Name: מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: למד מעקב זמני של תאים בשלב S באמצעות BrdU וצביעת DNA בזרימה ציטומטריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של גורל התאים המחלקים במחקר ביולוגי תאי ונוירולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה מומנה על ידי אגודת הלוקמיה והלימפומה של ארה"ב (6105-08), מענק של מועצת הסרטן של NSW (13-02), מלגת מחקר בכירה של NHMRC (LJB) (1042305) ומענק פרויקט (1041614).

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בקו תא לוקמיה לימפובלסטית החריף NALM6 אבל יכול להיות מיושם על סוגי תאים אחרים. 1. פתרונות וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 56 מיליליטר סרום עגל עוברי (FCS) ו -5.5 מיליליטר של 200 מ&quot;מ L- גלוטמין לבקבוק 500 מיליליטר של מדיום RPMI-1640. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BrdU פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 32.5 מ&quot;מ BrdU (10 מ&quot;ג / מיליליטר) בבופר פוספט של Dulbecco (DPBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI המלא BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 6.2 μl של פתרון מניות BrdU 10 מיליליטר של RPMI השלם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון DNase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DNase 1 מ&quot;ג / מיליליטר בDPBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3% FCS מומת חום ושל 0.09% אזיד הנתרן בDPBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בחומרי רשימה להגדרות של קיבוע מאגר, permeabilization הצפת והצפה לשטוף. </li></ol> 2. תאים לאטה: תאים לא היו בתרבית ליותר מ -6 חודשים. שיטה זו היא באופן ישיר וישימה לכל שורת תאים שאינם חסיד עם התאמות לצפיפות תאים ותקשורת ותרבות. להשתמש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי בייזום של הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי NALM6 בצלוחיות תרבות T-75 בRPMI השלם. לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים באמצעות Class II בטיחות ביולוגית קבינט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי NALM6 בין 1-2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר ידי פיצול התרבות שלוש פעמים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר. </li></ol></li></ol> 3. תיוג דופק של תאים עם BrdU זהירות: ידית BrdU בזהירות כפי שהוא mutagen וטךטוגן פוטנציאליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות. שים לב: העברת תאים לתקשורת טריות משפרת את שחזור של התוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים ותאים גלולים בRPMI המלא ב 2 x 10 6 ג/ אמות מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאים 1 ב 2 עם RPMI השלם BrdU ייצור ריכוז תא סופי של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 45 דקות, ואז לדלל תאים 1 ב 10 עם RPMI השלם. תאי צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות ובזהירות להשליך את כל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים בנפח קטן (~ 100 μl) של RPMI השלם, לבצע ספירת תאים ולהתאים ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מיליליטר של תאים לתוך הבארות של צלחת גם 48. מיליליטר פיפטה 1 של DPBS לתוך כל בארות פנויות כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר לנקודות זמן רצוי, כאן 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, ו -24 שעות. הערה: משך הזמן יהיה תלוי במה העיצוב הניסיוני שמטרתו למדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל התאים לתוך צינורות FACS באמצעות פיפטה. יש לשטוף את הרצף גם עם 1 מיליליטר voluMES של PBS להיקף כולל סופי של 5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות ולהסיר את כל supernatant בזהירות. תאים מוכנים לצביעה, לבצע את זה (סעיף 4) באופן מיידי. </li></ol> מכתים 4. סלולארי הערה: אם נדרש צביעת תאי שטח לבצע אותו לפני הקיבוע, על מנת להבטיח כי התאים נשמרים על 4 מעלות צלזיוס לאורך כל דרך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים במאגר של הכתמת 100 μl (מכתים משטח אופציונאלי, להוסיף הנפח המומלץ של נוגדן על פני השטח אנטיגנים דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ מכתים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG וזורקים supernatant. הערה: נוגדן ספציפי, ריכוז, זמן דגירה וכו &#39;ישתנה בהתאם למטרות ניסוי ספציפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבעון וpermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים במאגר של קיבעון 100 μl ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר oחיץ F לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים במאגר של permeabilization 100 μl דגירה התאים במשך 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים במאגר של קיבוע לכל צינור 100 μl ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG, וזורקים supernatant. הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן אם נדרש. התאים הקבועים יציבים במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס אם resuspended במאגר מכתים. הסר את החיץ מכתים הבא צנטריפוגה לפני שימשיך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend בפתרון DNase 100 μl (30 מיקרוגרם של DNase / 10 6 תאים) ותאי דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות ב XG 150 במשך 5 דקות וזורקי supernatant. