מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי
3 במאי 2015
טרנספורטרים בקרומי התאים מאפשרים הפרדה דיפרנציאלית של יונים על פני קרומי התאים או שכבות התאים וממלאים תפקידים מכריעים במהלך פיזיולוגיה, תיקון ופתולוגיה של רקמות. אנו מתארים את המיקרו-אלקטרודה המתייחסת לעצמה סלקטיבית של יונים המאפשרת מדידה של שטפי יונים ספציפיים בתאים ורקמות בודדות in vivo.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד זרמי יונים חוץ-תאיים in vivo באמצעות טכניקת מיקרו-אלקטרודה בעלת ייחוס עצמי וסלקטיבית ליונים. דבר זה מושג תחילה על ידי הרכבת המיקרו-אלקטרודות הסלקטיביות ליונים והאלקטרודות למערכת הייחוס. השלב השני הוא כיול ותיקוף של המיקרו-אלקטרודות בעלות הייחוס העצמי והסלקטיביות ליונים.
בשלב הבא, נמדדים שטפי יונים ספציפיים בדגימה הביולוגית בצורה של רישומי מתח. לבסוף, רישום המתח מומר לשטף יונים. בסופו של דבר, טכניקה זו מאפשרת מדידה מדויקת ולא פולשנית של שטפי יונים חוץ-תאיים ספציפיים בתאים או ברקמות חיים.
שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בפיזיולוגיה או בהזדקנות, כמו גם בהתחדשות או בפתולוגיה. לדוגמה, שיטה זו מאפשרת זיהוי של זרמי יונים ספציפיים, השולטים בתהליכים ביולוגיים כגון צמיחה של מורפוגנזה של רקמות או התמיינות. את ההליך זה ידגימו ד"ר Gim Ardi, פוסט-דוקטורנט, ומעבדתו של ד"ר Benjas. לפני כיול האלקטרודה, התקינו אלקטרודה סלקטיבית ליונים מלאה מראש במחזיק מיקרו-אלקטרודות המצויד במחבר זכר מזהב של 1 mm ובחוט כסף מצופה כסף כלוריד.
לאחר מכן, חברו את מחזיק המיקרו-אלקטרודה לממצב מיקרו-אלקטרוני ממוחשב בעל שלושה צירים. האלקטרודה הסלקטיבית ליונים צריכה להכיל כבר את האלקטרוליט ואת תמיסת ה-"ion four cocktail" המתאימה ליונים המבוקשים. לאחר ההרכבה, יש לשקוע את האלקטרודה בתמיסה המכילה one millimolar potassium chloride.
בנוסף, התקינו את אלקטרודת הייחוס במחזיק מיקרו-אלקטרודה ישר המכיל תמיסת מלח בריכוז של שלושה מולאר בתוך אגאר, כדורית כסף מצופה כסף כלוריד ומחבר זכר מזהב בקוטר של שני מילימטרים עבור אלקטרודת הייחוס. בחירת תמיסת המלח תלויה בסוג היונים למדידה. לאחר הכנת אלקטרודת הייחוס, חברו את מחזיק האלקטרודה לממקם מיקרו ידני המותקן מראש על מעמד מגנטי.
לאחר ההרכבה, יש להטביע את האלקטרודה בתמיסה המכילה מילימולרי one של potassium chloride. לפני התחלת העבודה, יש להכין עבור מערך האלקטרודה הסלקטיבית ליונים סדרת דילול של סטנדרטים לכיול אלקטרוליט המכילים את היונים המבוקשים. לדוגמה, אם ברצונכם לזהות קטיוני potassium בריכוז פיזיולוגי של כ-one מילימולרי, הכינו סדרה של שלושה סדרי גודל של תמיסות potassium chloride בריכוזים של 10, 1 ו-0.1 מילימולרי.
פעולה זו ממקסמת את הטווח הדינמי של הגילוי הנדרש למסיי. כדי לכייל את האלקטרודה הסלקטיבית ליון, התחילו בהטמעה של שתי האלקטרודות, הסלקטיבית ליון ואלקטרודת הייחוס, לתוך תמיסת הכיול בריכוז הנמוך ביותר, במקרה זה 0.1 millimolar. לאחר תקופת התייצבות קצרה של דקה עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר, מדדו ורשמו את המתח במצב יציב.
חזור על מדידות המתח עבור שאר תכלילי הכיול, ושרטט את המתחים שנמדדו אל מול הלוגריתם של ריכוזי היונים המולריים. עבור כל תמיסת כיול, בצע רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את שיפוע ה-N, את נקודת החיתוך ואת ערכי ה-r² של עקומת הכיול. כדי לחשב את שיפוע ה-Nernst, זכור לחלק את המתחים שנמדדו בהגבר הכולל של מגבר המתח.
