Name: Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למדו שיטת אנקפסולציה של תאי גזע pluripotent באלגינט באמצעות נחיר קואקסיאלי. טכניקה זו מפחיתה מאגדגציה ומגן על התאים מלחץ גזירה בתרבית תלויה, ומאפשרת ייצור המוני ומחקר על נישות תאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט S-Innovation של סוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית (JST), התוכנית לתארים מתקדמים למנהיגים בחדשנות בחיים (GPLLI) של אוניברסיטת טוקיו, ומלגת מחקר למדענים צעירים של האגודה היפנית לקידום המדע. אנו מודים ל-nac Image Technology Inc. על צילום סרטים באמצעות מצלמה מהירה.

1. חומרי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 חיץ HEPES מ&quot;מ. התאם את ה- pH 7.0 ב RT ולהוסיף NaCl 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5% פתרון אלגינט ופתרון 10 מ&quot;מ EDTA על ידי ערבוב מלח HEPES שנאגר ערוכים 1.1. התאם את ה- pH 7.0 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי חומרים כימיים (1.1, 1.2) במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מאכלי 60 מ&quot;מ מצופה ג&#39;לטין שכבתי עם 1.2-2.0 פיברובלסטים עכבר עובריים × 10 6 (MEF) תאים, אשר נחשבים כתאים מזינים על ידי דגירה בתוך DMEM המכיל 10% FBS ES-מוסמך ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר של C mitomycin 90 - 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על גזע pluripotent עכבר מושרה (iPS) תאים בצלחת עם התאים מזינים בנוכחות 5 מיליליטר הגבוה של גלוקוז DMEM המכיל 20% של ES-המוסמך FBS, 50 מיקרומטר של 2-mercaptoethanol, חומצת אמינו לא חיונית, ואנטיביוטיקה ( 100 / מיליליטר יחידות של פניצילין G נתרן, 100 מיקרוגרם / מיליליטר של סולפט סטרפטומיצין, ו -250 / מיליליטר ng של amphoteriCIN B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 4 × 5 תאי iPS 10 על צלחת 60 מ&quot;מ מצופה ג&#39;לטין ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשנות את מדיום התרבות בכל יום במהלך דגירה. לאחר 3-4 ימים של תרבות, trypsinize תאי דקות 1 עם 500 μl של 0.05% טריפסין המכיל EDTA 0.02% על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אחרי זה, לנתק את התאים על ידי הקשה על צלחת התרבות עשר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 מיליליטר של DMEM עם 10% מהשעית תא צנטריפוגות ES-מוסמכת FBS ואנטיביוטיקה (להלן תאי iPS עכבר ניתוק לתוך תאים בודדים ידי pipetting עם micropipette 1000 μl שלוש פעמים) בשעה 160 × גרם במשך 3 דקות ולהסיר supernatant ולספור את התאים . בעקבות ספירת תאים, לזרוע תאים שנאספו על צלחת ג&#39;לטין מצופה ו דגירה למשך 30 דקות לבודד את תאי iPS מתאי MEF. לאחר הספירה של התאים (בדרך כלל 1-3 × 10 6 תאים / מנה יכולה להיות שנאספו), reseed 4 × 10 5 תאים iPS עלהצלחת. </li></ol> 2. תא Encapsulation לאלגינט Hydrogel קפסולות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים על ידי אותו ההליך מתואר ב1.5 ו -1.6. בעקבות צנטריפוגה 160 × גרם במשך 3 דקות, לשטוף את התא גלולה iPS עם מי מלח HEPES שנאגר שלוש פעמים. לאחר מחדש השעיית התאים בתמיסת מלח HEPES שנאגר, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת 40 מיקרומטר תא כדי להסיר אגרגטים גדולים, שעלולים לסתום את החרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 מיליליטר של השעיה תא בתוך תמיסת מלח HEPES שנאגר ו 3 מיליליטר של 5% פתרון ALG-Na. לבסוף 5 מיליליטר של השעיה תא בתוך 3% פתרון ALG-Na מתקבל. צפיפות תאים היא desirably יותר מ 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף ההשעיה התא לתוך מזרק 5 מיליליטר, להתקין זרבובית שיתוף צירי (איור 1 א &#39;, ב&#39;) על המזרק ולהגדיר אותם על משאבת מזרק. זרימת גז 2 לפלוט N (נמוך מ1 ליטר / דקה) באמצעות המחט החיצונית של נחיר קואקס ולגרש את ההשעיה התא דרך הנחיר הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף טיפות לתוך 250 מיליליטר של 0.5% פתרון CaCl 2 ולהמתין 10 - 20 דקות לgelation תוך ערבוב ב60-90 סל&quot;ד. </li></ol> 3. טיפול באלגינט קפסולות (אופציונאלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כמוסות ALG-Ca ב0.05% (w / v) פתרון פולי-L ליזין (PLL) במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת הכמוסות עם מי מלח HEPES שנאגר, דגירתם בDMEM המכיל 10% FBS כדי לנטרל את המטען החשמלי על פני השטח שלהם. לנצל אותם ככמוסות מצופים (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הכמוסות במלח HEPES שנאגר המכיל 10 mM EDTA במשך 5 דקות. הכמוסות טופל EDTA מנוצלות ככמוסות חלולות (איור 1 ג). </li></ol> 4. תאי תרבות ואיסוף בקפסולות אלגינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במארז ב 75 סל&quot;ד עם רעד על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2במשך 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגירה הכמוסות ב 10 מ&quot;מ EDTA על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. איסוף תאים מכמוסות אלגינט ללא טיפול PLL על ידי צנטריפוגה בז × 1,000 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מטופלים כמוסות אלגינט עם PLL, לשבור את קרום ALG-PLL ידי pipetting למעלה ולמטה כעשר פעמים עם מחט מחוברת למזרק ו צנטריפוגות זה ב 1000 - 5000 × גרם במשך 5 דקות. קוטר מחט צריך להיות נמוך יותר מגודל כמוסה ו -25 G מחטים (260 מיקרומטר) משמשות בניסוי זה (600 מיקרומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לאסוף תא גלולה לחלוטין מקרומי ALG-PLL שבור אם אתה רוצה לאסוף דגימות ה- mRNA מהתאים. קרומי ALG-PLL נותרו אולי למנוע טיהור mRNA. </li></ol>