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן מכתים הערה: מכתים עבור סמנים תאיים אחרים מאשר BrdU ניתן לבצע בו זמנית עם מכתים BrdU. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב: הכן בקרות פיצוי בהיקף של תאים בלא כתם ותאים שכותרתו עם כל fluorochrome יחיד. באופן אידיאלי, להשתמש באותו נוגדנים עבור פקדי פיצויים אלו המשמשים בצינורות הניסיוניים. עם זאת, אם זה לא ריאלי, נוגדני תחליף לאנטיגנים הביעו מאוד מצומדות לאותו fluorochrome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 50 μl של חיץ לשטוף ולהוסיף μl 1/10 6 תאים של נוגדן BrdU. הערה: ניתן גם להוסיף נוגדנים מצומדות ישירות לאנטיגנים ספציפיים תאיים אחרים. הערה:. נוגדנים להיסטון H3 phosphorylated על Ser10 יכולים לשמש כדי להבחין בין התאים בG2 וM, היסטון H3 הוא phosphorylated בSer10 במהלך מיטוזה 10 נוגדנים לcdc2 phosphorylated על Tyr15 יכול לשמש כדי לזהות תאים שhavדואר מחויב למיטוזה. 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, תאי צנטריפוגות ב XG 150 במשך 5 דקות וזורקי supernatant. </li></ol></li></ol><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה- DNA כתם לניתוח תא מחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר גלולה ולהוסיף 20 μl של פתרון 7-AAD (0.25 מיקרוגרם). הערה: זה קריטי כדי להשתמש בכמות קבועה של 7-AAD / תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ מכתים. </li></ol></li></ol> 5. אוסף של cytometry זרימת נתונים הערה: המכונה הנדרשת יהיו תלוי במספר והאופי של fluorochromes בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הפרמטרים הבאים: FSC-, SSC-, FSC-H (FSC-W יכול לשמש במקום FSC-H) וקרינה 7-AAD בקנה מידה ליניארי. לאסוף את ערוץ APC בקנה מידת יומן. לאסוף כל ערוצים נוספים הנדרשים להערכת תוויות משטח או פנימי באמצעות סולם יומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע compensation של חופף אותות בספקטרום פליטה נצפה בין fluorochromes שונה לפני ניתוח הדגימות. הערה: רוב הזרימה cytometers יבצע זאת באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה. </li></ol> 6. ניתוח cytometry זרימת נתונים הערה: FlowJo שימש במחקר זה לזרימה גם cytometry יכול לשמש לניתוח נתונים, אך חבילות תוכנה אחרות. אסטרטגית gating מודגמת באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אוכלוסיית תאי קיימא באמצעות פרמטרים FSC-וSSC-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך אוכלוסייה זו לא לכלול כפילויות ואגרגטים באמצעות FSC-וFSC-H (FSC-W יכול לשמש גם כאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך אוכלוסייה זו נקבעה עלילת נקודה באמצעות 7-AAD על ציר x וBrdU-APC על ציר y. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1: gating אסטרטגיה שמאל הרשות הפלסטינית.Nel: תאי ungated מוצגים בFCS-מול SSC-עלילת נקודה. אוכלוסיית תאי קיימא מזוהה על ידי השער שמוצג. פנל מרכז: תאים מגודר מהלוח השמאלי מוצגים בFSC-מול עלילת נקודת FSC-H (FSC-W יכול לשמש במקום גובה). כפילויות ואגרגטים מזוהות, ולא נכללו בשער שמוצג. פנל ימני: תאים מגודר ממועד הרחקת כפיל בלוח המרכז מוצגים על 7-AAD לעומת APC-עלילת נקודה. נוגדן BrdU מסומן עם APC מאפשר זיהוי של תאים ששולבו במהלך BrdU תיוג הדופק. 7-AAD מספק מידע על תוכן DNA. השער העליון מגדיר תאים חיוביים לBrdU ולכן בשלב S בזמן דופק BrdU, השער השמאלי התחתון, התאים בG 0/1 והשער הימני התחתון אלה בG 2 / M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מחזור<html> nalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ הראשון נתונים ושער על התאים בשער הדרת כפיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח אוכלוסייה זו להפצת מחזור התא (הממוקמת תחת פלטפורמות בתוכנה פלה-ג&#39;ו) ולהשתמש במודל הדיקן-ג&#39;ט-פוקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את העמדות של G 0/1 וG 2 / M פסגות באמצעות ליצור שערים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער בנושא תאים וחיוביים BrdU אוכלוסייה זו לאותו ניתוח מחזור התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק המשרות לG 0/1 וG 2 / M פסגות על ידי יישום אותו השערים משערים ליצור וקביעת מגבלות (באמצעות השערים שנוצרו) לעמדות של G 0/1 וG 2 / M פסגות. זו באה לידי ביטוי בלוחות 2 הראשונים של איור 2. הערה: גם תוכנות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את הנתונים וההוראות היו להשתנות בהתאם. </li></ol></li></ol>840 / &quot;width =&quot; 700 52840fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2:. התקדמות פנל תא המחזור הראשון (כל התאים) הוא מגודר באוכלוסיית התא שהוגדרה על ידי שער הדרת כפיל. אוכלוסייה זו הוצגה בהיסטוגרמה עם 7-AAD על ציר ה- X. השיא של שיא G 0/1 מצויינים על ידי החץ מתחת לציר. בלוחות הבאים תאים חיוביים BrdU כבר מגודר בכפי שמוצגים באיור 1. הערך לתפקיד 0/1 G מתקבל כאשר gating של שער הדרת כפיל מוחל על התאים מגודרות החיוביים BrdU בתוך תוכנת מחזור תא FlowJo. כל פנל שלאחר מכן היה מגודר באוכלוסייה החיובית BrdU כפי שמוצג באיור 1 ואת עמדתו של שיא 0/1 G מבוסס על הערך שהושג בניתוח האוכלוסייה כולה, כפי שמוצג בשני הלוחות הראשונים. שימוש בחלק השלילי BrdU לזהות את המיקום של אוכלוסיית G 0/1 לתאים החיוביים BrdU באותו SAMPle שולט על כל הבדלים קלים בעוצמה של כתם DNA בין דגימות. המספר המוצג בכל פנל מייצג את הזמן מאז דופק BrdU הסתיים. שלבי מחזור התא המחושבים מוצגים בירוק מוצלת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanfalvi%2C+G+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Harper, J. W., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+ten+years+after%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: ten years after.</a> Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).</li>
