Name: מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למד מדידת זרמי יונים חוץ-תאיים בתאים חיים באמצעות טכניקת המיקרואלקטרוד העצמי ההתייחסות. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת ובלתי פולשנית של דינמיקת יונים בביולוגיה של התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע MCB-0951199, ובחלקה על ידי מענק ה-NIH EY01910, מענקי המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה RB1-01417 ועל ידי מענק Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) SFRH/BD/87256/2012.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר למדידת הצלחה של נתיבי יון תאיים in vivo הם: ההפחתה של הרעש, הייצור הנכון של האלקטרודה microelectrodes יון סלקטיבי וההתייחסות, והמיצוב של המדגם ושני אלקטרודות. על מנת למזער את הרעש, מערכת ההקלטה צריכה להיות בכלוב פאראדיי מוארק (הארקה) רצוי עם שולחן מצופה מתכת (בידוד רעידות) שגם הוא מוארק. בנוסף, צריך גם להיות מוארק מארז מיקרוסקופ. מקורות של רעש חשמלי כוללים מקור האור. מקור אור &#39;א...

<html> כל התאים של בעלי החיים מוקפים בקרום bilayer שומנים שמפריד בין הציטופלסמה מהסביבה החיצונית. התא שומר על פוטנציאל הממברנה חשמל, שלילי בפנים, בתחבורה פעילה של יוני 1. פוטנציאל הממברנה הוא מקור אנרגיה אצור בו התא יכול לנצל להפעלת מכשירים מולקולריים שונים בקרום 2. יש נוירונים ותאים רגישים אחרים פוטנציאלי קרום גדולים. פתיחה מהירה של תעלות נתרן מתמוטטת הקרום פוטנציאלי (שלילת קוטביות) ומייצרת פוטנציאל הפעולה שמועבר לאורכו של נוירון 2. מלבד שינויים חשמליים מהירים אלה, רקמות ואיברים רבים ליצור ולשמור על פוטנציאל חשמלי לטווח ארוך משמעותי. לדוגמא, העור וepithelia קרני ליצור ולשמור על פוטנציאל טרנס-אפיתל וזרמים חשמליים תאיים על ידי שאיבה כיוונית של יונים (בעיקר נתרן כלורי ו) 3. אוהל &quot;&gt; בעוד מדידות של זרם חשמלי תאי אנדוגני באמצעות הבדיקה הרוטטת 4-6 ומדידות של פוטנציאלי קרום או טרנס-אפיתל באמצעות מערכת microelectrode 7-10 לאפשר מדידה של הפרמטרים חשמליים של קרום תא ושכבות תאי אפיתל, שהם נותנים לא אינדיקציה למיני היון המעורב. Microelectrodes עם ionophore סלקטיבית יכולה למדוד ריכוז יון ספציפי בפתרון. מילויים יון או שטף ניתן היו למדוד עם שתיים או יותר אלקטרודות בעמדות שונות. עם זאת, להיסחף המתח הפנימי של כל בדיקה יהיה שונה, גורם למדידות מדויקות או אפילו גילוי של שיפוע שלא היה נוכח. אלקטרודה אחת השתמשה במצב &quot;התייחסות עצמית&quot; לפיו הוא נע בתדירות נמוכה בין שתי נקודות פותרת בעיה זו. עכשיו שטף היון שניתן לראות על הרקע להיסחף אות איטית יחסית ויציב (ראה איור 3). </p&gt; מערכת