<ol><li>Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large scale production of stem cells and their derivatives.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).</li>
<li>Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+microcarrier+properties+affecting+the+expansion+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+Res%22%5BJournal%5D)">Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).</li>
<li>Schroeder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+lineage+selection+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+stirred+bench+scale+bioreactor+with+automated+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control.</a> Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).</li>
<li>Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agitation+can+induce+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+microcarrier+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%22%5BJournal%5D)">Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures.</a> Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+for+testing+controlled+%C3%9F-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments.</a> Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+morphology%2C+and+pluripotency+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+in+three+different+types+of+alginate+beads+for+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production.</a> Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).</li>
<li>Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vascular+endothelial+growth+factor+functionalized+agarose+to+guide+pluripotent+stem+cell+aggregates+toward+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Production+of+Embryoid+Bodies+in+Microbeads%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).</li>
<li>Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+Preparation+of+Monodispersed+Calcium+Alginate+Microbeads+in+a+Novel+Microfluidic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Technol%22%5BJournal%5D)">Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System.</a> Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).</li>
<li>Sakai, M. P., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Bioactive+Hydrogel+Capsules+for+The+3D+Expansion+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors.</a> Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+effects+of+secreted+soluble+factor+preserve+better+pluripotent+state+of+embry-+onic+stem+cell+culture+in+a+membrane-based+compartmentalized+micro-bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor.</a> Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alternative+fate+other+than+default+neuronal+fate+of+embryonic+stem+cells+in+a+membrane-based+two-chambered+micro-+bioreactor+by+cell-secreted+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> תרבות Encapsulation ניתן להשוות עם תרבויות השעיה ישירות. תרבות השעיה היא שיטה פשוטה כדי להשיג כמויות גדולות של תאי גזע pluripotent מאשר שיטות אנקפסולציה. עם זאת, השליטה הצבירה של תאים בתרבית השעיה היא עדיין מאתגרת. בשיטת אנקפסולציה, צבירה סלולרית מוגבלת בכמוסות וניתן לשלוט ולכן גם. פרסום קודם הראה כי תאי Encapsulated יצרו אגרגטים בגודל אחיד, ואילו גושי תאים גדולים הופיעו בתרבות חופשית השעיה 7. יתר על כן, דו&quot;ח קודם הוכיח כי תסיסה חזקה גורמת למוות תאי בתרבויות ...