<li>Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+bromodeoxyuridine-substituted+cells+stained+with+33258+Hoechst%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218, 474-475 (1982).</li>
<li>Carayon, P., Bord, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-replicating+lymphocyte+subsets+using+a+new+method+to+label+the+bromo-deoxyuridine+incorporated+into+the+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA.</a> Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).</li>
<li>Gonchoroff, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase+detection+with+an+antibody+to+bromodeoxyuridine.+Role+of+DNase+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment.</a> Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+cell+cycle+analysis+and+two-color+surface+immunofluorescence+using+7-amino-actinomycin+D+and+single+laser+excitation%3A+applications+to+study+of+cell+activation+and+the+cell+cycle+of+murine+Ly-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).</li>
<li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD001+%28everolimus%29+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).</li>
<li>Hendzel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106, 348-360 (1997).</li>
<li>Draetta, G., Beach, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cdc2+protein+kinase+during+mitosis+in+human+cells%3A+cell+cycle-dependent+phosphorylation+and+subunit+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement.</a> Cell. 54, 17-26 (1988).</li>
<li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD001+%28everolimus%29+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microassay+for+lymphotoxin+using+microculture+plates+and+the+multiple+automated+sample+harvester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester.</a> Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).</li>
<li>Beck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+kinetics+of+perturbed+cell+populations+determined+by+the+bromodeoxyuridine-33258+technique%3A+radiotoxic+effects+of+incorporated+%5B3H%5Dthymidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine.</a> Cytometry. 2, 170-174 (1981).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+rates+of+DNA+synthesis+during+the+S+phase+of+log+phase+HeLa+S3%2C+WI-38%2C+and+2RA+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).</li>
<li>Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+growth+fraction+in+cell+suspensions+by+flow+cytometry+using+the+monoclonal+antibody+Ki-67%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67.</a> Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).</li>
<li>Danova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-related+proteins%3A+a+flow+cytofluorometric+study+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors.</a> Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).</li>
<li>Juan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+phosphorylation+and+expression+of+cyclins+A+and+B1+measured+in+individual+cells+during+their+progression+through+G2+and+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis.</a> Cytometry. 32, 71-77 (1998).</li>
<li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).</li>
<li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+porcine+fetal+fibroblasts%3A+effects+of+serum+deprivation+and+reversible+cell+cycle+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors.</a> Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).</li>
<li>Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+nuclear+and+cytoplasmic+cell+cycle+progression+by+drugs+employed+in+cell+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization.</a> Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היכולת לנתח את מחזור התא היא חשובה להבנת ביולוגיה של סרטן ואת מנגנון פעולה של שתי התרופות וגנים המשפיעים על שגשוג תאים וצמיחה. אמנם יש מספר רב של מבחני שדיווחים למדוד התפשטות תאים, רוב לספק מידה המציינת את מספר התאים בהווה בלבד. אלה כוללים מבחני המודדים תא מספר על ידי הדמיה ישירה וספירה, פעילות המטבולית או ריכוז ה- ATP. היתרון העיקרי של רבים מהשיטות האלה הוא שהם קלים יחסית לביצוע ונוחים לפורמטים microplate ואוטומציה, שהופכים אותם שימושיים לסינון כמויות גדולות של תנאים או תרכובות. ...

