דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשבט ולהבטא נוגדנים המיוצרים על ידי תאי B. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאי B מרקמת מקור רלוונטית כמו דם או תימוס. השלב השני הוא ביצוע מיון תאים (FACS) ובחירת אוכלוסיית תאי ה-B החיוביים לייצור IgG.

בשלב הבא, התאים מخلודים על ידי הדבקה בנגיף Epstein-Barr יחד עם הפעלה של קולטן דמוי-טל 9 באמצעות C-P-G-O-D-N 2006, ונשמרים בתרבית. השלבים הסופיים הם בידוד RNA משבטים שנמצאו חיוביים לייצור IgG בבדיקת ELISA, ויצירת DNA משלים (copy DNA) הן מהשרשראות הקלות והן מהשרשראות הכבדות של ה-IgG. בסופו של דבר, ניתן לשבט את רצפי ה-IgG לתוך וקטורי ביטוי של יונקים כדי להפיק כמויות גבוהות של IgG אנושי מונוקלונאלי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טכנולוגיית תצוגת פאג'ים (phage display), הוא שההתאמה המקורית בין השראשרים הכבדים והקלים של ה-IgG אינה אובדת. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום האוטואימיוניות, כגון גילוי ואפיון תפקודי של אוטו-נוגדנים פתוגניים. זכרו כי עבודה עם חומרים ממטופלים ועם נגיף ה-EBV עלולה להיות מסוכנת.

נגיף EB הוא פתוגן אנושי ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה ברמה ביולוגית 2 (BSL-2) ולבישת מיגון מתאים בעת ביצוע שלבים אלו. לפני צביעת ה-PBMCs, יש להעביר אותם לבקבוק תרבית בנפח 25 סמ"ק עם 6 מיליליטר של מצע RPMI 1640 מלא ולהמתין להתאוששותם במהלך הלילה. לאחר חסימה ושטיפה של התאים, אספו את ה-pbmc לשפופרה עם חצי מיליליטר של מצע וסובבו אותם בסבב (spin down). לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים בבופר סימון וספרו אותם.

בשלב הבא, הכינו שתי פרועות FACS של 5 מיליון תאים ב-200 µL של בופר בתוך הפרועות הללו. הוסיפו 10 µL של anti CD 22 P-E-R-C-P או 40 µL של anti IgG pe והניחו להן להדגיר במשך 30 דקות על קרח ובחושך, ולאחר מכן שטפו, סיננו ומיינו את התאים. המטרה היא לספור את התאים בעלי ביטוי כפול חיובי (double positive).

התחילו בדילול של תאי ה-P BMCs הממוינים בריכוז של תא אחד למיקרוליטר ב-RPMI 1640, מצע מלא בתוספת של C PG 2006 ו-EBV. לאחר מכן, בתוך מבתור (hood), זרעו 110 מיקרוליטרים של דילול התאים עם EBV ו-CPG 2006, לשני בארות של פלטת 96 בארות בעלת תחתית עגולה, שבהן נזרעו מראש תאי WI 38 מקרינים. ההדבקה של 50 תאים לבערה היא אופטימלית ומגדילה את הסבירות להשגת נוגדן מונוקלונאלי.

עם זאת, אנו ממליצים לאשר זאת באמצעות PCR. לאחר שבוע של דגירה, יש לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא צמיחה של תאי B. לאחר שבועיים, החליפו את המצע: שאבו באיטיות 90 µl של מצע מכל באר והעבירו אותו לצלחת חדשה.

לבדיקת ייצור IgG על ידי Eliza. לאחר מכן, יש להוסיף בחזרה 100 µL של מצע תזונתי טרי ומועשר, כולל IL-2, לכל באר. המשך לעקוב אחר צמיחת השי Clones במהלך השבוע השלישי והרביעי לצמיחתם.

חזור על החלפת המדיום מדי שבוע. עיין בפרוטוקול הכתוב עבור שיטות להתרחבות קלונלית. בדוק את העל-נוזל (supernatant) שהתקבל מהחלפות המדיום לייצור IgG באמצעות סמיקה אימונוסורבנטית מקושרת לאנזים (ELISA).

ראשית, הכינו את פלטות ה-ELISA על ידי הקצאת 50 µL של נוגדנים מסוג goat anti-human FC לכל באר, המדוללים ביחס של 1:200 בתוך תמיסת encoding. לאחר דגירה ושטיפת הפלטה, חסמו את הבארים באמצעות 100 µL של תמיסות חסימה (blocking buffer) לכל באר ודגרו את הפלטה שוב. לאחר דגירת החסימה, השליכו את הנוזל מהפלטה על גבי נייר סופג.

לאחר הכנת המגש, דללו את העל-נוזלים (supernatants) בארבעה נפחים של RPMI. לאחר מכן, עבור בקרות סטנדרטיות, הכינו דילול סדרתי של תמיסת IgG אנושית ב-RPMI בריכוזים שבין 1000 nanograms per milliliter ל-15.6 nanograms per milliliter.