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (תאי iPS) הם כיום מקור למחקר אינטנסיבי בשל תפקידם ברפואה רגנרטיבית. עם זאת, נדרשות כמויות עצומות של תאים להתחדשות רקמות. לדוגמה, כמיליארד תאי לבלב נדרשים לחולה סוכרת מסוג 11. עם זאת, תרבית צלחת קונבנציונלית מסוגלת להשיג רק 1 ×10 5 תאים/ס"מרבוע, ובכך דורשת 1 מ"ר של שטח תרבית כדי להשיג מספיק תאי לבלב שמקורם בתאי גזע לטיפול בחולה סוכרת מסוג 1. פיתוח מערכת לתרבית המונית של תאי גזע פלוריפוטנטיים, כגון מיקרו-נשא2 ותרבית תרחיף נדרש אפוא לרפואה רגנרטיבית. תרבית תרחיף מייצגת שיטה מבטיחה לתרבית המונית אך שליטה בצבירת תאים היא מאתגרת בתרביות השעיה ישירות של תאי iPS אנושיים3. ואכן, תאים תלויים חשופים למתח גזירה, הגורם לנזק לתאים3 או התמיינות4.
מחקר על אנקפסולציה מבוססת הידרוג'ל נערך כדי לפתור בעיות הקשורות לתרבית מתלה. בכמוסות הידרוג'ל, התאים מוגנים מפני זרימת המדיום. דיווחים קודמים תיעדו את השימוש בסוגים שונים של הידרוג'ל, כולל אגרוז5, PEG6 ואלגינט (Alg), לאנקפסולציה תאית. הידרוג'ל Alg-Ca הוא אחד ההידרוג'לים השימושיים ביותר לאנקפסולציה של תאים מכיוון שהידרוג'ל Alg-Ca נוצר מיד לאחר הטלת תמיסת אלגינט לתמיסת CaCl2 ומתעכל בקלות על ידי אנזימים או ריאגנטים כלאטיים. 
כאן, הקמנו תהליך אנקפסולציה יציב של אלגינט עבור תאי iPS באמצעות זרבובית קו-צירית. על ידי שימוש בזרימת גז N2 ליצירת טיפות, ניתן לעטוף תאים בכמוסות אחידות ללא צורך בריאגנטים אחרים כגון שמן. בשיטה זו, קצב הזרימה של N2 והריכוז של CaCl2 ושל אלגינט הם תנאי ההפעלה העיקריים המשפיעים על הגודל, הצורה והאחידות של הכמוסות. דוח זה מדגים את האופטימיזציה של תנאי הפעלה אלה באמצעות מצלמה מהירה ומיקרוסקופ.

<table><tbody><tr><td>פיברובלסטים של עובר עכבר</td><td>Cell Biolabs</td><td>SNL 76/7</td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי עכבר</td><td>RIKEN Bio מרכז ספיגה</td><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ES מוסמך&nbsp; FBS</td><td>GIBCO</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>אנטיבקטריאלי אנטיבקטריאלי</td><td>GIBCO</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>חומצת אמינו לא חיונית</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>GIBCO</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO לוקמיה גורם מעכב</td><td>Merck Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם/16 גרם מחט</td><td>Hoshiseido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>נתרן&nbsp; כלוריד</td><td>וואקו</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אלגינט</td><td>וואקו</td><td>194-09955</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>וואקו</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין (MW = 15,000 - 30,000)</td><td>SIGMA</td><td>P7890</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>DOJINDO</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>משאבת סילינג'</td><td>AS ONE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת Hispeed</td><td>nac טכנולוגיית תמונה</td><td>Memrecam HX-3</td><td></td></tr></tbody></table>

encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר co-הצירית

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

תאי גזע פלוריפוטנטיים (תאי PS) הם המוקד של מחקר אינטנסיבי בשל תפקידם ברפואה רגנרטיבית ובבדיקת תרופות. עם זאת, פיתוח מערכת תרבית המונית יידרש לשימוש בתאי PS ביישומים אלה. תרבית תרחיף היא שיטת תרבית מבטיחה לייצור המוני של תאי PS, אם כי כמה נושאים כמו שליטה בצבירה והגבלת מתח הגזירה ממדיום התרבות עדיין לא נפתרו. על מנת לפתור בעיות אלה, פיתחנו שיטה של אנקפסולציה של סידן אלגינט (Alg-Ca) באמצעות זרבובית קו-אקסיאלית. שיטה זו יכולה לשלוט בגודל הקפסולות בקלות על ידי הזרמה משותפת של גז N2. קוטר הקפסולה הניתן לשליטה חייב להיות גדול מ-500 מיקרומטר מכיוון שקצב זרימה גבוה מדי של גז N2 גורם לפירוק טיפות ובכך קפסולות בגודל הטרוגני. יתר על כן, ריכוז נמוך של Alg-Na ו-CaCl2 גורם לכמוסות לא כדוריות. למרות שקפסולה של Alg-Ca ללא ציפוי של Alg-PLL מתמוססת בקלות ומאפשרת איסוף תאים, הם יכולים גם לדלוף החוצה מכמוסות חסרות ציפוי Alg-PLL. ואכן, ציפוי אלגינט-PLL יכול למנוע דליפה תאית אך גם קשה לשבור אותו. ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו כדי לחקור את נישת תאי הגזע כמו גם את הייצור ההמוני של תאי PS מכיוון שאנקפסולציה יכולה לשנות את המיקרו-סביבה המקיפה את התאים, כולל המטריצה החוץ-תאית וריכוז הגורמים המופרשים.

בפרוטוקול 2.5, פתרון אלגינט גורש יוצר צורה כדורית מייד לאחר הגירוש (איור 2 א - ח). אם ההשעיה הוא גורש עם קצב זרימה N 2 נמוך יותר מאשר 1 ליטר / דקה, גודל הטיפות הוא אחיד (איור ט 2). עם זאת, אם את זרימת N 2 היא גבוהה יותר מאשר 1 ליטר / דקה, הטיפה מתפרקת (איור 2G, החציים לבן) ואת גודל הטיפות הופך הטרוגנית (איור י 2). לאור זאת, קשה להכין טיפות קטנות מ -500 מיקרומטר שימוש בשיטה זו. <p class="j...