ההערכה של תכונות מחזור תא ושינויים המתרחשים בתאים במהלך התקדמות מחזור התא היא יסוד להבנת היבטים רבים של ביולוגיה, במיוחד ביולוגיה של הסרטן. יש סוכנים רבים בפיתוח לטיפול בגידולים ממאירים השפעות עמוקות על התקדמות מחזור תא או לגרום למוות של תאים באמצעות תלויים-מנגנוני מחזור התא. כדי ללמוד דינמיקת מחזור תא או תאים בשלב מסוים של מחזור התא, זה רגיל לסנכרן תאים. עם זאת שיטות סנכרון יכולות להיות השפעה מזיקה על התאים הנלמדים, שעלול להיות בלבול התוצאות שהתקבלו. 1 ניתוח לאחרונה את השימוש בחלבונים מתויגים fluorescently שנמצאים רק בשלבים מסוימים של מחזור התאים התיר להתקדמות מחזור התא בתאים בודדים לאורך זמן 2, לעומת זאת תאים להיחקר צורך לטפל גנטי כדי לבטא חלבונים מתויגים אלה, להגביל את השימוש שלהם למערכות שבן ניתן לקרוא את זההשיג ily. מחזור התא מורכב משני שלבים פעילים: שלב הסינתזה (S), שבו ה- DNA משוכפל ומיטוזה חלוקת תא שבו (M) מתקיימת. שלבים אלה מופרדים על ידי שלושה שלבי פער, G 0, 1 G ו- G 2. G 0 או קפאון, הוא שלב מנוחה שבו התא עזב את המחזור, 1 G הוא שבו תאי גידול בגודל לפני שכפול ה- DNA וG 2 שבו צמיחת תאים ממשיך בין השלמת שכפול הדנ&quot;א אבל לפני חלוקת תא. ההתקדמות דרך מחזור התא נשלטת על ידי מספר המחסומים. מחסום 1 G מופעל כאשר תנאי סביבה אינם תומכים של סינתזת DNA ומונעים כניסה לשלב S. מחסום שלב התוך-S או העיכוב יכול להיות מופעל על ידי נזק לדנ&quot;א שעלולה לגרום למזלגות שכפול נתקע. במהלך G 2 הנאמנות של ה- DNA המשוכפל הוא אישרה ואם הנזק הוא זוהה לאחר מכן G 2 </תת&gt; מחסום מופעל מתיר תיקון DNA לפני חלוקת התא. מחסום אחרון במיטוזה מבטיח כי chromatids כבר מיושר כהלכה בצלחת mitotic כך שחלוקת התא יכולה להסתיים בהצלחה. 3 הפעלה של מחסומים אלה משמשת בדרך כלל כדי לסנכרן אוכלוסיות תאים. יכולים להיות מופעלים על מחסומי מחזור תא על ידי מספר הגורמים, אך בביולוגיה של הסרטן הנפוץ ביותר היא גילוי של נזק לדנ&quot;א. תגובת הנזק ל- DNA היא ביוזמת telangiectasia כמו-PI3-kinase אטקסיה קינאזות וRad3 קשור (ATR) וtelangiectasia אטקסיה מוטציה (כספומט) המפעיל את קינאזות מפעיל במורד הזרם Chk1 וChk2, בהתאמה. 