%, 80%, 75%, 70% ו-65% בתוך מבחנות קוניות בנפח 215 mL, והשכב 2 mL של תרחיף הלוקוציטים על גבי כל מדרג.לאחר מכן, סובב את המדרגות בריכוז של 800 ×g למשך 30 דקות עם ביטול הבלימה (break off). לאחר הסבוב, אסוף את התאים בשכבות בממשקים של 75-80% ו-70-75%. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים, ולאחר מכן השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.כדי למדוד את קינטיקת השחרור של DNA חוץ-תאי, הכין תרחיף של נויטרופילים במדיום בדיקה בריכוז של 2×10⁶ תאים למילליטר. הוסף 5 µmol/L של SYTOX orange, שהוא צבע קושר DNA שאינו חודר לממברנה, וערבב בעדינות. חלק את הנויטרופילים האנושיים למגש מיקרו-פלטה שחור עם תחתית שקופה בעל 96 בארות, תוך הבטחה שמדיום הבדיקה מכסה את כל תחתית הבאר.אם לא, הקישו בעדינות על דופן הפלטה. חממו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. בינתיים, השתמשו במדיום בדיקה בטמפרטורה של 37 °C כדי להכין תמיסות המכילות את המעוררים בריכוז כפול מהריכוז הסופי שיידרש לשימוש.כביקורת חיובית ל-NET, הכין 100 nanomolar של phorbol myristate acetate, או PMA, לטיפול בנייטרופילים אנושיים למשך ארבע שעות כדי לעורר שחרור מקסימלי של NET. לאחר מכן, הכן את הפלואורומטר של המיקרופלט למדידה. גרה את הנייטרופילים על ידי הוספת 50 microliters של תמיסת גירוי ל-50 microliters של תרחיפי נייטרופילים.הוסיפו ריכוז סופי של 0.5 milligrams per milliliter של saponin לבאר אחת, כדי למדוד את אות שחרור ה-DNA המקסימלי. הניחו את הפלטה בקורא ומדדו שינויים בפלואורסצנציה במרווחי זמן של שתי דקות במשך ארבע שעות ללא ניעור. כדי לנתח את הנתונים, חשבו את העליות הנורמליזות בפלואורסצנציה לאורך זמן על ידי חיסור הפלואורסצנציה של קו הבסיס מערכי נקודת הסיום עבור כל הבארים, כולל אלו שבהן הוסף saponin.העלייה בפלואורסצנציה של saponin צריכה להיות האות הגבוה ביותר, והיא מוגדרת כשחרור ה-DNA המקסימלי. חשבו את ממוצע התוצאות של החזרות והציגו אותן כאחוז משחרור ה-DNA המקסימלי. לצורך כימות של NET formation באמצעות בדיקות MPO-DNA ו-HNE-DNA ELISA, הוסיפו נוגדני לכידה anti-MPO או anti-HNE לפלטות ELISA בעלות קיבולת קשירה גבוהה עם 96 בארות, והדגרימו אותן למשך לילה לצורך ציפוי.בבוקר למחרת, השתמשו ב-200 µL של PBS לכל באר כדי לשטוף את לוחות ה-ELISA שלוש פעמים. לאחר מכן, השתמשו ב-200 µL של 5% bovine serum albumin, או BSA, ו-0.1% human serum albumin, או HSA, כדי לחסום את הבארים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. בינתיים, זרעו נויטרופילים ב-100 µL של מצע בדיקה (assay medium) בלוח בעל 96 בארים בצפיפות של 100,000 תאים לבאר, והשרגו יצירת NET לאחר הוספת המעוררים על ידי דגירה ב-37 °C למשך ארבע שעות.בשלב הבא, בצעו עיכול מוגבל של DNase על ידי הוספת שתי יחידות למיליליטר של DNAse למשקעי הנויטרופילים, לאחר מכן ערבבו היטב והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, עצרו את התגובה על ידי הוספת 15 µL של 25 mM EGTA וערבבו היטב. אספו את המשקעים לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה נקיות וסובבו את הדגימות כדי להיפטר משאריות תאים ב-300 ×g ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.איסוף NETs ללא עיכול מוגבל מוביל לנתונים שאינם עקביים. שלב העיכול המוגבל של ה-DNA הוא קריטי להשגת תוצאות הניתנות לשחזור. לפיכך, ריכוז אנזים ה-DNase I ומשך העיכול עברו אופטימיזציה.העבירו את העל-נוזל למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נקיות ושמרו על קרח. לאחר מכן, בעזרת מנה (aliquot) של NET-standard שהוכר פה, הכינו דילול של 1:2 ב-PBS ו-EGTA. כעת, השתמשו ב-PBS עם EGTA כדי לדלל פי עשרים דגימות שעברו עיכול על ידי DNase I, וחלקו אותן למנות בלוחיות ELISA מצופות בנוגדני לכידה.דגרו את הפלטות למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לפני שטיפת הפלטות שלוש פעמים באמצעות PBS, הוסיפו 100 µL לבאער של תמיסת נוגדן זיהוי, כגון נוגדן anti DNA המשולב עם horseradish peroxidase, ודגרו בחושך למשך שעה אחת. לאחר ארבעה שטיפות עם PBS, הוסיפו 100 µL לבאער של תסבך TMB peroxidase, ודגרו למשך 30 דקות.צבע כחול מעיד על פעילות פראוקסידאז ועל נוכחות של NETs. כדי לעצור את התגובה, יש להוסיף 100 microliters של HCL בריכוז one molar. התמיסות הכחולות יהפכו לצהובות.באמצעות פוטומטר למיקרו-פלטה, מדדו את הבליעה באורכי גל של 450 ננומטר. כדי להשוות את כמות קומפלקסי ה-MPO-DNA או ה-HNE-DNA שנמדדה אל מול סטנדרט ה-NET, החסירו את הצפיפות האופטית של הרקע מכל הדגימות ושרטטו את ערכי הבליעה של דגימות הסטנדרט המדוללות אל מול תכולת ה-NET היחסית שלהן. באמצעות הטווח הבלתי-רווי של עקומת סטנדרט זו, קבעו קו מגמה באמצעות התאמה אקספוננציאלית אופטימלית מהתוכנה שבה נעשה שימוש.הזינו את ערכי ה-OD שנמדדו עבור הדגימות הבלתי ידועות למשוואת קו המגמה, אשר תיתן את כמות ה-NETs בדגימה הבלתי ידועה כאחוז מהסטנדרט של NET. לבסוף, חשבו את הממוצעים של החזרות והציגו את הנתונים הסופיים ככמות של קומפלקסים מסוג MPO-DNA או HNE-DNA. מוצגים כאן נתונים מייצגים מבדיקת שחרור DNA מבוססת פלואורסצנציה של נויטרופילים אנושיים שלא עברו גירוי או שהופעלו באמצעות PMA או P-aeruginosa.P-aeruginosa מעורר יצירת NETs ב-PMNs אנושיים. גרף זה ממחיש כי מחושבים הממוצעים של העלייה בפלואורסצנציה של בארות חוזרות, מנורמלים לפי הפלואורסצנציה המקסימלית ומבוטאים כשחרור DNA. תמונות פלואורסצנציה אלו מייצגות נויטרופילים שלא טופלו או כאלה שעוררו באמצעות PMA.מוצגות כאן תמונות אימונופלורסצנציה של נויטרופילים אנושיים שאינם מעוררים, וכן נויטרופילים שהופעלו על ידי PMA ו-PA01, מתוך בדיקת Elisa של MPO-DNA ו-HNE-DNA. DNA חוץ-תאי מראה מורפולוגיה טיפית של NET ומתקיים במיקום משותף (colocalizes) עם MPO והיסטון H4י ציטרולין, המהווה סמן ליצירת NET. ניסוי זה מדגים שחרור של MPO-DNA ו-HNE-DNA בנויטרופילים אנושיים באמצעות אותה בדיקה.הסטנדרט של NET מכיל בממוצע 19.5 µg/mL של DNA חוץ-תאי, 399 ng/mL של MPO, ו-103.4 ng/mL של HNE. בהתבסס על המשקלים המולקולריים של MPO ו-HNE, ועל כך שמיקרוגרם אחד של DNA מכיל 9.91 × 10¹⁴ נוקלאוטידים, הסטנדרט של NET מכיל 109 מולקולות HNE ו-147 מולקולות MPO לכל 1,000 נוקלאוטידים. לבסוף, ניסויי דילול סדרתי דו-מכפלי של הסטנדרט של NET מגלים כי הטווחים הדינמיים של בדיקות ה-ELISA הן עבור MPO-DNA והן עבור HNE-DNA הם בין 19 ל-609 ng/mL של DNA.לאחר רכישת המיומנות, ניתן להכין במהירות ובקלות את חומרי הבדיקה המבוססים על SYTOX orange תוך שעה אחת, ולהגיע לתוצאות למחרת. גם בדיקה לכימות NETs היא קלה לביצוע ותניב נתונים ביום למחרת אם תבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת naturalase בנייטרופילים אנושיים בשיטה בעלת תפוקה גבוהה.

