מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים, או NETs, המשתחררים מנויטרופילים אנושיים בקנה מידה גבוה. השיטות המוצגות כאן יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הדלקת ושינוי מחלות דלקתיות באמצעות חקר המנגנון והוויסות של היווצרות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות במבחנה בנויטרופילים אנושיים. ההשלכות של טכניקה זו כוללות זיהוי של מסלולי איתות מרכזיים המתווכים NET ומולקולות מעכבות NET או מגרות NET.

כדי לבודד נויטרופילים מהדם, יש להקצות 20 מיליליטר של דם אנושי לצינורות חרוטיים של 250 מיליליטר. מוסיפים 10 מיליליטר של 6% דקסטרן, ואז מערבבים בעדינות ומניחים לתמיסות לשבת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. העבירו בזהירות את השלב העליון העשיר בלויקוציטים לצינורות חרוטיים נקיים של 50 מיליליטר, והשתמשו ב-PBS סטרילי כדי למלא את הצינור למעלה.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-400 פעמים G למשך עשר דקות והשתמש ב-15 מיליליטר של PBS סטרילי כדי להשעות מחדש את הגלולה. חזור על שלב הכביסה הזה פעם נוספת. לאחר מכן, הכינו חמישה שיפועי פרקול שלבים של 85, 80, 75, 70 ו-65 אחוז בצינורות חרוטיים של 215 מיליליטר ושכבו שני מיליליטר של מתלה הלויקוציטים על גבי כל שיפוע.

לאחר מכן, צנטריפוגה את השיפועים ב-800 פעמים G למשך 30 דקות עם ההפסקה. לאחר הצנטריפוגה, אסוף את התאים בשכבות בממשקים של 75-80% ו-70-75%. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים, ולאחר מכן השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.

כדי למדוד את הקינטיקה של שחרור DNA חוץ-תאי, הכינו תרחיף של נויטרופילים במדיום בדיקה בריכוז של שניים כפול עשרה עד שישה תאים למיליליטר. הוסף חמישה מיקרומול לליטר תפוז SYTOX, שהוא צבע קושר DNA אטום לממברנה וערבב בעדינות. הציגו נויטרופילים אנושיים למיקרו-לוחות תחתונים שקופים שחורים סטריליים עם 96 בארות המבטיחים שמדיום הבדיקה מכסה את כל קרקעית הבאר.

אם לא, הקש בעדינות על הצלחת בצד. מחממים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בינתיים, השתמש במדיום בדיקה של 37 מעלות צלזיוס כדי להכין תמיסות המכילות גירויים בריכוזים כפולים מהריכוזים הסופיים שלהם לשימוש.

כבקרת NET חיובית, הכינו 100 ננו-מולארי phorbol myristate acetate, או PMA, לטיפול בנויטרופילים אנושיים למשך ארבע שעות כדי לעורר שחרור NET מקסימלי. לאחר מכן, הכן את הפלואורומטר של המיקרופלייט למדידה. לעורר נויטרופילים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של תמיסת גירוי ל-50 מיקרוליטר של תרחיפי נויטרופילים.

הוסף ריכוז סופי של 0.5 מיליגרם למיליליטר ספונין לבאר אחת, כדי למדוד את אות שחרור ה-DNA המקסימלי. הנח את הצלחת בקורא ומדוד שינויים בקרינה במרווחי זמן של שתי דקות למשך ארבע שעות מבלי לרעוד. כדי לנתח את הנתונים, חשב עליות מנורמלות בקרינה לאורך זמן על ידי הפחתת הקרינה הבסיסית מערכי נקודת הקצה עבור כל הבארות כולל ספונין.

העלייה בפלואורסצנטיות של ספונין צריכה להיות האות הגבוה ביותר ומכונה שחרור ה-DNA המקסימלי. ממוצע התוצאות של שכפולים והצג אותן כאחוז משחרור ה-DNA המקסימלי. כדי לכמת היווצרות NET באמצעות מבחני MPO-DNA ו-HNE-DNA ELISA, הוסף נוגדנים ללכידת אנטי-MPO או אנטי-HNE ללוחות ELISA בעלי יכולת קשירה גבוהה של 96 בארות, ודגרו אותם למשך הלילה לציפוי.

למחרת בבוקר השתמש ב-200 מיקרוליטר לבאר PBS כדי לשטוף את צלחות ELISA שלוש פעמים. לאחר מכן השתמש ב-200 מיקרוליטר של 5% אלבומין בסרום בקר, או BSA, ו-0.1% אלבומין בסרום אנושי, או HSA, כדי לחסום את הבארות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. בינתיים, זרעי נויטרופילים ב-100 מיקרוליטר של מדיום בדיקה על צלחת של 96 בארות בצפיפות של 100,000 תאים לבאר וגורמים להיווצרות NET לאחר הוספת גירויים על ידי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

לאחר מכן, בצעו עיכול DNA מוגבל על ידי הוספת שתי יחידות למיליליטר של דנ"א לסופרנטנטים של הנויטרופילים, ואז ערבבו היטב ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, עצרו את התגובה על ידי הוספת 15 מיקרוליטר של 25 מילי-מולרי EGTA וערבבו היטב. אספו את הסופרנטנטים ונקו את צינורות המיקרופוגה וסובבו את הדגימות כדי להיפטר מפסולת תאים בטמפרטורה של פי 300 G וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

איסוף NETs ללא עיכול מוגבל מביא לנתונים לא עקביים. שלב עיכול ה-DNA המוגבל הוא קריטי להשגת תוצאות הניתנות לשחזור. לכן, ריכוז האנזים DNase I ואורך העיכול עברו אופטימיזציה.