3 מגוון של אירועים מפעיל Chk1 לרבות נתקע מזלגות שכפול, crosslinks DNA, ונזקי קרינת האולטרה סגולות ואילו Chk2 מופעל בעיקר על ידי הפסקות גדיל פעמיים. השיטה הרגילה ללימוד ההשפעה של תנאים שהשתנו באורך של i מחזור התאים כדי לסנכרן את התאים בשלב מסוים של מחזור התא. 1 זה יכול להיות מושגים באמצעות מספר שיטות. תאים יכולים להיות פיזי מפרידים על בסיס גודל, צפיפות, פיזור צד (גרעיניות), וסמני ביטוי פני תא. יותר כמעט, תאים עשויים להיות מסונכרנים באמצעים כימיים. כמה סוכנים כגון תימידין, hydroxyurea וarabinoside ציטוזין יכולים לשמש כדי לעכב סינתזת DNA בשלב S של מחזור התא וכתוצאה מכך הצטברות של תאים בשלב S שימשיכו רכיבה על אופניים לאחר הסוכנים יוסרו. תאים שטופלו nocodazole, אשר מונע היווצרות של ציר mitotic, מעצר עם G 2 - תוכן DNA או M-שלב. ביעור סרום מהתוצאות בינוני התרבות בהצטברות של תאים בשלב G 0. מחדש התוספת של החומרים המזינים בסרום התרבות מחדש מתחילה רכיבה על אופניים הרגילים של התאים. עם זאת, כל שיטות סנכרון אלה מפריעים לרכיבה על אופניים וצמיחה נורמלים של תאים ויכולים Resulלא במוות של תאים משמעותיים. הסנכרון של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפים הוא מאתגר במיוחד ותאים אלה אינם ניתנים למניפולציה גנטית. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה של דינמיקת מחזור התא והמחקר של תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא ללא סנכרון מסורתי או שינוי גנטי. שיטה זו עשויה להיות שימושית גם עבור סוגי תאים אחרים שבם הנדסה גנטית ונהלי סנכרון מסורתיים אינן מושגות בקלות. השיטה מבוססת על השימוש הוותיק של bromodeoxyuridine התאגדות (BrdU), שבו יש השפעה קטנה מאוד על הצמיחה בטווח הקצר והתפשטות של תאים. 4 פרוטוקולי BrdU הוקם לנצל את השילוב של BrdU לתוך ה- DNA מסונתז חדש בשלב S . זה באופן קבוע מסמן תאים כמי שהיה בשלב S במהלך חשיפת BrdU. אוכלוסייה זו ניתן לזהות בנקודות זמן מאוחר יותר על ידי הצביעה לincorpor BrdUני ובכך לפעול כאוכלוסייה מסונכרנת שניתן בעקבות והעריך לאורך הזמן מאפשר המחקר של שפעות תרופה על מעבר מחזור התא. BrdU צריך להיות חשוף לפני מכתים נוגדן, בדרך כלל מושגת הבאה DNase או טיפול בחומצה. 6,7 באמצעות cytometry זרימה לזהות BrdU המשולב מאפשר ההכללה של סמנים נוספים. החשוב ביותר הוא השימוש בצבעים למדוד תוכן DNA, המאפשר ההערכה של הפצת שלב מחזור התא של התאים שהיו בשלב S בתחילת המחקר. יכולים להיות גם למדו 8 אנטיגנים משטח או תאיים יתר נוסף. 9 אלה עשוי להתייחס לאירועי מחזור התא כגון Ki67 או תכונות תא שאינה קשורה לכאורה כגון סמני אפופטוזיס כמו caspase-3 ביקע. היישומים הפוטנציאליים מוגבלים על ידי הדמיון של החוקר.