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה ליצירת ובידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). נויטרופילים מבודדים מדם היקפי ומעוררים באמצעות phorbol myristate acetate (PMA) כדי לייצר NETs. במהלך הדגירה, הנויטרופילים עוברים תהליך של מוות תאי (NETosis) כדי לשחרר NETs המורכבים מכרומטין מעובה מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים גרגיריים.

טכניקת מבחנה ליצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים...

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

אנו מתארים שיטות כדי לבודד את הכלבים נויטרופילים של דם מלא, להמחיש את NET-צורה נויטרופילים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גם המתוארים הם פרוטוקולים לכמת היווצרות נטו, citrullinated היסטון H3 (citH3) ביטוי באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת בדיקה אימונוסורבית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של שרידי מלכודת חוץ-תאיים של נויטרופילים, מיילאופרוקסידז מצומד-DNA וקומפלקסים של דנ"א מצומד אלסטאז נויטרופילים, הנגזרים מנויטרופילים פעילים.

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

למד שיטות מדידה בתפוקה גבוהה לכימות שחרור NET מנויטרופילים אנושיים במבחנה. השיטות מאפשרות חקר מסלולי מעבר אותות ומולקולות מעכבות או מגרות NET במחלות דלקתיות.

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש

גלה סרטונים נוספים