הקמנו שיטה לעטיפת תאי גזע פלוריפוטנטיים (תאי PS) לכמוסות הידרוג'ל אלגינט באמצעות זרבובית קו-אקסיאלית. זה מונע מהתאים להצטבר יתר על המידה ומגביל את מתח הגזירה שחווים התאים בתרבית השעיה. הטכניקה ישימה לייצור המוני של תאי PS כמו גם למחקר על נישת תאי גזע.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להטמיע תאי גזע בתוך קפסולות הידרוג'ל של אלגינאט באופן בטוח ויעיל, ולגדל אותם בתוך הקפסולות כדי לשלוט על אגרגציה ועל הסביבה המיקרוסקופית. הדבר משיג על ידי ערבוב ראשוני של תרחיף תאי גזע מסונן עם תמיסת נתרן אלגינאט. לאחר מכן, התערובת מועברת למזרק ודיזית קואקסיאלית מותקנת על המזרק לפני הצבתו על משאבת מזרקים. בשלב הבא, הטיפות מוכנות על ידי דחיפת תרחיף התאים יחד עם זרימה נגדית של גז חנקן, ולאחר מכן נאספות לתוך תמיסת סידן כלוריד.לאחר מכן, הקפסולות מטופלות ב-poly L lysine כדי למנוע דליפת תאים וב-EDTA כדי להפוך את הקפסולות הפנימיות לנוזליות, לפני תרבית של התאים העטופים בתנאי ניעור סיבובי. לבסוף, התאים נאספים מהקפסולות באמצעות EDTA והרס פיזי של הממברנה. בסיכומו של דבר, עיטוף של תאי גזע פלוריפוטנטיים באלגינט מונע מהתאים להצטבר באופן מופרז ומגביל את מאמץ הגזירה שחווים התאים בתרבית סספנסיון.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגי והביו-רפואי, כגון הרחבה נרחבת של תאים להשתלה ומחקר על נישה של תאי גזע. התחילו את כליאת התאים על ידי איסוף התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, לאחר צנטריפוגה ב-160 times G למשך שלוש דקות. שטפו את משקע תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים (IPS) על ידי רסספנסיות, השעיה ב-Hanks buffered saline וצנטריפוגה שלוש פעמים לאחר רסספנסיות והשעיה של התאים ב-Hanks buffered saline.סננו את תרחיף התאים דרך מסנן תאים של 40 מיקרון כדי להסיר אגרגטים גדולים, שעלולים לסתום את הדיזה. לאחר מכן, ערבבו שני מיליליטר של תרחיף תאים מסונן ושלושה מיליליטר של תמיסת sodium alginate בריכוז 5%. כדי לקבל תרחיף תאים של חמישה מיליליטר ב-3% sodium alginate, צפיפות התאים צריכה להיות מעל מיליון תאים למיליליטר.לאחר איסוף תרחיף התאים למזרק של 5 milliliters, התקינו נחיר קואקסיאלי על המזרק והניחו אותם על משאבת מזרקים. הזרימו גז חנקן דרך המחט החיצונית של הנחיר הקואקסיאלי והשליכו את תרחיף התאים דרך הנחיר הפנימי. אספו את הטיפות לתוך 250 milliliters של תמיסת calcium chloride בריכוז 0.5%, והמתינו 10 עד 20 דקות להיווצרות הג'ל תוך כדי ערבוב במהירות של 60 עד 90 RPM. לאחר שטיפה עם HEPES-buffered saline, השתמשו בקפסולות שנאספו כקפסולות עירומות; כדי לטפל בקפסולות, הדגירו את קפסולות ה-calcium alginate בתמיסה בריכוז 0.05% weight per volume.תמיסת Poly L lysine למשך חמש דקות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide תוך써 ניעור. לאחר איסוף הקפסולות לשפחור ושטיפה ב-HEPES buffered saline, דגרו אותן ב-DMEM המכיל 10% FBS. כדי לנטרל את המטען החשמלי על פני השטח שלהן, השתמשו בקפסולות שהתקבלו כקפסולות מצופות כדי לייצר קפסולות חלוליות.דגרו את הקפסולות בתמיסת סליין (HEPES buffered saline) המכילה 10 millimolar EDTA למשך חמש דקות. הקפסולות שעובדו ב-EDTA משמשות כקפסולות חלולות. דגרו את התאים העטופים במהירות של 75 RPM עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 10 ימים; לאחר הדגירה, אספו ודגרו את הקפסולות ב-10 millimolar EDTA בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 10 דקות.אסוף את התאים מקפסולות האלגינאט ללא טיפול ב-poly L lysine באמצעות סנטריפוגציה ב-1000 $\times$g למשך שלוש דקות. אם קפסולות האלגינאט טופלו ב-poly L lysine, שבור את ממбраנת האלגינאט וה-poly L lysine באמצעות פיפטינג מעלה ומטה כ-10 פעמים עם מחט המחוברת למזרק. קוטר המחט צריך להיות קטן מגודל הקפסולה; בניסוי זה נעשה שימוש במחטים במידה של 25 gauge.לאחר סנטריפוגציה ב-1000 עד 5,000 פעמים G למשך חמש דקות, אספו את משקע התאים אך ורק מממברנות אלגינט פולי-L-ליזין שבורות. אם נדגמי mRNA נאספים מתאים, שימו לב כי שאריות של ממברנות אלגינט פולי-L-ליזין עלולות למנוע את טיהור ה-mRNA, כפי שניכר בצילום במצלמה במהירות גבוהה. תמיסת האלגינט המגולש מקבלת צורה כדורית מיד לאחר הגלוש. אם התסמין מגולש בקצב זרימה של חנקן הנמוך מליטר אחד לדקה, גודל הטפטופים יהיה אחיד.עם זאת, אם זרימת החנקן גבוהה מליטר אחד לדקה, הטיפה מתפרקת וגודל הטיפות הופך להטרוגני. נוכח זאת, קשה להכין טיפות הקטנות מ-500 מיקרון בשיטה זו. בתהליך הג'לציה, טיפות של נתרן אלגינאט יוצרות קפסולות של סידן אלגינאט בצורה כדורית בתמיסת סידן כלוריד.עם זאת, אם ריכוז נתרק אלגינאט גבוה מספיק, ריכוז נמוך של נתרק אלגינאט גורם לקפסולות בעלות צורה שאינה כדורית ולא אחידה, דבר המהווה בעיה בתהליך הקידוד. גם אם ריכוז נתרק אלגינאט אינו מספיק, ניתן ליצור קפסולות כדוריות על ידי העלאת ריכוז הסידן. עם זאת, ריכוז של כ-50 millimolar של סידן כלורי הוא המתאים להכפסה, כיוון שריכוז גבוה מדי של סידן כלורי מפחית את הצמיחה והחיוניות התאית.תאים עטופים יכולים לצמוח בתוך הקפסולות, אך עלולה להתרחש דליפה תאית בקפסולות ללא הציפוי של alginate poly L lysine. במקרה של תאי IPS של עכבר, התאים יוצרים אגרגטים בצורת דיסק בכל קפסולת calcium alginate, בעוד שבקפסולות חלולות התאים נצמדים זה לזה ויוצרים אגרגטים כדוריים בודדים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לעטוף ולתרבת תאים תוך בקרת גודל.לכידת מימן ללא ציוד מיוחד, ללא סופח אורגני.