<table><tbody><tr><td>ערכת זרימה של APC BrdU</td> BD <td>Biosciences</td><td>552598</td><td>מכילה נוגדן BrdU, מאגר 7-AAD ו-BD Cytofix/Cytoperm (המכונה מאגר קיבוע)</td></tr><tr><td>מאגר חדירות BD Cytoperm בתוספת</td><td>BD Biosciences</td><td>561651</td><td>המכונה מאגר פרמביליזציה</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td> BD <td>Biosciences</td><td>554723</td><td>המכונה מאגר כביסה</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D-4513</td><td></td></tr><tr><td>BD פלקון 12 x 75&nbsp; מ"מ צינורות FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen מאגר כתמים</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR FORTESSA זרימה ציטומטר</td><td>BD Biosciences</td><td>FORTESSA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>P2, P20, P100, P1000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 מ"ל</td><td>לונזה</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>FisherBiotec</td><td>FBS-7100113</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Sigma</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-דאוקסיורידין</td><td>סיגמא</td><td>B5002-1G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC 150&nbsp; ס"מ2 צלוחיות מאווררות</td><td>BD Biosciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות 25&nbsp; מ"ל</td><td>גריינר</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות ארסול 200&nbsp; ומיקרו; l</td><td>Interpath</td><td>24700</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 1&nbsp; ml</td><td>Interpath</td><td>24800</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ספינטרון</td><td>GT-175R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור</td><td>קלסר</td><td>C 150</td><td></td></tr><tr><td>AF488 אנטי-היסטון H3 פוספו (Ser10) איתות</td><td>תאי</td> נוגדן <td>9708S</td><td></td></tr><tr><td>פוספו-Chk2 (Thr68) (C13C1) איתות תאי mAb ארנב</td><td></td><td>2197S</td><td></td></tr><tr><td>פוספו-Chk1 (Ser345) ( 133D3)</td><td>איתות תאי</td> mAb ארנב <td>2348S</td><td></td></tr><tr><td>NALM6&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-128</td><td></td></tr></tbody></table>