מדידת היון רגיש משתמשת microelectrodes התייחסות עצמית יון סלקטיבי כדי לזהות נתיבים תאיים קטנים של יונים קרובים לרקמות או תאים בודדים. המערכת מורכבת ממגבר שמעבד את האות מmicroelectrode ומנוע צעד מיקרו והנהג לשלוט בתנועה של microelectrode. Microelectrode יון סלקטיבי ואת האלקטרודה ההתייחסות שיסגור את המעגל מחוברים למגבר דרך headstage מראש מגבר (איור 1 א). תוכנת מחשב קובעת את הפרמטרים של תנועת microelectrode (תדירות, מרחק) וגם רושמת את התפוקה של המגבר. מנוע צעד שולט על תנועת microelectrode באמצעות micropositioner תלת-ממדי. תדירות נמוכה הרוטטת microelectrode יון סלקטיבי פותחה לראשונה בשנת 1990 למדידת שטף סידן ספציפי 11. כמו גם סידן, קוקטיילים ionophore מסחרי נגישים זמינים כעת לעשות MICRoelectrodes רגיש לנתרן, כלוריד, אשלגן, מימן, מגנזיום, ניטראט, אמוניום, פלואוריד, ליתיום או כספית. בעיקרון, טכניקת microelectrode יון סלקטיבי התייחסות העצמית ממירה את הפעילות של יון ספציפי המומס בתמיסה לפוטנציאל חשמלי, הניתן למדידה על ידי מד מתח. קוקטייל ionophore הוא נוזל immiscible שלב (אורגני, lipophilic) עם תכונות החלפת יונים. Ionophore סלקטיבי קומפלקסים (נקשר) יונים ספציפיים הפיך ומעביר אותם בין התמיסה המימית הכלולות בmicroelectrode (אלקטרוליט) והתמיסה המימית שבי microelectrode הוא שקוע (1D איור). העברת יון זה מובילה לשיווי משקל אלקטרוכימיים ווריאציה של הפוטנציאל החשמלי בין microelectrode ואת האלקטרודה ההתייחסות נמדדת על ידי מד המתח. המתח הוא פרופורציונאלי ללוגריתם של פעילות היון הספציפית לפי דואר נרנסטquation מאפשר החישוב של ריכוז היון (איור 2 א &#39;וב&#39;). נכון לעכשיו, כמה מערכות מאפשרות מדידה של שטף יון באמצעות מושג או עיקרון דומה. לדוגמא, טכניקת אלקטרודה סריקת יון סלקטיבי (סת) 12,13 או טכניקת microelectrode יון שטף הערכה (MIFE) שפותחה על ידי ניומן וShabala 14-16 הם זמינים מסחריים ושימוש נרחב על ידי קהילת המחקר כדי לקבוע יון ספציפי נתיבים המתרחשים בקרום תא ורקמה במגוון רחב של בעלי חיים, צמחים ודגמי תא חי בודדים. microelectrodes יון סלקטיבי כבר משמשת למדידת מימן, אשלגן וסידן על פני שטף שורשי צמח 17, שטף כלוריד בעורקי מוח חולדה 18 ובצינורות אבקה 19, שטף מימן בתאי רשתית להחליק 20, שטף סידן בעצמות עכבר 21, יון שונים נתיבים בפטריית העובש 22 ובrבקרנית 23, ובסופו שטף סידן במהלך פצע תא בודד ריפוי 12,24. ראה גם הסקירה לקבלת מידע מפורטת על microelectrodes התייחסות העצמית יון סלקטיבי 25 הבאה. המאמר שלהלן מתאר בפירוט כיצד להכין ולבצע מדידה של נתיבי יון תאיים אנדוגני באמצעות טכניקת microelectrode יון סלקטיבי התייחסות העצמית ברמת התא הבודד.