כדי להדגים את פרוטוקול המדידה, יאפיין את שטף יוני האשלגן מביצית צפרדע מנוקבת באמצעות מיקרו-אלקטרודה רגישה לאשלגן. לפני תחילת הגדרת האלקטרודה הסלקטיבית ליונים, גזרו פיסה של סנטימטר אחד מרשת ניילון של 800 micron והדביקו אותה לצלחת פטרי מפלסטיק. כמו כן, הכינו מראש תמיסת ריינגר (Ringer) משופרת של מארק בהרכב הבא: 100 millimolar נתרן כלוריד, 2 molar אשלגן כלוריד, 2 millimolar סידן כלוריד, 1 millimolar מגנזיום כלוריד ו-5 millimolar HEPES. כוון את ה-pH של הבאפר ל-7.5 באמצעות נתרן הידרוקסיד והוסף מנה מהבאפר המוכן אל צלחת הפטרי.
הנח בזהירות את תא הצפרדע, את האלקטרודה הסלקטיבית ליון ואת אלקטרודת הייחוס אל תוך פטריית המעבדה. לאחר מכן, בצע נקב בתא והפעל את המיקרו-מיסב (micro positioner), כך שהאלקטרודה הסלקטיבית ליון תהיה במרחק של כ-10 מיקרון מהדגימה. מבחינת טרמינולוגיה, המרחק הנוכחי בין הדגימה לאלקטרודה יוגדר כמיקום קרוב (close position).
בשלב הבא, הפעילו את המיקרו-מיקם כך שהאלקטרודה הסלקטיבית ליונים תחצה באופן מחזורי מהמיקום הקרוב, 10 microns, למיקום רחוק יותר של 100 microns, ולאחר מכן תחזור למיקום הקרוב בקצב של 0.3 hertz, כלומר, שלושה מחזורים מלאים בכל 10 שניות. במהלך הפעלת המיקרו-מיקם, ודאו שתנועת האלקטרודה היא אכן ניצבת לפני השטח המשיקי הפגוע של התא, והפעילו את התוכנה למדידה והקלטה של המתח. המיקרו-מיקם מתוכנת לעצור לזמן קצר במיקומים הקרוב והרחוק בזמן איסוף נתוני המתח.
הנתונים נרשמים באופן רציף במהלך ריפוי פצע בתאי ביצית (oocyte), תהליך האורך כ-15 דקות עבור ניסויים קצרים יותר; עבור ניסויים ממושכים יותר, כגון מעקב אחר תהליך רב-יומי של התחדשות זנב ראשן של opus, נרשמות מדידות למשך שתי דקות בנקודות זמן שונות. לדוגמה: לאחר 1, 3, 6, 12 ו-24 שעות. עם השלמת הניסוי, הוצא את נתוני המתח כקובץ טקסט והעתק את הערכים לגיליון אלקטרוני.
השתמשו בעקומת הכיול שנקבעה קודם לכן כדי להמיר את ערכי המתח שנמדדו לריכוזי היונים המתאימים להם. שרטטו את ריכוזי היונים שהוערכו באקסטרפולציה כפונקציה של המרחק מהמדגם הביולוגי. לבסוף, חשבו את שטף היונים באמצעות חוק הדיפוזיה של פיקס.
כאשר C הוא ריכוז היונים בתמיסה, MU היא ניידות היונים, ו-DC DX הוא הפרש הריכוזים לאורך מרחק dx. לפני ביצוע ניסויים ביולוגיים, ניתן לתקף את ערך נקודת החיתוך של שיפוע ה-NER ואת עקומת הכיול המלאה עבור האלקטרודה הסלקטיבית ליונים אל מול גרדיאנט יונים מלאכותי שנוצר ממקור יונים בריכוז 1M שהוצב בתוך צלחת פטרי. כאשר שינויים בריכוזי יוני אשלגן ממופים במרחק קרוב או רחוק מפצע באתר האנו (annu site wound).
הנתונים מצביעים על כך שאירוע זרימה מאסיבי של אשלגן מתרחש עם תחילת הפגיעה התאית; ככל שריפוי הפצע מתקדם, זרימת האשלגן פוחתת בהדרגה חזרה לרמות השקט לאחר 15 דקות, כאשר הפצע מחלים לחלוטין. יתרה מכך, כאשר ריכוזי יוני האשלגן הנמדדים מומרים לזרימת יונים, העלייה הפתאומית והירידה ההדרגתית של זרימת האשלגן לאחר הפגיעה נראות כאפקט מובהק סטטיסטית בהשוואה לאוציט ביקורת שלם. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון סימון ביו-חשמלי פלואורסצנטי, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מאפייני זרימות יונים בין-תאיות ותת-תאיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את טכניקת המיקרו-אלקטודה בעלת ייחוס עצמי וברירה יונית למדידת שטפי יונים ספציפיים בתאים ורקמות חיים. שיטה זו מאפשרת הערכות מדויקות ולא פולשניות של דינמיקת יונים חוץ-תאית in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- נשאים בממברנות של תאים חיוניים להפרדה של יונים.
- הם ממלאים תפקידים קריטיים בפיזיולוגיה ובפתולוגיה של רקמות.
- הבנת שטפי יונים חיונית לחקר תהליכים תאיים.