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

פרוטוקול זה מתאר שיטה המאפשרת מעקב אחר תאים לאורך מחזור התא מבלי לדרוש סנכרון של התאים. השגת סנכרון תאים יכולה להיות קשה עבור מערכות תאים רבות. הנוהג המקובל הוא לחסום את התקדמות מחזור התא בשלב מסוים ולאחר מכן לשחרר את התאים המצטברים המייצרים גל של תאים המתקדמים במחזור ביחד. עם זאת, סוגי תאים מסוימים מוצאים את החסימה הזו רעילה וכתוצאה מכך מחזור תאים לא תקין, או אפילו מוות המוני. ניתן להשתמש בספיגת ברומודוקסיורידין (BrdU) כדי לעקוב אחר שלב מחזור התא של תאים בודדים. תאים משלבים אנלוגי תימידין סינתטי זה, תוך סינתזה של DNA חדש בשלב S. על ידי מתן BrdU לתקופה קצרה אפשר לסמן מאגר של תאים שהיו בשלב S בזמן שה-BrdU היה נוכח. לאחר מכן ניתן לעקוב אחר תאים אלה לאורך שארית מחזור התא ולתוך סבב השכפול הבא, מה שמאפשר לקבוע את משך שלבי מחזור התא ללא צורך לגרום לחסימת מחזור תא שעלולה להיות רעילה. ניתן גם לקבוע ולתאם את הביטוי של חלבונים פנימיים וחיצוניים כאחד בשלבים הבאים של מחזור התא. ניתן להשתמש בהם כדי לחדד עוד יותר את הקצאת שלב מחזור התא או להעריך את ההשפעות על תפקודים תאיים אחרים כגון הפעלת מחסום או מוות תאי.

מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי להשיג מגוון רחב של מידע. כמה יישומים המפורטות כאן. הערכה של משך מחזור התא כדי לקבוע את הזמן דרוש לתאים למעבר דרך מחזור התא, תאים נקצרים בנקודות זמן שונות הבאות דופק BrdU. המרווחים בין הערכות יכולים להיות מותאמים לתאים מסוימים להיות מנותח. שורות תאי hematopoietic הוערכו בכל שעה במשך 24 שעות בהיעדר טיפול תרופתי כדי לקב...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

temporal-tracking-cell-cycle-progression-using-flow-cytometry-without

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ"א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

אנו מדווחים על שני פרוטוקולים של סינכרון תאים המספקים הקשר ללימוד אירועים הקשורים לשלבים ספציפיים של מחזור התא. אנו מראים כי גישה זו שימושית לניתוח הרגולציה של גנים ספציפיים במחזור תאים לא מופרע או בחשיפה לסוכנים המשפיעים על מחזור התא.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשר לנו לעקוב אחר תרביות תאים ישירות בתוך החממה. כאן נתאר את פרוטוקול מלא נהגה לרכוש וניתוח של 2.7 היום רכישת בתרבית תאים הלה, שמוביל dataset של 2.2 x 10 שירים6 מדידות של תא בודד ומורפולוגיה 10584 מחזור התא.

ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

מוצגת כאן טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה המאפשרת למדוד בו זמנית את מספר חלוקות התא, פנוטיפ תאי פני השטח וקרבה תאית. ניתן לבדוק תכונות אלה באופן סטטיסטי באמצעות מסגרת מבוססת תמורות.

הערכה סימולטנית של קרבה, מספר חלוקה ופנוטיפ באמצעות ציטומטריית זרימה עבור תאי גזע המטופויטיים ותאי אב

אחד האתגרים בניתוח ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן הוא שהניסויים נבדלים לעתים קרובות זה מזה במשך ההתאוששות מסנכרון ובתקופת מחזור התא. לפיכך, המדידות מניסויים שונים אינן ניתנות לניתוח מצטבר או להשוואה בקלות. במאמר זה אנו מתארים שיטה ליישור ניסויים כדי לאפשר השוואות ספציפיות לפאזה.

יישור נתוני סדרות זמן מסונכרנות באמצעות מודל אפיון אובדן מחזור התא לצורך השוואות בין ניסויים

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ"א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

למד מעקב זמני של תאים בשלב S באמצעות BrdU וצביעת DNA בזרימה ציטומטריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של גורל התאים המחלקים במחקר ביולוגי תאי ונוירולוגי.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

גלה סרטונים נוספים