<table><tbody><tr><td>IonAmp&nbsp;</td><td>&nbsp; מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"</td>ב <td>ללא</td><td>מגבר שנוצר על ידי מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"ב; ניתן לרכוש מערכת דומה מ " פונקציית XBL חשובה" (http://www.xuyue.org/) או מתוך " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) או מהאלקטרוניקה הרלוונטית(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>IonAmp32&nbsp;</td><td>&nbsp; מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>אף</td><td>תוכנה שנוצרה על ידי מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"ב; ניתן לרכוש מערכת דומה מ " פונקציית XBL חשובה" (http://www.xuyue.org/) או מתוך " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) או מאלקטרוניקה רלוונטית(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>מגבר מקדים של Headstage</td><td>&nbsp; מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>INA116</td><td>BSR Voltage Follower INA116, שתוכנן על ידי מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"ב; ניתן לרכוש מערכת דומה מ " פונקציית XBL חשובה" (http://www.xuyue.org/) או מתוך " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) או מאלקטרוניקה רלוונטית(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>מנהל התקן MicroStep</td><td>&nbsp; מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>אין שלושה</td><td>מנהלי התקנים של MicroStep נדרשים למיצוב X, Y ו-Z; נוצר על ידי מרכז המחקר BioCurrents, וודס הול, מסצ'וסטס, ארה"ב; ניתן לרכוש מערכת דומה מ " פונקציית XBL חשובה" (http://www.xuyue.org/) או מתוך " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) או מהאלקטרוניקה הרלוונטית(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>מיקרופוזיציה ידנית&nbsp; &nbsp;</td><td>מכשירי דיוק עולמיים&nbsp;</td><td>דגם KITE-R</td><td>ניתן לרכוש מערכת דומה מאלקטרוניקה ישימה (http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr> <tr><td>מעמד מגנטי&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>דגם M10</td><td>ניתן לרכוש מערכת דומה מאלקטרוניקה ישימה (http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr> <tr><td>טבלת בידוד רעידות&nbsp; &nbsp;</td><td>ניופורט בע"מ&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>דגם VW-3036-OPT-023040</td><td>ניתן לרכוש מערכת דומה מאלקטרוניקה ישימה (http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr> <tr><td>חלק משלושה מיקרופוזיציה מימדית: תושבת זווית, 90 מעלות, פנים מחורצות</td><td>ניופורט בע"מ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>דגם 360-90</td><td>מכלול של שלושת המיקרו-פוזיציונרים הממדים דורש גם שלושה מנועים סיבוביים חשמליים לבקרת X, Y, Z, זרוע הרכבה MPH-1 עם עמוד זווית מתכווננת MCA-2 ומחברים וברגים שונים של ניופורט להברגה על שולחן הרטט</td></tr><tr><td>חלק משלושה מיקרופוזיציונרים מימדיים: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 אינץ' X Travel</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>אין</td></tr><tr><td>חלק משלושה מיקרופוזיציונרים מימדיים: שלב ליניארי מהיר, 0.5 אינץ' XY Travel</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>ללא</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט דקים עם קירות דקים של Kwik-Fil ללא נימה&nbsp;</td><td>מכשירי דיוק עולמיים&nbsp;</td><td>TW150-4</td><td>ללא</td></tr><tr><td>חולץ אלקטרודות&nbsp;</td><td>נרישיגה</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>ללא</td></tr><tr><td>מתלה מתכת</td><td>מיוצר בבית</td><td>ללא</td><td>מחזיק אלקטרודות מתכת מיוצר בבית על ידי קידוח חורים ברוחב 2 מ"מ במרווח של חצי ס"מ בבסיס מלבני של 10 ס"מ על 15 ס"מ של פלדה</td></tr><tr><td>תנור</td><td>QL</td><td>דגם 10 תנור מעבדה</td><td>ללא</td></tr><tr><td>פתרון סילניזציה I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>מסוכן, ידית לפי המלצת הספק&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מזכוכית; Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>316060</td><td>ללא</td></tr><tr><td>צנצנת אחסון אלקטרודות/מיקרופיפטות</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>E215</td><td>ללא</td></tr><tr><td>מייבש זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-595E</td><td>מכיל חומר ייבוש דריריט (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). הניחו ג'לי נפט על החותם כדי שיהיה אטום.</td></tr><tr><td>פיפטה פסטר מפלסטיק&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11597722</td><td>ללא</td></tr><tr><td>מבער בונסן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S97329</td><td>ללא</td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8902</td><td>ללא</td></tr><tr><td>מחזיק מיקרואלקטרודה ישר</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>QSW-A15P</td><td>עם מחבר זכר זהב 1 מ"מ וחוט Ag / AgCl</td></tr><tr><td>מחזיק מיקרואלקטרודה ישר&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>עם כדור AgCl(Ag+) בפנים ומחבר זכר זהב 2 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 6 ס"מ</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>ללא</td></tr><tr><td>רשת ניטקס</td><td>דינמיק אקווה-אספקה בע"מ</td><td>NTX750</td><td>ללא</td></tr><tr><td>דבק; Loctite אפוקסי</td><td>VWR</td><td>500043-451</td><td>מערבבים דבק ומקשיח בחלקים שווים בסירת שקילה מפלסטיק ומערבבים היטב. מתייצב במהירות אך משאיר ב-RT למשך 24 שעות לריפוי מלא</td></tr><tr><td>מים נטולי יונים&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>ללא</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>ללא</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>ללא</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>ללא</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>ללא</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>ללא</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8045</td><td>ללא</td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1190</td><td>ללא</td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9539</td><td>ללא</td></tr></tbody></table>