כלול גם דגימה ריקה (blank). העבר 50 µL מהעלינו (supernatant) או מהסטנדרט לכל באר והדבק את פלטת ה-ELISA למשך שעה בטמפרטורה של 37 °C באופן דומה; ניתן להכין פלטות ELISA נוספות כדי לנתח דילולים נוספים של העלינו לבדיקת זיקת הנוגדנים (antibody affinity). לאחר הדגירה, שטוף את הפלטה.

לאחר מכן, יש להוסיף לכל באר 50 µL של תמיסת דגום (incubation buffer) עם fab two המשולב עם פרוקסידאז. לאחר שעה נוספת של דגום ושטיפה נוספת, יש להוסיף 100 µL של תמיסת סובסטרט עם TMB לכל באר. לאחר מכן, יש לדגום את הפלטה למשך עד 10 דקות, עד להתייצבות הגוון הכחול המופיע.

לאחר מכן, עצרו את התגובה ומדדו את הבליעה. כל על-נוזל של שיבוב שבו הבליעה הנמדדת גבוהה בשלוש סטיות תקן מהמדגם הריק נחשב לחיובי.

עבור נוגדי IgG אנושיים, ניתן לזהות ספציפיות אנטיגנית באמצעות בדיקות נוספות. ראשית, פעל לפי הפרוטוקול הכתוב כדי לסנתז DNA משוכפל מהקלונים החיוביים. לאחר מכן, הגדר תגובות PCR עבור השראות הכבדה של IgG ושרשראות קאפה ולמבדה.

בתוצאות, חפשו את השרשרת הכבדה בטווח של 400 עד 550 זוגות בסיסים. חפשו את השרשרת הקלה בטווח של 300 עד 400 זוגות בסיסים. אם הן אינן מופיעות, השתמשו במיקרוליטר של תוצרי הריאקציה כתבנית עבור PCR נוסף.

המוצרים החדשים צריכים להיות בטווח המתאים. לאחר מכן, יש להמשיך לשבט את המוצרים הטובים ביותר. ראשית, יש לבצע להם ריצוף. האלקטרופורוגרמות שלהם צריכות להיות נקיות ולהתכתב עם רצף אימונוגלובולין בודד.

בהתאם לפרוטוקול הכתוב. יש לשבט את תוצר ה-PCR המופרך לתוך מיקרוגרם אחד של DNA פלסמי. יש לוודא כי הליגציה תתבצע במהלך הלילה בטמפרטורה של 16 °C.

באמצעות T4 DNA Ligase, הכין את תאי HX ב-DMEM מועשר וגדל אותם עד לצפיפות של 75% בבקבוקי תרבית של 75 סמ"ר. עבור כל טרנספקציה של שרשרת כבדה וקלה, הכן תערובת המכילה 1.75 Milliliters של DMEM ללא סרום, הכוללת 4.5 micrograms של וקטור השרשרת הכבדה, 3 micrograms של וקטור השרשרת הקלה ו-50 microliters של תמיסת פוליאתילן. הוסף בעדינות תערובת זו לצלחת של תאי HX וסובב את התמיסה מעל הצלחת.

דגרו את הפלטה למשך לילה, ולאחר מכן התחילו באיסוף המצעים לתרבית מדי יום. החליפו אותם במצע ללא סרום. המצע מכיל את הנוגדנים וניתן לאסוף אותו מדי יום למשך ארבעה ימים לאחר ש-p BMCs חיוביים ל-CD 22 ו-IgG מוינו באמצעות FACS.

את השטח של התאים הכפוליים החיוביים, תאי B המייצרים נוגדני IgG, אספו בנפרד לצורך הרחבה. כ-1% מה-pbmc היו באוכלוסייה כפולה חיובית זו. לאחר חמישה שבועות של גירוי באמצעות EBV immortal ו-CPG 2006, בודדו קלונות מונצחים.

לתאי המזינים מסוג WI 30 יש צורה פיברובלסטית מוארכת יותר, ושבטי תאי B נראים כתאים עגולים וקטנים מאוד הגדלים בצבירים במרכז פלטה רב-בארים בעלת תחתית עגולה. הנוזל העליון של השבטים הגדלים נבדק באמצעות ELIZA ל-IgG. שבט חיובי הוגדר ככזה עם ערך eli הגבוה בשלוש סטיות תקן מערך הבקרה (blank).

לפחות שלושה תמיסורי-על משיבון (clone) חיובי נמצאו חיוביים בבדיקת ה-eli. נוגדנים משיבון חיובי עברו רצף לאחר שכפול אזורי המשתנה והקבוע של זוג שרשראות האימונוגלובולין הכבדה והלמדא, ובכך ניתן היה לאפיין את השרשרת הכבדה והקלה. לאחר הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף, על מנת לענות על שאלות נוספות כגון שימוש בנוגדנים, שימוש בגנים, גיוון גנטי וכדומה. לאחר פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האוטו-אימוניות לחקור מחלות, פתולוגיה ואסטרטגיות טיפוליות רלוונטיות למחלות אוטו-אימוניות כגון myasthenia gravis. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על האבחון והטיפול במחלות כגון myasthenia gravis, מכיוון שגילוי של נוגדנים פתוגניים עשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשים, כגון נוגדנים תחרותיים שאינם בעלי פעילות דלקתית.