- המיקרו-אלקטרודה בעלת ייחוס עצמי ובחירה יונית היא כלי חדשני למטרה זו.
מטרת המחקר
- למדידת שטפי יונים חוץ-תאיים in vivo.
- לשימוש בטכניקת מיקרו-אלקטרודה בעלת ייחוס עצמי וברירה יונית.
- לספק תובנות לגבי דינמיקת יונים ברקמות חיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה של מיקרו-אלקטרודות ייחוס ואלקטרודות סלקטיביות ליון.
- כיול ותיקוף של המיקרו-אלקטרודות.
- הקלטות מתח מדגימות ביולוגיות.
- המרה של הקלטות מתח למדידות של שטף יוני.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של שטפי יונים ספציפיים בתאים חיים.
- הדגמה של דיוק הטכניקה והיותה אי-פולשנית.
- תיקוף של השיטה באמצעות תהליכי כיול.
- יישומים פוטנציאליים בחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה של רקמות.
מסקנות
- המיקרו-אלקטרודה בעלת הייחוס העצמי והסלקטיבית ליונים יעילה למדידות in vivo.
- טכניקה זו משפרת את הבנתנו את הדינמיקה של יונים.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר בפיזיולוגיה תאית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
מדידה של תזרימי יונים חוץ-תאיים מספקת תובנות קריטיות לגבי מסלולי העברה תאיים השולטים במורפוגנזה של רקמות, בצמיחה ובדיפרנציאציה — תהליכי מפתח בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית. טכניקת המיקרו-אלקטרודה בעלת הייחוס העצמי והסלקטיבית ליונים מאפשרת הערכה כמותית ולא פולשנית של דינמיקת יונים במערכות חיות, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור שינויים בתזרימי יונים לתוצאות ביולוגיות. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי באמצעות זיהוי מנגנונים המתווכים על ידי יונים המשפיעים על התקדמות המחלה ועל התגובה הטיפולית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי זיהוי של זרמי יונים ספציפיים השולטים בתהליכים ביולוגיים כגון מורפוגנזה ודיפרנציאציה של רקמות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידה ישירה של שינויים בזרם יונים בתגובה לגירויים תאיים או לשיבושים גנטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים, על ידי קביעת פרופילי זרימת יונים בסיסיים תחת תנאים פיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה ובשחזור של הבדיקה באמצעות מדידות מיקרו-אלקטרודות מכויילות, המספקות נתונים כמותיים של ריכוז יונים לאורך מרחק.
מחקרe translational ומחקר פרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין ממצאי הגילוי להמשכיות פרה-קלינית על ידי הדגמה כיצד דינמיקה של שטף יונים נמצאת במתאם עם תהליכי ריפוי פצעים והתחדשות רקמות.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמות-סיכון באמצעות אספקת מדידות סטטיסטית משמעותיות של שטף יונים המבדילות בין מצבים ביולוגיים של ביקורת למצבים מופרעים.
שילוב תהליכי עבודה ושרשראות עיבוד
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), על ידי אספקת נתונים כמותיים של זרם יונים, התורמים לביסוס הוודאות לגבי המטרה ולהבהרת המסלול.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מדידת שטפי יונים המשמשים כרמזי איתות בתהליכים תאיים.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות הקלטות מתח המומרות לערכי שטף יונים לפי חוק הדיפוזיה של פיק (Fick’s law), מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות (ריכוז יונים, שטף) ופלט סטטיסטי (למשל, שינויים משמעותיים לאחר פגיעה) המאפשרים השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני על ידי הצגת שינויים בשטף יונים במהלך תיקון רקמה, ובכך מסייע להתאמת סממנים ביולוגיים בהקשרים רגנרטיביים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למדידות שטף ספציפיות ליונים במגוון סוגי תאים ומודלים של רקמות, הניתנת להתאמה לחישה של סידן, אשלגן או נתרן באמצעות בחירת יוניופור (ionophore).
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי באישור המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות מדידות ישירות של שטף יונים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות עקומות כיול ואימות שיפוע נרנסט אל מול מדרגי יונים ידועים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתוני שטף יונים כמותיים ובעלי מובהקות סטטיסטית המשקפים תגובות ביולוגיות לפגיעה או לטיפול.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי חתימות של שטף יונים הקשורות ליעילות טיפולית או לרעילות במערכות הרלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופיזיולוגיה וטיפול במיקרו-אלקטרודות לצורך הרכבה ומיקום נכונים.
- מתבסס על מכשור הכולל מיקרו-ממצב (micropositioner) בעל שלושה צירים הנשלט במחשב ומגבר מתח עם כיול הגבר.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי כיול באמצעות סדרות דילול ספציפיות ליון, כדי למקסם את הטווח הדינמי.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הטכניקה למערכות מודל שונות (למשל, אווציטים של צפרדע, תאי צמחים, שכבות אפיתליאליות).
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הצורך במיקום יציב של המיקרו-אלקטרודה בניצב לפני השטח של הרקמה ורגישות לסחיפה (drift) במהלך הקלטות לטווח ארוך.