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

תאים מבעלי חיים, צמחים ותאים בודדים מוקפים גדר נקראת קרום התא המפריד בין הציטופלסמה מבחוץ. שכבות תאים כגון epithelia גם יוצרות מחסום שמפריד בתוך מבחוץ או תאים שונים של יצורים רב-תאיים. תכונה מרכזית של חסמים אלה היא חלוקת ההפרש של יונים על פני קרום תא או שכבות תאים. שני נכסים לאפשר חלוקה זו: 1) קרומים וepithelia להציג חדירות סלקטיבית ליונים מסוימים; 2) יונים מועברים באמצעות משאבות פני קרום תא ותא שכבות. מאפיינים אלה ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הפיסיולוגיה רקמה ולפעול כאיתות רמזים לאחר נזק, במהלך תיקון, או תחת מצב פתולוגי. Microelectrode התייחסות עצמי יון סלקטיבי מאפשר מדידות של נתיבים ספציפיים של יונים כמו סידן, אשלגן או נתרן ברמות תא ורקמה אחת. Microelectrode מכיל קוקטייל ionophore שהואסלקטיבי חדיר ליונים מסוימים. פתרון המילוי הפנימי מכיל ריכוז קבוצה של היון של עניין. הפוטנציאל החשמלי של microelectrode נקבע על ידי הריכוז מחוץ ליון. כיון הריכוז משתנה, הפוטנציאל של microelectrode משתנה כפונקציה של היומן של פעילות היון. כשעברתי הלוך ושוב ליד מקור או כיור של היון (כלומר במפל ריכוזים בשל שטף יון) את פוטנציאל microelectrode נע במשרעת פרופורציונלית לשטף יון / השיפוע. המגבר מגביר את אות microelectrode והתפוקה נרשמה במחשב. שטף היון אז יכול להיות מחושב על ידי החוק של Fick של דיפוזיה באמצעות תנודות אלקטרודה פוטנציאליות, הטיול של microelectrode, ופרמטרים נוספים כגון ניידות היון הספציפית. במאמר זה, אנו מתארים בפירוט את המתודולוגיה למדידה והנתיבים יון תאיים באמצעות microelectrode התייחסות עצמי יון סלקטיביd להציג כמה תוצאות נציג.

הראינו בעבר כי זרימת סידן מופיעה לאחר תא בודד נפצע 24. לפיכך, אנו נשאלים אם נתיבי יון אחרים להתרחש על פציעת תא בודדת. אנחנו השתמשנו בX. laevis ביצית, מודל מבוסס היטב לריפוי תא ותא בסופו 30-34 והקלטת אלקטרו 24,35-39. מעניין, יוני אשלגן הם יותר מרוכז בתוך X. laevis ביציות (כ -110 מ&quot;מ) 40 מאשר בפתרון תאי המשמש (בMMR 1x: 1 מ&quot;מ) המצביע על זרימה של אשלגן על פציעה. כדי לאשר את ההשערה ש, מדדנו את שטף אשלגן במהלך X...

טרנספורטרים בקרומי התאים מאפשרים הפרדה דיפרנציאלית של יונים על פני קרומי התאים או שכבות התאים וממלאים תפקידים מכריעים במהלך פיזיולוגיה, תיקון ופתולוגיה של רקמות. אנו מתארים את המיקרו-אלקטרודה המתייחסת לעצמה סלקטיבית של יונים המאפשרת מדידה של שטפי יונים ספציפיים בתאים ורקמות בודדות in vivo.