alginate-encapsulation-pluripotent-stem-cells-using-co-axial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

יש לנו אופטימיזציה טכניקה מיקרואנקפסולציה כפלטפורמה 3D יעיל להפצת והבחנה בתאי גזע עובריים כדי האנדודרם ואת דופאמין (DA) נוירונים. הוא גם מספק הזדמנות בידוד החיסונית של תאים המארח במהלך ההשתלה. פלטפורמה זו ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

שילוב הדור monodisperse טיפה עם סידור אינרציה של תאים וחלקיקים, אנו מתארים שיטה כדי לתמצת המספר הרצוי של תאים או חלקיקים בטיפה אחת בשיעורים kHz. אנחנו מדגימים את יעילות פעמיים העולה על אלו של אנקפסולציה לא מסודרת עבור טיפות יחיד ו פעמיים החלקיקים.

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאנקפסולציה של תאים קטבוליים, הצורכים שומנים לייצור חום ברקמת השומן התוך-בטנית ומגבירים את פיזור האנרגיה בעכברים שמנים.

Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית הדפסה ביולוגית באמצעות מערכת הפקדה רובוטית אוטומטית המשלבת רמזי הנחיה טופוגרפיים חרוטים עם תצהיר מדויק של תא הנושא דיו הידרוג'ל. התאים המודפסים מועברים ישירות לתכונות החרוטות ומסוגלים לחוש ולהתמצא איתם.

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

זה וידאו כתב היד לתאר שיטה המבוססת על תחליב לתמצת תאים יונקים 0.5% עד 10% חרוזים alginate אשר ניתן לייצר בקבוצות גדולות באמצעות כלי זעיר זעיר. תאים המארז יכול להיות מתורבת במבחנה או המושתלים עבור יישומים טיפול סלולרי.

אנקפסולציה תא יונקים ב Alginate חרוזים באמצעות כלי פשוט מתערבל

מוצג כאן הוא פשוט לשימוש, ליבה/פגז, תלת מימדי ביוריטינג הגדרת עבור הייצור צעד אחד של הפיגומים החלול, מתאים הנדסת רקמות של כלי דם ומבנים צינורי אחרים.

ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי

אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

מאמר זה מתאר אנקפסולציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות התקן מיקוד זרימה צירית משותפת. אנו מראים שטכנולוגיית אנקפסולציה מיקרופלואידית זו מאפשרת היווצרות יעילה של כדוריות hPSC.

ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה לייצור ספרואידים רקמתיים בקנה מידה גדול וחסכוניים באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד.

יצירת כדורי רקמות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד

עבודה זו מתארת פרוטוקול להדפסה תלת-ממדית משובצת בצורה חופשית של תאי גזע עצביים בתוך חומרים מרוכבים של חלקיקים חוץ-תאיים הניתנים לריפוי עצמי. הפרוטוקול מאפשר דפוסים ניתנים לתכנות של מבנים מחוברים של רקמות עצביות אנושיות עם נאמנות גבוהה.

תמיכה מרוכבת במטריצה חוץ-תאית מיקרוג'ל להדפסה תלת-ממדית משובצת של מבנים עצביים אנושיים

למדו שיטת אנקפסולציה של תאי גזע pluripotent באלגינט באמצעות נחיר קואקסיאלי. טכניקה זו מפחיתה מאגדגציה ומגן על התאים מלחץ גזירה בתרבית תלויה, ומאפשרת ייצור המוני ומחקר על נישות תאי גזע.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

גלה סרטונים נוספים