העבירו את הסופרנטנט לניקוי צינורות מיקרופוגה והמשיכו על קרח. לאחר מכן, באמצעות ציטוט של תקן NET שהוכן בעבר, הכינו דילול אחד עד שניים ב-PBS ו-EGTA. כעת, השתמש ב-PBS עם EGTA כדי לדלל את ה-DNase עיכלתי דגימות פי עשרים וציטוט אותן על לוחות ELISA המצופים בנוגדני לכידה.

דגרו את הצלחות במהלך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לפני השימוש ב-PBS לשטיפת הצלחות שלוש פעמים, יש למרוח 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת נוגדנים לזיהוי כגון נוגדן נגד DNA מצומד חזרת פרוקסידאז, ולדגור בחושך למשך שעה. לאחר ארבע שטיפות עם PBS, הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מצע פרוקסידאז TMB, ודגר למשך 30 דקות.

צבע כחול מצביע על פעילות פרוקסידאז ונוכחות של NETs. כדי לעצור את התגובה, הוסף 100 מיקרוליטר של HCL טוחנת אחת. הפתרונות הכחולים יהפכו לצהובים.

בעזרת פוטומטר מיקרו-פלטה, קרא את הספיגה ב-450 ננומטר. כדי להשוות את כמות מתחמי MPO-DNA או HNE-DNA שנמדדו בהשוואה לתקן NET, הפחיתו את צפיפות הרקע האופטימלית מכל הדגימות ושרטטו את ערכי הספיגה של הדגימות הסטנדרטיות המדוללות מול תכולת ה-NET היחסית שלהן. באמצעות הטווח הלא רווי של עקומה סטנדרטית זו, קבע קו מגמה באמצעות ההתאמה האקספוננציאלית הטובה ביותר מהתוכנה בה נעשה שימוש.

הכנס את ערכי ה-OD הנמדדים של הלא ידועים למשוואת קו המגמה שתיתן את כמות ה-NETs במדגם הלא ידוע כאחוז מתקן NET. לבסוף, חשב את הממוצעים של שכפולים והצג את הנתונים הסופיים ככמות קומפלקסי MPO-DNA או HNE-DNA. מוצגים כאן נתונים מייצגים מבדיקת שחרור DNA מבוססת פלואורסצנטיות של נויטרופילים אנושיים שנותרו ללא גירוי או מופעלים עם PMA או P-aeruginosa.

P-aeruginosa מעורר היווצרות NET ב-PMNs אנושיים. גרף זה ממחיש כי ממוצעי העלייה בקרינה של בארות משוכפלות מחושבים, מנורמלים בפלואורסצנטיות מקסימלית ומתבטאים בשחרור DNA. תמונות פלואורסצנטיות אלה מייצגות נויטרופילים שנותרו ללא טיפול או גירוי עם PMA.

מוצגות כאן תמונות אימונופלואורסצנטיות של נויטרופילים אנושיים לא מגורים, PMA ו-PA01 המופעלים מבדיקת MPO-DNA ו-HNE-DNA Elisa. DNA חוץ-תאי מראה מורפולוגיה טיפוסית של NET ומשתלב עם MPO והיסטון H4 ציטרולין, סמן להיווצרות NET. ניסוי זה מראה שחרור MPO-DNA ו-HNE-DNA בנויטרופילים אנושיים באמצעות אותה בדיקה.

תקן ה-NET מכיל בממוצע 19.5 מיקרוגרם למיליליטר של DNA חוץ-תאי, 399 ננוגרם למיליליטר MPO ו-103.4 ננוגרם למיליליטר של HNE. בהתבסס על המשקלים המולקולריים של MPO ו-HNE, וכי מיקרוגרם אחד של DNA מכיל 9.91 כפול 10 עד 14 נוקלאוטידים, תקן NET מכיל 109 מולקולות HNE ו-147 מולקולות MPO לכל 1,000 נוקלאוטידים. לבסוף, שני ניסויי דילול סדרתי של תקן NET מגלים כי הטווחים הדינמיים של מבחני MPO-DNA ו-HNE-DNA ELISA הם בין 19 ל-609 ננוגרם למיליליטר של DNA.

לאחר השליטה, ניתן להרכיב את החומצה המבוססת על תפוז SYTOX בקלות ובמהירות תוך שעה אחת, מה שמוביל לתוצאות למחרת. גם בדיקת הכימות של NET קלה לביצוע ותביא לנתונים למחרת אם תבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת נטורלאז בנויטרופילים אנושיים בצורה בעלת תפוקה גבוהה.