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד זרמי יונים חוץ-תאיים in vivo באמצעות טכניקת מיקרו-אלקטרודה בעלת ייחוס עצמי וסלקטיבית ליונים. דבר זה מושג תחילה על ידי הרכבת המיקרו-אלקטרודות הסלקטיביות ליונים והאלקטרודות למערכת הייחוס. השלב השני הוא כיול ותיקוף של המיקרו-אלקטרודות בעלות הייחוס העצמי והסלקטיביות ליונים.בשלב הבא, נמדדים שטפי יונים ספציפיים בדגימה הביולוגית בצורה של רישומי מתח. לבסוף, רישום המתח מומר לשטף יונים. בסופו של דבר, טכניקה זו מאפשרת מדידה מדויקת ולא פולשנית של שטפי יונים חוץ-תאיים ספציפיים בתאים או ברקמות חיים.שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בפיזיולוגיה או בהזדקנות, כמו גם בהתחדשות או בפתולוגיה. לדוגמה, שיטה זו מאפשרת זיהוי של זרמי יונים ספציפיים, השולטים בתהליכים ביולוגיים כגון צמיחה של מורפוגנזה של רקמות או התמיינות. את ההליך זה ידגימו ד"ר Gim Ardi, פוסט-דוקטורנט, ומעבדתו של ד"ר Benjas. לפני כיול האלקטרודה, התקינו אלקטרודה סלקטיבית ליונים מלאה מראש במחזיק מיקרו-אלקטרודות המצויד במחבר זכר מזהב של 1 mm ובחוט כסף מצופה כסף כלוריד.לאחר מכן, חברו את מחזיק המיקרו-אלקטרודה לממצב מיקרו-אלקטרוני ממוחשב בעל שלושה צירים. האלקטרודה הסלקטיבית ליונים צריכה להכיל כבר את האלקטרוליט ואת תמיסת ה-"ion four cocktail" המתאימה ליונים המבוקשים. לאחר ההרכבה, יש לשקוע את האלקטרודה בתמיסה המכילה one millimolar potassium chloride.בנוסף, התקינו את אלקטרודת הייחוס במחזיק מיקרו-אלקטרודה ישר המכיל תמיסת מלח בריכוז של שלושה מולאר בתוך אגאר, כדורית כסף מצופה כסף כלוריד ומחבר זכר מזהב בקוטר של שני מילימטרים עבור אלקטרודת הייחוס. בחירת תמיסת המלח תלויה בסוג היונים למדידה. לאחר הכנת אלקטרודת הייחוס, חברו את מחזיק האלקטרודה לממקם מיקרו ידני המותקן מראש על מעמד מגנטי.לאחר ההרכבה, יש להטביע את האלקטרודה בתמיסה המכילה מילימולרי one של potassium chloride. לפני התחלת העבודה, יש להכין עבור מערך האלקטרודה הסלקטיבית ליונים סדרת דילול של סטנדרטים לכיול אלקטרוליט המכילים את היונים המבוקשים. לדוגמה, אם ברצונכם לזהות קטיוני potassium בריכוז פיזיולוגי של כ-one מילימולרי, הכינו סדרה של שלושה סדרי גודל של תמיסות potassium chloride בריכוזים של 10, 1 ו-0.1 מילימולרי.פעולה זו ממקסמת את הטווח הדינמי של הגילוי הנדרש למסיי. כדי לכייל את האלקטרודה הסלקטיבית ליון, התחילו בהטמעה של שתי האלקטרודות, הסלקטיבית ליון ואלקטרודת הייחוס, לתוך תמיסת הכיול בריכוז הנמוך ביותר, במקרה זה 0.1 millimolar. לאחר תקופת התייצבות קצרה של דקה עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר, מדדו ורשמו את המתח במצב יציב.חזור על מדידות המתח עבור שאר תכלילי הכיול, ושרטט את המתחים שנמדדו אל מול הלוגריתם של ריכוזי היונים המולריים. עבור כל תמיסת כיול, בצע רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את שיפוע ה-N, את נקודת החיתוך ואת ערכי ה-r² של עקומת הכיול. כדי לחשב את שיפוע ה-Nernst, זכור לחלק את המתחים שנמדדו בהגבר הכולל של מגבר המתח.