Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להטמיע תאי גזע בכמוסות אלגינט, הידרוג'ל בצורה בטוחה ויעילה, ולתרבית אותם בתוך הכמוסות כדי לשלוט עבור צבירה ומיקרו-סביבה, זה מושג תחילה על ידי ערבוב תרחיף תאי גזע מסוננים ותמיסת נתרן אלגינט. לאחר מכן מעבירים את התערובת למזרק ומותקנת זרבובית קואקסיאלית על המזרק לפני שמניחים אותם על משאבת מזרק. לאחר מכן, הטיפות מוכנות על ידי הוצאת תרחיף התא עם גז חנקן זורם, ואחריו איסוף ותמיסת סידן כלורי.

לאחר מכן הקפסולות מטופלות בפולי L ליזין למניעת דליפה תאית ו-EDTA לנוזל את הכמוסות הפנימיות לפני תרבית התאים העטופים במצב טלטול סיבובי. לבסוף, התאים נאספים מהכמוסות על ידי EDTA והרס פיזי של הממברנה. בסופו של דבר, אנקפסולציה של אלגינט של תאי גזע פלוריפוטנטיים מונעת מהתאים להצטבר יתר על המידה ומגבילה את הלחץ העצום שחווים התאים בתרבית תרחיף.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגי והביו-רפואי, כגון הרחבה גדולה של השתלת תאים ומחקר על נישת תאי גזע. התחל באנקפסולציה של תאים על ידי איסוף התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט לאחר צנטריפוגה ב-160 פעמים G למשך שלוש דקות. שטפו את הגזע הפלוריפוטנטי המושרה או גלולת תאי ה-IPS על ידי Resus, השעיה בערימות של מי מלח וצנטריפוגה שלוש פעמים לאחר החייאה, השעיית התאים וערימות מי מלח.

סנן את מתלה התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרון על מנת להסיר אגרגטים גדולים, שאחרת עלולים לסתום את הזרבובית. לאחר מכן, מערבבים שני מיליליטר של תרחיף תאים מסוננים ושלושה מיליליטר של תמיסת נתרן אלגינט 5%. כדי להשיג תרחיף תאים של חמישה מיליליטר בצפיפות תאי נתרן אלגינט של 3% היא DIR יותר ממיליון תאים למיליליטר.

לאחר איסוף מתלה התאים למזרק של חמישה מיליליטר, התקן זרבובית קואקסיאלית על המזרק והניח אותם על משאבת מזרק, פולט זרימת גז חנקן דרך המחט החיצונית של הזרבובית הקואקסיאלית ומוציא את מתלה התא דרך הזרבובית הפנימית. אוספים טיפות ל-250 מיליליטר של תמיסת סידן כלורי 0.5%, וממתינים 10 עד 20 דקות להתייצבות תוך ערבוב ב-60 עד 90 סל"ד. לאחר שטיפה עם ערימות של מי מלח חוצצים, הכמוסות שנאספו משמשות כקפסולות עירומות לטיפול בכמוסות הדגירה של כמוסות סידן אלגינט ב-0.05% משקל לנפח.

תמיסת פולי L ליזין למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם טלטול. לאחר איסוף הכמוסות לתוך שפופרת ושטיפה עם ערימות של מי מלח, דגרו אותן ב-DMEM המכיל 10% FBS. על מנת לנטרל את המטען החשמלי על פני השטח שלהן, השתמש בקפסולות המתקבלות כקפסולות מצופות ליצירת קפסולות חלולות.

דגרו את הכמוסות בערימות של מי מלח עם חוצץ המכיל 10 מילי-מולרי EDTA למשך חמש דקות. הכמוסות שטופלו ב-EDTA משמשות כקפסולות חלולות. דגרו את התאים המכוסים ב-75 סל"ד עם ניעור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 10 ימים לאחר הדגירה, אספו ודגרו את הקפסולות ב-10 מילי-מולרי EDTA ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 10 דקות.

אוספים את התאים מכמוסות האלגינט ללא טיפול בפולי ליצין על ידי צנטריפוגה ב-1000 פעמים G למשך שלוש דקות. אם מטפלים בכמוסות אלגינט בפולי L ליזין, שברו את קרום האלגינט פולי L ליזין על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כ-10 פעמים בעזרת מחט המחוברת למזרק. קוטר המחט צריך להיות נמוך מגודל הקפסולה, ובניסוי זה משתמשים ב-25 מחטים

לאחר צנטריפוגה ב-1000 עד 5,000 פעמים G למשך חמש דקות, אסוף את כדור התא אך ורק מממברנות פולי ליצין אלגינט L שבורות אם דגימות mRNA נאספות מהתאים, שים לב ששאר ממברנות האלגינט פולי L ליצין עשויות למנוע טיהור mRNA כפי שמוצג על ידי מצלמה במהירות גבוהה. תמיסת האלגינט שנפלטת יוצרת צורה כדורית מיד לאחר הגירוש. אם המתלה נפלט בקצב זרימת חנקן נמוך מליטר אחד לדקה, גודל הטיפות אחיד.

עם זאת, אם זרימת החנקן גבוהה מליטר אחד לדקה, הטיפה מתפרקת וגודל הטיפות הופך להיות הטרוגני. בהתחשב בכך, קשה להכין טיפות קטנות מ -500 מיקרון בשיטה זו. בתהליך הג'ל, טיפות נתרן אלגינט יוצרות כמוסות סידן אלגינט בצורת כדור בתמיסת סידן כלורי.

עם זאת, אם ריכוז הנתרן אלגינט גבוה מספיק, ריכוז נמוך של נתרן אלגינט גורם לצורת לא, כדורית ונונו של כמוסות, שיש להן בעיה בתהליך הקידוד. גם אם ריכוז הנתרן אלגינט אינו מספיק, ניתן ליצור כמוסות כדוריות על ידי הגדלת ריכוז הסידן. עם זאת, כ-50 מילי-מולרי של סידן כלורי מתאים לאנקפסולציה מכיוון שריכוז גבוה מדי של סידן כלורי מפחית את הצמיחה והכדאיות של התאים.

תאים עטופים יכולים לגדול בכמוסות, אך דליפה תאית יכולה להתרחש בכמוסות ללא ציפוי פולי L ליזין אלגינט. במקרה של תאי IPS של עכברים, התאים יוצרים אגרגטים בצורת דיסק בכל קפסולת סידן אלגינט, ואילו התאים מתקבצים יחד ויוצרים אגרגטים כדוריים בודדים בכל קפסולה חלולה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעטוף ולתרבית תאים לבקרת גודל.

מימן לוכד ללא כל ציוד מיוחד, ללא סופג אורגני.