כדי להדגים את פרוטוקול המדידה, יאפיין את שטף יוני האשלגן מביצית צפרדע מנוקבת באמצעות מיקרו-אלקטרודה רגישה לאשלגן. לפני תחילת הגדרת האלקטרודה הסלקטיבית ליונים, גזרו פיסה של סנטימטר אחד מרשת ניילון של 800 micron והדביקו אותה לצלחת פטרי מפלסטיק. כמו כן, הכינו מראש תמיסת ריינגר (Ringer) משופרת של מארק בהרכב הבא: 100 millimolar נתרן כלוריד, 2 molar אשלגן כלוריד, 2 millimolar סידן כלוריד, 1 millimolar מגנזיום כלוריד ו-5 millimolar HEPES. כוון את ה-pH של הבאפר ל-7.5 באמצעות נתרן הידרוקסיד והוסף מנה מהבאפר המוכן אל צלחת הפטרי.הנח בזהירות את תא הצפרדע, את האלקטרודה הסלקטיבית ליון ואת אלקטרודת הייחוס אל תוך פטריית המעבדה. לאחר מכן, בצע נקב בתא והפעל את המיקרו-מיסב (micro positioner), כך שהאלקטרודה הסלקטיבית ליון תהיה במרחק של כ-10 מיקרון מהדגימה. מבחינת טרמינולוגיה, המרחק הנוכחי בין הדגימה לאלקטרודה יוגדר כמיקום קרוב (close position).בשלב הבא, הפעילו את המיקרו-מיקם כך שהאלקטרודה הסלקטיבית ליונים תחצה באופן מחזורי מהמיקום הקרוב, 10 microns, למיקום רחוק יותר של 100 microns, ולאחר מכן תחזור למיקום הקרוב בקצב של 0.3 hertz, כלומר, שלושה מחזורים מלאים בכל 10 שניות. במהלך הפעלת המיקרו-מיקם, ודאו שתנועת האלקטרודה היא אכן ניצבת לפני השטח המשיקי הפגוע של התא, והפעילו את התוכנה למדידה והקלטה של המתח. המיקרו-מיקם מתוכנת לעצור לזמן קצר במיקומים הקרוב והרחוק בזמן איסוף נתוני המתח.הנתונים נרשמים באופן רציף במהלך ריפוי פצע בתאי ביצית (oocyte), תהליך האורך כ-15 דקות עבור ניסויים קצרים יותר; עבור ניסויים ממושכים יותר, כגון מעקב אחר תהליך רב-יומי של התחדשות זנב ראשן של opus, נרשמות מדידות למשך שתי דקות בנקודות זמן שונות. לדוגמה: לאחר 1, 3, 6, 12 ו-24 שעות. עם השלמת הניסוי, הוצא את נתוני המתח כקובץ טקסט והעתק את הערכים לגיליון אלקטרוני.השתמשו בעקומת הכיול שנקבעה קודם לכן כדי להמיר את ערכי המתח שנמדדו לריכוזי היונים המתאימים להם. שרטטו את ריכוזי היונים שהוערכו באקסטרפולציה כפונקציה של המרחק מהמדגם הביולוגי. לבסוף, חשבו את שטף היונים באמצעות חוק הדיפוזיה של פיקס.כאשר C הוא ריכוז היונים בתמיסה, MU היא ניידות היונים, ו-DC DX הוא הפרש הריכוזים לאורך מרחק dx. לפני ביצוע ניסויים ביולוגיים, ניתן לתקף את ערך נקודת החיתוך של שיפוע ה-NER ואת עקומת הכיול המלאה עבור האלקטרודה הסלקטיבית ליונים אל מול גרדיאנט יונים מלאכותי שנוצר ממקור יונים בריכוז 1M שהוצב בתוך צלחת פטרי. כאשר שינויים בריכוזי יוני אשלגן ממופים במרחק קרוב או רחוק מפצע באתר האנו (annu site wound).הנתונים מצביעים על כך שאירוע זרימה מאסיבי של אשלגן מתרחש עם תחילת הפגיעה התאית; ככל שריפוי הפצע מתקדם, זרימת האשלגן פוחתת בהדרגה חזרה לרמות השקט לאחר 15 דקות, כאשר הפצע מחלים לחלוטין. יתרה מכך, כאשר ריכוזי יוני האשלגן הנמדדים מומרים לזרימת יונים, העלייה הפתאומית והירידה ההדרגתית של זרימת האשלגן לאחר הפגיעה נראות כאפקט מובהק סטטיסטית בהשוואה לאוציט ביקורת שלם. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון סימון ביו-חשמלי פלואורסצנטי, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מאפייני זרימות יונים בין-תאיות ותת-תאיות.

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מספק גישה ביוכימית למדידת קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR) של תאים לוקמיים ראשוניים עם בדיקת שטף חוץ-תאי. הערכת הפרופיל המטבולי של תאים אלה מסייעת לאפיין את דרישותיהם, מה שמוביל לטיפול מותאם אישית.

בדיקת שטף חוץ-תאי: שיטה למדידת פרופיל מטבולי של תאים

בסרטון זה, תרביות תאי כליה עובריים המבטאים חלבוני תעלות יונים תלויי אור המאוחים עם כתב פלואורסצנטי מדגימות את השפעת האור על תנועת היונים. מהדק טלאי תא שלם משמש לניטור תנועת היונים.

רישום אלקטרופיזיולוגיה אופטוגנטית של תאים עם תעלות יונים תלויות אור

סרטון זה מדגים כיצד לאפיין את החלל החוץ-תאי בפרוסת מוח באמצעות מיקרואלקטרודות סלקטיביות ויונטופורזיס כדי למדוד ולהשוות אותות חשמליים. תהליך זה מסייע לקבוע את שבר הנפח של החלל ואת מידת הפיתולים.

אפיון חלל חוץ-תאי בפרוסת מוח באמצעות מיקרואלקטרודות יונים סלקטיביות ויונטופורזיס

החלק הראשון של מאמר זה מראה כיצד לבחור קווי תאים מוטנטיים המבטאים מחליפי Na+/H+ שלפוחיתיים בקרום הפלזמה שלהם. החלק השני מספק פרוטוקולים המבוססים על מדידות pH תוך-תאיות וקליטת יונים מהירה, המשמשים לקביעת סלקטיביות היונים והפרמטרים הקינטיים של מחליפים אלה.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

אנו מדגימים את הייצור, הכיול והתכונות של שני סוגים של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים (דו-חבית וקונצנטרית) למדידת ריכוזי יונים ברקמת המוח. אלה משמשים לאחר מכן בהכנת פרוסת ההיפוקמפוס של העכבר כדי להראות שפעילות מעוררת משנה הן את ריכוזי האשלגן החוץ-תאי והן את ריכוזי הנתרן.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay רמזי למדידת שיעורי הפרשת נוזל מצינוריות Malpighian (כליות) מבודדות מmelanogaster תסיסנית. בנוסף, השימוש באלקטרודות יון ספציפי למדידת ריכוזי נתרן ואשלגן בנוזל המופרש, המאפשר חישוב של שטף יון transepithelial, מתואר.

שימוש של assay רמזי כדי למדוד את הפרשת נוזלים ויון שטף מחירים ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; אבובית Malpighian

מאמר זה מתאר כיצד נקבעת סלקטיביות היונים של channelrhodopsin באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים של Patch-Clamp של תאים שלמים באמצעות תאי HEK293. כאן, מודגם ההליך הניסיוני לחקירת סלקטיביות כלוריד של תעלה רודופסין סלקטיבי של אניונים. עם זאת, ההליך ניתן להעברה לתעלות רודופסינים אחרים בעלי סלקטיביות מובחנת.

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

יוני אשלגן לתרום פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, ריכוז K+ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של הסלולר דעתנית. אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K+-microelectrodes סלקטיבית. באמצעות אלקטרודות כזה מאפשר מדידת דינמיקה ריכוז K+ חשמלית עורר בפרוסות בהיפוקמפוס למבוגרים.

ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות מאחורי בדיקת רמזי, מיקרואלקטרודים סלקטיביים יונים, סריקת טכניקת אלקטרודה סלקטיבית יון (SIET) ובדיקות התכווצות במבחנה, המיושמים לחקר מערכת הפרשת היתושים הבוגרת, המורכבת מצינורות Malpighian והינדגוט, כדי למדוד באופן קולקטיבי שיעורי הפרשת יונים ונוזלים, פעילות התכווצות והובלת יונים טרנס-אפיתל.

חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים

למד מדידת זרמי יונים חוץ-תאיים בתאים חיים באמצעות טכניקת המיקרואלקטרוד העצמי ההתייחסות. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת ובלתי פולשנית של דינמיקת יונים בביולוגיה של התא.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

גלה סרטונים נוספים